Transformación del hongo fitopatógeno Sclerotium cepivorum Berk empleando fusión de protoplastos*

Transformation of the phytopathogenic fungus Sclerotium cepivorum Berk using protoplasts fusion

Gerardo Acosta-García¹, Miguel Ángel Pantoja-Hernández¹, Claudia Ivonne Muñoz-Sánchez¹, Cristina Pérez-Pérez¹, Ramón Gerardo Guevara-González³, Irineo Torres-Pacheco³, Felipe Delgadillo-Sánchez², Mario Martín González-Chavira² y Lorenzo Guevara-Olvera^1§

¹Departamento de Ingeniería Bioquímica, Instituto Tecnológico de Celaya, Av. Tecnológico y A. García Cubas S/N, Celaya Guanajuato, México, C. P. 38010. Tel. 01 461 6117575, Ext. 324 y Fax, Ext. 402. (gerardo.acosta@itcelaya.edu.mx) phma001@yahoo.com.mx; civonne@itc.mx; cristina_perez@itc.mx; lorenzogo@yahoo.com).

³Ingeniería de Biosistemas. Facultad de Ingeniería. Universidad Autónoma de Querétaro. C. P 76010. Santiago de Querétaro, Querétaro. México; torresirineo@gmail.com §Autor para correspondencia: lorenzogo@yahoo.com.

* Recibido: febrero de 2012
Aceptado: julio de 2012

Resumen

La pudrición blanca, una de las enfermedades más preocupantes para los productores de ajo (Allium sativum), es causada por el hongo fitopatógeno Sclerotium cepivorum Berk. Con el fin de desarrollar procedimientos de biología molecular para el hongo, en este trabajo se describe un método de transformación empleando fusión de protoplastos en presencia de polietilenglicol 3350 (PEG). Se empleó el plásmido pAN7-1 que confiere resistencia a higromicina B, el cual contiene el gen higromicina fosfotransferasa B (hph) de Escherichia coli bajo el promotor gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (gpdA) y el terminador antranilato sintetasa (trpC) del hongo filamentoso Aspergillus nidulans. Las transformantes recuperadas en el medio de cultivo de regeneración papa dextrosa agar-sorbitol (PDA-S) en presencia de 200 (μmL^-1 de higromicina B se analizaron amplificando un fragmento del gen bacteriano hph mediante PCR con oligonucleótidos específicos: Hig 1, Sentido 5' GAC CTG CTG AGG TCC CTC 3' y Hig 2, antisentido 5' GCC CTC GGA CGA GTG CTG 3'. Se obtuvieron frecuencias de 12-18 transformantes de S. cepivorum por μg de ADN vector. Los resultados descritos en el presente trabajo contribuirán en la caracterización molecular de genes involucrados en el fenómeno de patogénesis de S. cepivorum sobre el ajo.

Palabras clave: Allium sativum, gen hph de Escherichia coli Sclerotium cepivorum, señales de expresión de Aspergillus nidulans, pudrición blanca.

White rot, a disease of most concern to the producers of garlic (Allium sativum), is caused by the phytopathogenic fungus Sclerotium cepivorum Berk. In order to develop procedures of molecular biology to the fungus, in this paper we describe a transformation method using fusion of protoplasts in the presence of polyethylene glycol 3350 (PEG). We used the plasmid pAN7-1 which confers resistance to hygromycin B, which contains the hygromycin phosphotransferase gene B (hph) from Escherichia coli under the glyceraldehyde phosphate dehydrogenase promoter (GPDA) and the anthranilate synthase terminator (trpC) of the filamentous fungus Aspergillus nidulans. The recovered transformants in the regeneration medium potato dextrose agar-sorbitol (PDA-S) in the presence of 200 μgmL^-1 of hygromycin B were analyzed by amplifying a fragment of the bacterial gene hph by PCR with specific oligonucleotides: Hig 1, Sentido 5' GAC CTG CTG AGG TCC CTC 3' and Hig 2, antisentido 5' GCC CTC GGA CGA GTG CTG 3'. Obtaining 12-18 frequencies of transformants of S. cepivorum per μg of vector DNA. The results described in this paper will contribute to the molecular characterization of the genes involved in the phenomenon of pathogenesis of S. cepivorum on garlic.

Key words: Allium sativum, hph gene of Escherichia coli, Sclerotium cepivorum, expression signals of Aspergillus nidulans, white rot.

Introducción

El ajo (Allium sativum Linnaeus) es uno de los cultivos vegetales económicamente mas importantes en diferentes países incluyendo México. En nuestro país el estado de Guanajuato se destaca por su producción. La pudrición blanca causada por el hongo Sclerotium cepivorum Berk, es la enfermedad predominante en las cosechas de ajo en México. El hongo produce estructuras de resistencia denominadas esclerocios, éstos pueden sobrevivir en el suelo hasta por 20 años y su germinación se induce por la presencia de exudados de la raíz del ajo, específicamente por los disulfuros de dialilo (Coley-Smith et al, 1990). Entre los métodos empleados para el control de la pudrición blanca, destacan la aplicación intensiva de fungicidas (Delgadillo-Sánchez et al, 2004); sin embargo, éste enfoque es cada vez menos práctico dado que los microorganismos del suelo adquieren tolerancia degradando los compuestos aplicados. Se han empleado varias estrategias alternativas para el control de la pudrición blanca como parte de un programa de control integrado que incluye prácticas culturales como solarización del suelo y control biológico (McLean et al, 2001; Delgadillo-Sánchez et al, 2004), desafortunadamente, se requiere la aplicación de fungicidas para un manejo efectivo con estos sistemas.

Por otro lado, el análisis de los eventos moleculares que conducen a la patogénesis de hongos que afectan cultivos de importancia en México y el mundo son prácticamente desconocidos, una de las limitantes es la ausencia de un método de transformación que permita determinar la función de los genes involucrados en el fenómeno. Se han descrito diferentes procedimientos de transformación para los hongos, incluyendo tratamientos por medio de iones metales alcalinos (Ito et al, 1983), perlas de vidrio (Costanzo y Fox, 1988), electroporación (Sánchez et al, 1993; Gutiérrez et al, 2011), biobalística (Klein et al, 1987), integración mediada por enzimas de restricción (REMI) (Kim et al., 2002; Turgeon et al, 2011) y Agrobacterium tumefaciens (Gouka et al., 1999; Cardoza et al., 2006; Zhou et al., 2008; Sharma y Kuhad, 2010), entre otros. El procedimiento comúnmente empleado para la transformación de hongos requiere la producción de esferoplastos o protoplastos, los cuales, se mezclan con un plásmido adecuado que posee el gen de interés y una secuencia promotora apropiada, entonces las células se fusionan usando polietilenglicol (PEG) y el ADN transformante frecuentemente se integra dentro del genoma del hongo (Fincham, 1989; Sivan et al., 1992: Wei et al., 2010; Turgeon et al., 2011). La incorporación del ADN transformante dentro del hospedante depende de la construcción del plásmido de expresión (Esser y Mohr, 1986). Dado que los orígenes de replicación de procariotes no funcionan en organismos eucariotes, se han descrito algunos plásmidos de hongos.

El primero de ellos se descubrió en Saccharomyces cerevisiae (Beggs, 1978), posteriormente, se han aislado plásmidos de hongos filamentosos como Podospora anserina (Javerzat et al, 1993) y orígenes de replicación autónoma del hongo basidiomiceto patógeno de maíz Ustilago maydis (Tsukuda et al, 1988), entre otros. El desarrollo de los sistemas de transformación requiere marcadores de selección que permitan el reconocimiento de la cepa transformada. Los marcadores auxotróficos se han empleado para complementar un gen del hospedante no funcional con el gen previamente vgr clonado, los genes trpC y argB en Aspergillus nidulans (John y Peberdy, 1984; Yelton et al, 1984) y el gen Pyr4 de Neurospora crassa para complementar la mutante Pyr4 de A. nidulans (Balance et al, 1983).

Por lo tanto, el empleo de marcadores de selección auxotróficos requiere que la cepa hospedante posea la mutación apropiada. Los marcadores de selección dominantes permiten el reconocimiento de la cepa transformada en base a la resistencia a antibióticos. Los genes neomicina Tn5 (Rambosek y Leach, 1987), higromicina fosfotransferasa B (hph; Punt et al, 1987) y OliC3 de A. niger, el cual, confiere resistencia a oligomicina (Ward et al., 1988) son ejemplos de tales sistemas. El gen amdS (acetamidasa) de A. nidulans se ha usado como un marcador de selección dominante en A. niger, el cual, es incapaz de emplear la acetamida como única fuente de carbono (Kelly y Hynes, 1985). El vector de expresión también incluye el promotor, las secuencias regulatorias de la transcripción y un sitio de clonación múltiple, en el cual la región codificante heteróloga se inserta. Se han reportado una amplia variedad de promotores y secuencias regulatorias de la transcripción en la construcción de los plásmidos transformantes y se han descrito diferentes promotores inducibles y constitutivos. La elección del promotor depende de las condiciones bajo las cuales se pretende producir la proteína heteróloga. La secuencias regulatorias promotoras del gene AlcA, que codifica para la alcohol deshidrogenasa I de A. nidulans (Gwynne et al., 1987) y del gen glucoamilasa de A. niger (Gwynne et al., 1987) son ejemplos de promotores inducibles. Los promotores de los genes a-amilasa de A. oryzae (Christensen et al, 1988), adhA de A. niger (Saunders et al., 1989), triosa-fosfato isomerasa (tpi) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gpdA) de A. nidulans (Van Gorcom et al., 1986; Upshall et al., 1987) se han usado para la expresión constitutiva. El presente trabajo tuvo el objetivo de proponer un protocolo para la transformación de S. cepivorum mediante fusión de protoplastos con polietilenglicol (PEG) empleando el plásmido pAN7-1 (Punt et al., 1987), el cual posee el gen hph de Escherichia coli bajo el promotor gpdA y el terminador de la transcripción trpC del hongo filamentoso A. nidulans.

Cepas, plásmido y reactivos

La cepa C2 de Sclerotium cepivorum (un aislado de Cortazar, Guanajuato), actualmente ubicada en el cepario del Instituto Nacional de Investigaciones ForestalesAgrícolas Pecuarias (INIFAP), fue mantenida en agar papa dextrosa (PDA). Las células químicamente competentes de Escherichia. coli TOP 10 fueron adquiridas de Invitrogen (Carlsbad, CA), almacenadas a -80 °C y empleadas para la amplificación del plásmido pAN7-1 (número de acceso Z32698), Punt et al. (1987) el cual, se usó para la transformación de protoplastos de S. cepivorum. Para el crecimiento del hongo se usaron los medios de cultivo papa dextrosa agar (PDA) y papa dextrosa líquido (PDB) de DIFCO (Detroit, MI). E. coli TOP 10 se cultivó en el medio Luria Bertani (LB), adicionado de ampicilina a una concentración final de 50 (μmL^-1 para la selección del plásmido. De Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) se adquirieron ampicilina (A2804), enzimas líticas (L 1412), polietilenglicol 3 350 (P 2139), sorbitol (S 7547), higromicina B (H 3274), ácido 3-(N-morfolino)-propanolsulfónico (MOPS; M 9024) y perlas de vidrio (425-600 μm, G 8772). De Promega (Madison, WI) se obtuvo la enzima de restricción Hind III empleada para linealizar el plásmido pAN7-1.

Efecto de la higromicina B en el desarrollo de S. cepivorum

Se prepararon caj as de Petri conteniendo 2 8 mL de medio PDA y diferentes concentraciones de higromicina B (0, 50, 100, 200, 300y 500 μmL^-1), posteriormente se colocó un disco de micelio de 1 cm² en el centro de cada caja. Las cajas se incubaron a 16 °C y se observaron cada 12 h para registrar el crecimiento del hongo.

Obtención de micelio

El micelio de S. cepivorum se obtuvo transfiriendo 200 esclerocios procedentes de una caja de Petri conteniendo PDA a 100 mL de caldo PDB, incubando a 16 °C y 75 rpm durante 96 h. El micelio se cosechó empleando un dispositivo de filtración Corning (Acton, MA) de 150 mL para la obtención de 1 g de micelio.

El micelio se resuspendió y lavó con 15 mL de medio osmótico MO (fosfato de sodio, 10 mM; sulfato de magnesio, 1.2 M; pH= 5.8), centrifugando a 5 000 rpm a 4 °C durante 10 min. El sobrenadante se de scartó y se repitió el procedimiento de lavado tres veces (3X). El micelio se resuspendió en 10 mL de regulador MO conteniendo 200 mg de enzimas líticas (Lysing Enzymes; L 1412, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; con actividades reportadas de celulasa, proteasa y quitinasa) incubando a 28 °C durante 5 h hasta la obtención de los protoplastos.

Los protoplastos fueron cosechados por centrifugación a 2 100 rpm a 4 °C durante 10 min y resuspendidos en 10 mL de medio osmótico MO empleando una micropipeta de 1 000 μL con puntas estériles. 10 mL de regulador de atrapamiento RA (Ácido 3-(N-morfolino)-propanesulfónico, 100 mM; Sorbitol, 0.6 M; pH= 6.5) fueron adicionados suavemente por la pared interna del tubo. Los protoplastos fueron centrifugados a 5 000 rpm a 4 °C durante 10 min, atrapados en la interfase (aprox. 5 mL), cosechados con la ayuda de una micropipeta de 1 000 μL y colocados en un tubo Falcon de 50 mL. Inmediatamente después, se adicionaron 45 mL de regulador MS (MOPS, 10 mM; sorbitol, 1 M; pH= 6.5) y fueron sometidos a centrifugación a 2 100 rpm a 4 °C durante 10 min.

Postriormente, los protoplastos fueron resuspendidos suavemente en 15 mL de regulador MSC (MOPS, 10 mM; sorbitol 1 M; cloruro de calcio, 20 mM; pH= 6.5) y centrifugados a 2 100 rpm a 4 °C durante 7 min repitiendo la operación dos veces (2x). La viabilidad de los protoplastos fue determinada en el medio de cultivo PDA-S (papa dextrosa agar, 0.7%; sorbitol, 1 M). La morfología de los protoplastos se registró en un microscopio de luz Carl Zeizz empleando el objetivo de 40 x.

Efecto de la higromicina B en el desarrollo de los protoplastos

Los protoplastos contenidos en alícuotas de 100 μL (aprox 5-25X10⁷mL^-1 se colocaron en tubos Falcon de 15 mL, se adicionaron 14 mL de PDB-S suave (papa dextrosa líquido, 2.4%; sorbitol, 1M; agar, 0.7%), se mezclaron suavemente por inversión, se colocaron en placas de Petri y se incubaron a 16 °C durante 48 h para la regeneración de su pared celular. Posteriormente, se adicionaron 14 mL de medio de cultivo PDA-S, adicionado de higromicina B dando una concentración final de: 0, 50, 100, 200 y 300 μmL^-1. Las placas inoculadas por triplicado, se incubaron a 16 °C y se observaron cada 12 h para registrar el crecimiento.

Transformación

Para tratar de aumentar la eficiencia de transformación en el hongo, 1 μg de ADN del plásmido pAN7-1 se linearizó con la enzima de restricción Hind III en un volumen de 15 μL. Como control de latransformación a los protoplastos se le adicionaron 2 μL de agua desionizada estéril. El plásmido pAN7-1 linearizado fue precipitado, resuspendido en 2 μL de agua desionizada estéril y adicionado suavemente a los protoplastos e inmediatamente se agregaron 30 μL de PEG 3350 (60%, p/v) a temperatura ambiente, se mezcló suavemente y se incubaron en baño de hielo durante 30 min.A la mezcla de transformación se adicionaron gota a gota 900 μL de PEG 3350 y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min.

El medio PDB-S conteniendo la mezcla de transformación se distribuyó por triplicado en placas de Petri para la selección de transformantes, en tanto como testigo se inocularon los protoplastos sin transformar. Los protoplastos se regeneraron durante 48 h, posteriormente se adicionaron 14 mL de medio de cultivo PDA-S, adicionado de higromicina B dando una concentración final de 200 μgmL^-1. Las placas se incubaron a 16 °C y se observaron cada 12 h hasta la aparición de colonias.

Selección de transformantes por PCR

Las transformantes recuperadas en PDA adicionado de higromicina B se analizaron por PCR empleando los siguientes oligonucleótidos específicos: Hig 1, Sentido 5' GAC CTG CTG AGG TCC CTC 3'; bases 1911-1928 (10 μm); Hig 2, antisentido 5' GCC CTC GGA CGAGTG CTG 3'; bases 3235-3252 (10 jim). ElADN de las transformantes y de la cepa control C2 se aisló empleando el método de extracción por hervido, adaptado de Holmes y Quigley (1981).

Para cada transformante y la cepa control se prepararon tubos Eppendorf de 1.5 mL conteniendo 100 mg de perlas de vidrio de 450-600 μm y 150 μL de TE (Tris base, 50 mM; EDTA, 2 mM). Se transfirieron 2-3 mg de micelio con asa metálica a cada tubo y agitaron por vortex durante 2 min. Los tubos se sellaron con papel parafilm, se hirvieron durante 5 min y se sometieron a vortex durante 1 min. A cada tubo se le adicionaron 150 μL de una mezcla fenol: cloroformo (1:1, v:v), se agitó con la ayuda de un vortex por 1 min y se centrifugó atemperatura ambiente a 12 000 rpm durante 5 min.

Cada sobrenadante se transfirió a un tubo Eppendorf estéril, se adicionaron 100 μL de cloroformo, se sometió a vortex por 1 min y se centrifugó como en el paso anterior. 1 μL de cada sobrenadante (aprox 50 ng) se empleó como templado para la reacción de PCR la cual, constó de 35 ciclos con las siguientes temperaturas y tiempos: desnaturalización 94 °C, 60 seg; alineamiento 56 °C, 90 seg; síntesis 72 °C, 60 seg. Como control positivo fue empleado el plásmido pAN7-1 (50 ng). Los productos de PCR fueron revelados en un gel de agarosa al 1.2% teñido con bromuro de etidio y usando como marcador de tamaño 1 kb DNA Ladder, de promega.

Resultados

Sensibilidad S. cepivorum al antibiótico higromicina B

Formación de protoplastos de S. cepivorum

Se encontró que en un periodo de incubación de 5 h a 30 °C se obtuvo la mayor formación de protoplastos (5-25X10⁷mL^-1) (Figura 1B), cantidad recomendada para lograr la tranformación de los hongos (Birch y Denning, 1998). Los resultados mostraron que la acción de las enzimas celulasa proteasa y quitinasa contenidas en el producto Lysing Enzymes, es suficiente para la generación de protoplastos en S. cepivorum a diferencia de otros hongos como Coccidioides immitis (Reichard et al, 2000) o Aspergillusfumigatus (Birch y Denning, 1998) donde es necesario suministrar adicionalmente driselase (InterSpex, Foster City USA, con actividades reportadas de celulasa, pectinasa, laminarinasa, xylanasa, amilasa entre otras) y kilatase (ICN FLOW, High Wycombe UK), con actividades reportadas de β-glucanasa proteasa, pectinasa y amilasa), respectivamente, para la remoción de la pared celular de ambos hongos patógenos de humano.

Los protoplastos transformados se recuperaron en cajas de Petri conteniendo el medio de regeneración PDA-Sorbitol (conteniendo 200 μgmL^-1 de higromicina B (Figura 2A), en tanto, los protoplastos control fueron incapaces de exhibir el mismo fenotipo (Figura 2B). Cada posible colonia transformante se transfirió a cajas de Petri con medio PDA adicionado con 300 μgmL^-1 de higromicina B y el desarrollo se registró a los 7 días de incubación a 16 °C. 12-18 colonias transformadas mostraron lento desarrollo en el medio PDA en condiciones de selección (Figura 3A), comparada con la cepa silvestre C2 en ausencia de higromicina B (Figura 3 C), en tanto la cepa silvestre fue incapaz de mostrar crecimiento bajo selección (Figura 3B), mostrando que el hongo S. cepivorum se ha transformado.

Confirmación de la transformación por PCR

Para demostrar que el plásmido pAN7-1, el cual confiere resistencia a higromicina B, se encuentra en las transformantes obtenidas, se llevó acabo un análisis por PCR. Así, el ADN de las transformantes se aisló por el método de hervido el cual fue adaptado por Holmes y Quigley (1981) y dispone como molde. Adicionalmente, dos oligonucleotidos anidados, sentido y anti-sentido que cubren respectivamente, parte del promotor gpdA y el marco de lectura abierto del gen hph (Punt et al., 1987), se emplearon como iniciadores. A los 35 ciclos, en el gel de agarosa al 1.2% se observa la amplificación de una banda de 1.342 kpb empleando como moldes los ADN del plámido pAN7-1 y el ADN genómico de la transformante MAPH1 de S. cepivorum (Figura 4, líneas 1 y 2). En tanto, empleando el ADN genómico de la cepa silvestre como templado, el producto de PCR no amplificó (Figura 4, línea 3), confirmando que el gen hph forma parte del ADN de las cepas transformantes.

Discusión

1 μg del plásmido pAN7-1 linearizado con la enzima de restricción Hind III, permitió la obtención de 12-18 transformantes de S. cepivorum resistentes al antibiótico higromicina B, el cual se usó como marcador de selección dominante. Dado que no se cuenta con promotores de genes homólogos del hongo fitopatógeno, fue necesario emplear el plásmido pAN7-1 (Punt et al., 1987) el cual, tiene al gen hph de E. coli bajo el promotor gpdA y el terminador trpC de A. nidulans, así, el aislamiento de transformantes de S. cepivorum confirman que el promotor heterólogo gpdA dirige la transcripción del gen bacteriano hph en el hongo, de manera análoga como se ha demostrado en el hongo fitopatógeno Neonectria galligena (Tanguay et al., 2003).

Las transformantes obtenidas mostraron desarrollo lento en medio PDA adicionado con higromicina B, comparada con la cepa silvestre en ausencia del factor de selección, lo cual sugiere la presencia de núcleos sin transformar en el micelio heterocariótico obtenido. Dado que S. cepivorum no posee un ciclo de esporulación sólo forma esclerocios, será necesario aislar puntas de hifas para la selección del homocarión.

Estudios posteriores deberán incluir el aislamiento y empleo de promotores homólogos fuertes, de igual manera el empleo de procedimientos de electroporación (Sánchez et al., 1993; Gutiérrez et al, 2011), biobalística (Parvez et al, 2004), integración mediada por enzimas de restricción (REMI) (Kim et al., 2002; Turgeon et al., 2011) y A. tumefaciens (Gouka et al, 1999; Cardoza et al., 2006; Zhou et al, 2008; Sharma y Kuhad, 2010), para aumentar la eficiencia de transformación del hongo, tal como se ha demostrado en diferentes hongos.

Adicionalmente, se deberá analizar el tipo de integración empleando secuencias homólogas blanco con la intención de realizar experimentos de disrupción génica para mostrar la función de genes específicos en la patogénesis del hongo, como en el caso de la demostración del papel del gen ornitina descarboxilasa (Umodc) durante la transición dimórfica y patogénesis del hongo basidiomiceto patógeno del maíz Ustilago maydis (Guevara-Olvera et al, 1997). Una clave importante para el avance de la biología molecular y la genética de un organismo dado es el desarrollo de sistemas de transformación genética, lo cual hace posible el análisis y la manipulación del genoma del organismo de interés. Sin embargo, poco se ha avanzado en el desarrollo de sistemas de etiquetado de genes aplicado a un amplio rango de hongos filamentosos.

Agradecimientos

Al COSNET (666.02-P) y al CONACYT (37546-B) por el apoyo económico otorgado a la presente investigación, así como por la beca otorgada a Miguel Ángel Pantoja-Hernández.

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