Bacterias promotoras de crecimiento de plantas autóctonas y su efecto en Prosopis chilensis (Molina) Stunz*

Native plant growth promoting bacteria and their effect on Prosopis chilensis (Molina) Stunz

Jorge Arnoldo Villegas-Espinoza¹, Edgar Omar Rueda-Puente², Bernardo Murillo-Amador³, María Esther Puente³, Francisco Higinio Ruiz-Espinoza¹, Sergio Zamora-Salgado¹ y Félix Alfredo Beltran Morales^1§

¹ Departamento Académico de Agronomía-Universidad Autónoma de Baja California Sur. Carretera al sur km 5.5, A. P. 19-B, C. P. 23080. La Paz, Baja California Sur, México. Tel. (612) 123 88 00. Ext. 5518, 5507, 5110 y 5509. (jvillegas@uabcs.mx; fruiz@uabcs.mx; szamora@uabcs.mx). ^§Autor de para correspondencia: abeltran@uabcs.mx.

³ Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C. Mar Bermejo Núm. 195, Col. Playa Palo Santa Rita, La Paz, Baja California Sur. A. P. 23090. Tel. (612) 123 84 84. Ext. 3440 y 3354. (bmurillo04@cibnor.mx; epuente04@cibnor.mx).

* Recibido: enero de 2014
Aceptado: junio de 2014

Resumen

En la actualidad se está deforestando en México la especie de Prosopis spp. para utilizarse como leña y carbón, en diferentes zonas áridas de nuestro país. Para su producción se utiliza fertilizante sintético, con ello hay un incremento de salinidad del suelo, subsuelo y mantos acuíferos. La presente investigación se realizó en Santa Ana, Sonora, México en 2006. Se aislaron y purificaron microorganismos asociados al sistema radicular de Prosopis glandulosa que se desarrolla en cráteres de la zona volcánica de la reserva de la biosfera El Pinacate y Gran Desierto de Altar Sonora. Las bacterias promotoras de crecimiento de plantas presentan la peculiaridad de fijar el nitrógeno atmosférico; se midió el efecto de las cepas aisladas en germinación y en el desarrollo en plántulas de P. chilensis. Fueron aisladas 19 colonias; de ellas, solamente una colonia bacteriana mostró alta actividad de reducción de acetileno y capacidad de solubilizar fosfatos, se identificó como Bacillus amyloliquefaciens. Nuestros resultados sugieren que B. amyloliquefaciens, presenta una afinidad particular para crecer de 0 a 0.75 M de NaCl y desarrollarse en temperaturas de 30 a 50 °C. Los efectos de la inoculación de B. amyloliquefaciens, conjuntamente con A. halopraeferens, mostraron reultados favorables en el incremento de la germinación y el desarrollo de plántulas de P. chilensis. Éste es el primer reporte de B. amyloliquefaciens como bacteria promora de crecimiento de plantas asociada a P. glandulosa.

Palabras clave: Bacillus amyloliquefaciens, Azospirillum halopraeferens, fijación de nitrógeno.

Today in Mexico are being deforestated the species Prosopis spp. for use as firewood and charcoal, in various arid regions of the country. For its production a synthetic fertilizer is used, thus there is an increase in soil, groundwater and aquifers salinity. This research was conducted in Santa Ana, Sonora, Mexico in 2006. Were isolated and purified microorganisms associated with the root system of Prosopis glandulosa growing in craters of the volcanic area from El Pinacate and Gran Desierto de Altar, Sonora Biosphere Reserve. The plant growth-promoting bacteria present the peculiarity of fixing atmospheric nitrogen; the effect of the isolates on germination and seedling development in P. chilensis was measured. 19 colonies were isolated; of them, only one bacterial colony showed high acetylene reduction activity and ability to solubilize phosphate, was identified as Bacillus amyloliquefaciens. Our results suggest that B. amyloliquefaciens, has a particular affinity to grow from 0 to 0.75M of NaCl and develops at temperatures of 30 to 50 °C. The effects of inoculation of B. amyloliquefaciens, along with A. halopraeferens, showed favorable results in the increase of germination and seedling development of P. chilensis. This is the first report of B. amyloliquefaciens as a plant growth promoting bacteria associated with P. glandulosa.

Keywords: Bacillus amyloliquefaciens, Azospirillum halopraeferens, nitrogen fixation.

Introducción

Comunidades vegetales naturales están siendo inexorablemente perturbadas. Demandando una comprensión cada vez mayor de los mecanismos que operan en los ecosistemas naturales, de manera que las perturbaciones puedan ser manejadas para restaurar y estabilizar el medio ambiente (Agnew y Warren, 1996). Siendo el uso inapropiado de los fertilizantes sintéticos en diversos cultivos los causantes del incremento de la salinidad (Carrillo-García et al., 1999; Carrillo, 2002; Carrillo et al., 2002). Las alternativas de producción incluyen especies nativas y tolerantes a la salinidad (Carrillo et al., 1998). Tal es el caso de estudios previos demuestran que la especie P. chilensis (Molina) Stunz Emend. Burkart, tolera altas concentraciones salinas (Felker et al., 1981; Cazebonne et al., 1999).

Esta especie se encuentra en el centro-sur del Perú y en el centro norte de Chile, suroeste de Estados Unidos de América y México (Burkart, 1976). Ésta especie de árbol es una importante fuente de combustible, material de construcción y forraje. La población local usa también la legumbre para su alimentación, especialmente en Argentina donde todavía en muchos almacenes se vende una pasta hecha con la vaina y la planta es utilizada en proyectos de reforestación (Solis y Espericueta, 2005; CONAFOR, 2008; FAO, 2013).

La importancia ecológica de esta especie radica en el medio ambiente como planta fijadora de nitrógeno, enriquece el suelo, promueve el crecimiento de matorrales asociados a ella y por tanto previene la erosión del suelo por su sistema radicular que ayuda a retener la humedad del suelo. P.chilensis es una especie importante de este género; asimismo, actúa como planta nodriza de numerosas especies de aves y roedores (INE, 1995; Carrillo et al., 1998; Golubov et al., 2001; Villegas-Espinoza et al., 2010). Estos árboles son potencialmente importantes ya que pueden incorporarse en la reproducción en viveros, malla sombra y en invernaderos (Carrillo-García et al., 1999). En otros lugares, hay un interés cada vez mayor por los efectos de fitorremediación que presenta este género de plantas por reducir niveles de sal presente en el suelo y diferentes contaminantes causados por la minería (Stove, 1997; Prasad, 2007; Solowey, 2007; Haque et al., 2009; Mench et al., 2010; Mani y Kumar, 2013).

Sin embargo, la producción de P. chilensis esta limitada por la falta de nitrógeno disponible en el suelo (Karlin et al., 1997). Esta condición afecta el desarrollo y su potencial reproducción (Banwari y Rao, 1990; Akhavan et al., 1991; Nahid y Gomah, 1991; Hahne y Schuch, 2004).

Diversos estudios relacionados con la interacción planta microorganismo en el género Prosopis spp., se limitan a estudios unicamente con micorrizas (Carrillo-Garcia et al., 1999). Sin embargo, con relación a bacterias promotoras de crecimiento de plantas autóctonas de ambientes áridos salinos se destaca el de Villegas et al. (2008) con la especie P. glandulosa. Es importante aumentar el número de bacterias promotoras de crecimiento de plantas y además que sean tolerantes a la salinidad (Hamdi, 1999; Whipps, 2000).

Materiales y métodos

Muestreo de raíces y suelo para aislamiento microbiano

El muestreo se realizó en los cráteres de la zona volcánica reserva de la biosfera El Pinacate y Gran Desierto de Altar Sonora, aproximadamente entre los meridianos 113° 15' y 133° 45' de longitud oeste y el paralelo 31° 30' y 32° 00' de longitud norte. Las muestras fueron colectadas de las raíces secundarias de la planta de P. glandulasa en la etapa de floración, se extrajeron cinco muestras (50 g) de cada uno de los cinco árboles muestreados las raíces fueron cortadas de un a dos cm (Puente et al., 1999) y fueron puestas en el medio semi líquido Rennie (Rennie, 1981) se pusieron en agitación por 48 h a 30 ºC, con una agitación de 150 rpm. Las soluciones resultantes fueron diluidas en 10^-1 seis veces, en solución salina a 0.85%, para lograr la dilución total de 10^-6. Tres repeticiones de la dilución de ambos medios fueron dispersados en cuatro concentraciones de 0, 0.25, 0.5, y 0.75 M de NaCl se exparcieron en 12 placas conteniendo el mismo medio líquido y solido libre de nitrogeno. Las placas fueron incubadas a 30 °C (12 placas) y 50 °C (12 placas) por cuatro días.

Cuatro gramos de suelo, fueron obtenidos de las muestras de raíz, se depósito en agua destilada estéril para su dilución (1:100 suelo: agua por volumen). Después cinco diluciones de 10^-1 para tener un total de 10^-5, se obtuvo un volumen de 0.1 ml para depositarse en los medios libres de nitrógeno, en tres replicas, aplicándose en las placas con cuatro concentraciones de 0, 0.25, 0.5, y 0.75 M de NaCl. Las 12 placas fueron incubadas a 30 ºC y 50 °C (Rueda-Puente et al., 2010).

Identificación de la bacteria fijadora de nitrógeno

La caracterización molecular de las bacterias se desarrollo por medio del análisis por cromatografía de gases de ésteres metílicos de los ácidos grasos celulares (Sasser, 1990) y por secuenciación del 16S rRNA (ACCULAB, Newark, DE). Las identificaciones de las bacterias asignadas en este artículo se basan en el porcentaje de distancias genéticas (% GD), que se definen como el número de diferencias de nucleótidos entre las dos secuencias, expresado en porcentaje. Todas las secuencias de DNA se generaron usando PE Biosystems' MicroSeq 16S rRNA kit del gen MicroSeq 500 rDNA. Las muestras fueron identificadas usando el MicroSeq Software de Indentificación Microbiana. El árbol filogenético fue generado utilizando el algoritmo unión de vecinos (Saitou y Nei, 1987). Todos los aislados de bacterias promotoras de crecimiento de plantas fueron almacenados en 15% de glycerol a -70 ºC (Carrillo et al., 1998).

Los cultivos puros fueron puestos en botellas apropiadas con los medios de cultivo semi líquido libres de nitrógeno OAB y Rennie en 0.5 M de NaCl, que se selló y se incubó a 30 ºC durante cinco días. Después de la incubación, un ml de aire se extrajo con una jeringa y se inyectó un ml de acetileno. Se incubó el cultivo durante 48 h a 30 ºC después de este procedimiento. Se realizaron cinco réplicas para validar los resultados se utilizó como control la cepa A. halopraeferens Au4T (Reinhold et al., 1987) siendo una bacteria promotora de crecimiento de plantas ampliamente estudiada (De Troch y Vanderleyden, 1996; Castellanos, 1998). El análisis del etileno se realizó en cromatografía de gases (Vary 6000, Vary Instrument Group, USA) equipado con un detector de iones con flama de hidrógeno (Holguin et al., 1992).

Determinación de las bacterias promotoras de crecimiento de plantas en la solubilización de fosfatos

La degradación mineral se evaluó cualitativamente por observación visible y medición del halo de solubilización; para ello cada una de las cuatro cepas aisladas fueron inoculadas en placas conteniendo medio SRSM (Sundara Rao y Siha, 1963) medio modificado por Vazquez et al. (2000) la siembra se realizó en placa por extensión en superficie e incubadas a 30 y 50 °C. La observación del crecimiento bacteriano y la medición del halo a producirse (evidenciado por la clarificación del medio ocasionada por la solubilización de mineral) se realizó a las 24 h. La capacidad de las bacterias aisladas para disolver fosfatos también fue cuantificada siguiendo la metodología reportada por Vazquez et al. (2000). Se realiazaron cinco placas por repetición.

Más tarde, la determinación de la concentración de fosfato se determinó de acuerdo con el método estándar (Strickland y Parsons, 1972; Craven y Hayasaka, 1982). Se utilizó diseño experimental completamente al azar con un arreglo trifactorial 4*2*4 donde (4 bacterias, 2 temperaturas y 4 niveles de salinidad) con el fin de aplicar un análisis de varianza (ANOVA). Las diferencias significativas se compararon entre las medias de los tratamientos fueron realizadas por la prueba de rango multiple de Duncan a p= 0.05. Los datos fueron analisados con el programa (SAS, 2001).

Evaluación de B. amyloliquefaciens como inoculante en la germinación de P. chilensis bajo estres salino

El efecto de B. amyloliquefaciens en P. chilensis (Mol) Stuntz., en la prueba de germinación, peso fresco y seco, altura y longitud radicular, utilizando como control A. halopraeferens. Utilizando la bacteria bajo las siguientes concentraciones de 0, 0.25, 0.5 y 0.75 M de NaCl. Durante el verano (junio-julio) de 2006 se colectaron vainas maduras de árbol de mezquite chileno (P. chilensis), ubicado en la ciudad de Santa Ana, Sonora (paralelo 30° 33' latitud norte y 111° 07' longitud oeste del meridiano Greenwich, 548 msnm). Posteriormente las vainas se depositaron en un recipiente térmico o hielera a 4 °C. Las semillas se homogenizaron en base a tamaño y apariencia.

Se lavaron en agua potable siguiendo el criterio de flotabilidad, desechando aquellas que flotaron. Posteriormente se desecho el agua y se adicionó un desinfectante denominado Tween 20, al 2% y se mantuvo así durante 10 minutos en agitación constante a una velocidad de 150 revoluciones por minuto (rpm) utilizando una agitadora marca EBERBACH. Las semillas fueron inoculadas en líquido de acuerdo a (Carrillo et al., 1998). Antes de realizar la inoculación las semillas fueron tratadas por escarificación de agua caliente a una temperatura de 75 °C por cuatro minutos esto se realizó para romper la latencia en las semillas y favorecer el porcentaje de germinación.

El diseño experimental utilizado fue un arreglo bifactorial 3 x 4 considerando dos factores aleatorios, cada uno con cinco réplicas de 10 semillas cada uno. Considerando como primer factor el inoculante teniendo tres niveles: el no inoculado, el inoculado con la bacteria B. amyloliquefaciens y el inoculado con A. halopraeferens. El Segundo factor conteniendo las cuatro concentraciones de 0, 0.25, 0.5 y 0.75 M de NaCl. Resultando en 12 tratamientos. Los datos del porcentaje de germinación total fueron analisados, después de llevar a cabo la transformación de los valores en arcoseno (Sokal y Rohfl, 1988), con el fin de aplicar un análisis de varianza (ANOVA). Las diferencias significativas se compararon entre las medias de los tratamientos fueron realizadas por la prueba de rango multiple de Duncan a p= 0.05. Los datos fueron analisados con el programa (SAS, 2001). 35 plántulas fueron elegidas de cada tratamiento al azar; se midió el crecimiento de las plántulas, peso fresco y seco en 20 días. La longitude de la raíz y la altura fueron medidas con la utilización de un bernier digital (GENERAL No. 143, General Tools Manufacturing Co., Inc. New York). El peso seco se determinó después de cada plántula secada en una secadora de aire forzado a 110 °C por 36 h.

La cuantificación de las bacterias adheridas al sistema radicular de P. chilensis se realizaron al finalizar el estudió 20 días después. Se utilizaron siete plántulas de cada tratamiento y fueron lavadas con agua destilada estéril y fueron sumergidas durante un minuto dentro un tubo Eppendorf. Los tubos se agitaron por un minuto para separar las bacterias de la raíz. Se tomaron tres muestras de 100 µL de la solución resultante de los tubos y se sembraron en cajas petri por dispersión conteniendo el medio sólido Rennie libre de nitrógeno y encubadas por 24 h a 30 ºC y 50 ºC, se cuantificaron las unidades formadoras de colonias (CFU). Las CFU se les realizó un análisis de varianza (ANOVA), la prueba-F fue aplicado para determinar los valores de diferencias significativas (Snedecor, 1956). Las diferencias significativas se compararon entre las medias de los tratamientos, fueron realizadas por la prueba de rango multiple de Duncan a p= 0.05. Todas las pruebas se realizaron con el programa estadístico SAS (SAS, 2001).

Resultados y discusión

Identificación de las bacterias promotoras de crecimiento de plantas

Sólo cuatro microorganismos con alta actividad de reducción de acetileno fueron identificados con dos pruebas bioquímicas: 1) ácidos grasos metil esteres (FAMES), y 2) por medio de la secuenciación del 16S ribosomal RNA (Figura 1). Los resultados presentan una afinidad de 96.2% que identica a B. amyloliquefaciens, que se desarrolla en suelo y agua, asociada con plantas, y tiene la capacidad de fijar nitrógeno acorde con lo reportado por (Vázquez et al., 2000).

Durante el análisis de reducción de acetileno, sólo una especie de los 19 aislados presentaron actividad en la reducción de acetileno siendo la especie B. amyloliquefaciens con 6.28 ± 0.46 nmol del cultivo^-1 h^-1, en contraste con el control A. halopraeferens, con 7.2 ± 1.5 nmol cultivo^-1 h^-1. Los cuatro géneros bacterianos con una mayor actividad en la reducción de acetileno después de B. amyloliquefaciens fueron Kocuria polaris (6.01 ± 0.25 nmol cultivo^-1 h^-1), Planococcus antarcticus (5.79 ± 0.51 nmol cultivo^-1 h^-1), y Rhododcoccus fascians (5.13 ± 0.76 nmol cultivo^-1 h^-1). Se observó que las 19 colonias fueron incapaces de reducir el acetileno en grandes cantidades en comparación con el control A. halopraeferens. Esto se debe a la dependencia de otras bacterias (Holguin et al., 1992; Rojas et al., 2001). Además hay estudios que demuestran que B. amyloliquefaciens tiene la capacidad de fijar nitrógeno, producir fitohormonas y solubilizar fostatos (Zexun y Wei, 2000).

Determinación de las bacterias promotoras de crecimiento de plantas en la solubilización de fosfatos

De acuerdo a la solubilización de fosfatos las cuatro especies de bacterias solubilizan fosfatos en el medio de cultivo contenteniendo fosfato de calcio insoluble, la mayor solubilización fue a las 16 h después de la incubación. Entre las especies de bacterias tratadas, Planococcus antarcticus mostró actividad solubilizadora. Sin embargo, B. amyloliquefaciens redujo la actividad de solubilización con el aumento de salinidad (Cuadro 1).

Evaluación de B. amyloliquefaciens como inoculante en la germinación de P. chilensis bajo estrés salino

Cuando se inoculó B. amyloliquefaciens durante la etapa de germinación, y usando como control A. halopraeferens, los resultados mostraron diferencias significativas entre los tratamientos (Figura 2). Además, se observó que el incremento de la salinidad a 0.25 M de NaCl y la inoculación de las bacterias en estudio favorecen la germinación para P. chilensis. Las semillas inoculadas con A. halopraeferens y B. amyloliquefaciens germinaron 20% más aproximadamente a 0 M de NaCl. Los tratamientos con mayor salinidad afectaron negativamente el porcentaje de germinación, independientemente estando presentes las bacterias (Figura 2).

Por otra parte, la fijación de nitrógeno es influenciada por las bacterias y con ello promoviendo el desarrollo y mostrando diferencias significativas entre los tratamientos (Cuadro 2) para los dos resultados medidos (altura de planta y longitud del sistema radicular). Los tratamientos con B. amyloliquefaciens promovieron el crecimiento de las plántulas, y presentaron un mayor número de células bacterianas adheridas a las raíces con B. amyloliquefaciens también se aprecia una declinación bacteriana de las unidades formadoras de colonias (CFU) con el incremento de la salinidad (Cuadro 2).

Sin embargo, la longitud del sistema radicular se incrementó con B. amyloliquefaciens con una diferencia significativa (p< 0.05) en comparación con A. halopraeferns sólo en el control y en la concentración de 0.5. Ésta especificidad de la asociación planta-bacteria probablemente es controversial en bacterias de vida libre, ya que influyen en la simbiosis entre los microorganismos, plantas y con ello se estimula el crecimiento de las plantas indirectamente (Kloepper et al., 1989).

Para llevar a cabo el desarrollo de la especie P. chilensis, se asume que esta especie podría beneficiarse de las bacterias promotoras de crecimiento de plantas presentes en la rizósfera (Holguin et al., 1992; Vázquez et al., 1999). En este sentido, otros microorganismos como las actinorrizas se asocian con las raíces de Prosopis (Ferrari y Wall, 2004) como también Azsorhizobium, Bradyrhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium (Martínez-Scott et al., 2002).

Evaluación de inoculantes en germinación y crecimiento de plántulas

Conclusiones

La germinación de P. chilensis es afectado negativamente por la salinidad. Sin embargo, la inoculación de las bacterias A. halopraeferans y B. amilolyquefasciens mitigan ese efecto negativo, promoviendo la germinación de la semilla y subsecuente en etapa de plántula. Es posible la utilización de bacterias promotoras de crecimiento de plantas halotolerantes con potencial para ser utilizadas en reforestación. Es importante mencionar que este tipo de trabajo pone como alternativa la posible utilización de estos microorganismos beneficos como pontencial de ser utilizados como biofertilizantes. Sin embargo los estudios de asociación de B. amyloliquefaciens y A. halopraeferens con la especie P. chilensis, se recomienda llevar a cabo más estudios de la interacción planta-bacterias promotoras de crecimiento de plantas.

La utilización de las bacterias promotoras de crecimiento de plantas halotolerantes son un potencial para utilizarse en zonas áridas, ya que las altas concentraciones de sales en el agua presentan un problema y debido que el género Prosopis spp., es un árbol que se desarrolla en suelos salinos, puede contribiur al manejo de dichas zonas (Velarde et al., 2003). Prosopis puede ser utilizado para la agricultura principalmente, donde hay una posibilidad para el desarrollo de gestión de inversión sostenible de los bosques para reforestar áreas dañadas. También se puede utilizar como un cultivo de alimentos y semillas oleaginosas. Al mismo tiempo, el género Prosopis como cultivo ayudaría a equilibrar zonas desérticas. Siendo un método biológico confiable basado en bacterias benéficas, y contribuir con la fertilidad de los suelos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Fondo Sectorial de Investigación en Materia Agrícola, Pecuaria, Acuacultura, Agro-biotecnología y Recursos Filogenéticos del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología y Comisión Nacional Forestal y la Universidad de Sonora, por el proyecto 14651: "Bacterias Promotoras del Crecimiento de Plantas Asociadas a Ambientes Árido Salinos y su Efecto en la Reproducción de Mezquite Sonorense y Chileno". Universidad Autónoma de Baja California Instituto de Ciencias Agrícolas y al Departamento Academico de Agronomia de la Universidad Autónoma de Baja California Sur.

Literartura citada

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