Efecto de la inoculación con bacterias rizosféricas en dos variedades de trigo. Fase II: invernadero*

Effect of inoculation with rihizospheric bacteria in two varieties of wheat Phase II: greenhouse

Carlos José Bécquer Granados^1§, George Lazarovits², Laura Nielsen², Maribel Quintan¹, Modupe Adesina², Laura Quigley², Igor Lalin² y Christopher Ibbotson²

¹Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spiritus, A. P. 2255, Z. P. 1. Sancti Spiritus, Cuba. ^§Autor para correspondencia: pastossp@yayabo.inf.cu.

* Recibido: diciembre de 2011
Aceptado: julio de 2012

Resumen

Se llevó a cabo un experimento de invernadero para evaluar la influencia de la inoculación simple y combinada, efectuada con las bacterias rizosféricas Sinorhizobium y Azospirillum, en dos variedades de trigo. Materiales y métodos según lo descrito en las metodologías convencionales para este campo de estudio. El diseño experimental fue completamente aleatorizado, con 4 réplicas y 10 tratamientos. Análisis estadístico varianza bifactorial. Se utilizó tratamiento fertilizado con NH₄NO₃ (150 ppm/kg suelo). Se evaluó contenido de clorofila foliar, peso seco aéreo, peso seco radical, longitud del tallo y germinación. En caso de aparecer diferencias, se determinaron mediante la prueba de Duncan, y las diferencias entre las variedades con t-Student. Se concluye que la inoculación combinada de la cepaA2 (Sinorhizobium meliloti) con la cepaN7 (Azospirillum zeae), fue la de mayor influencia positiva en el contenido de clorofila de las plantas. Por otra parte, existió una alta diferenciación entre las dos variedades de trigo en la longitud del tallo, peso seco aéreo y peso seco radical. Los resultados en peso seco aéreo y peso seco radical, al combinarse los dos factores estudiados, dependieron notablemente de las características varietales de la planta y del efecto significativo de la población autóctona de rizobacterias. La germinación de las plantas no estuvo vinculada a ninguno de los factores aplicados en el experimento.

Palabras clave: Azospirillum, Sinorhizobium, clorofila foliar, fitohormonas.

Abstract

Key words: Azospirillum, Sinorhizobium, foliage chlorophyll, phytohormones.

Introducción

El efecto positivo de las bacterias rizosféricas en gramíneas, en base a su producción de sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal, ha sido demostrado por diferentes autores (Antoun y Prévost, 2005; Anya et al., 2009). Entre estas bacterias, Azospirillum constituye una de las más prometedoras, ya que coloniza la rizosfera de numerosos cultivos y la producción de fitohormonas, reducción de nitratos, así como la fijación del dinitrógeno, se le han atribuido para explicar su efecto positivo en las plantas (Steenhoudt y Vanderleyden, 2000). En el presente trabajo se utilizó una cepa de A. zeae y otra de A. canadense, ambas conocidas por incrementar el rendimiento de cereales (Mehnaz et al, 2010). Otras bacterias, como los rizobios, colonizan no sólo las raíces de las leguminosas, sino también las de plantas pertenecientes a otras familias y producen diversos metabolitos que pueden actuar como sustancias promotoras del crecimiento vegetal (Dakora, 2003). En el presente experimento se utilizaron cepas de Sinorhizobium meliloti, género reconocido como altamente eficiente por su efecto estimulador del crecimiento vegetal en trigo en combinación con cepas de Azospirillum (Askary et al., 2009).

Por otra parte, se conocen trabajos sobre la coinoculación con bacterias pertenecientes a diferentes géneros, capaces de producir sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal y de lograr un efecto positivo en diversos cultivos de forma sinérgica (Carolina y Lorda, 2009; Rodríguez et al., 2009). La coinoculación puede beneficiar el crecimiento vegetal a través de diferentes mecanismos (Bashan et al, 2004; Rodríguez et al, 2006), como el de cambios en la morfología y fisiología del sistema radical (Sarig et al, 1992). El incremento en el número de raíces laterales y pelos radicales causa el aumento de la superficie radical disponible para los nutrientes y la captación de agua (Bai et al, 2003).

El objetivo general del experimento se centró en determinar la influencia de la inoculación simple y combinada con Azospirillum spp. y Sinorhizobium spp., así como de la variedad vegetal, en trigo, cultivado bajo condiciones de invernadero.

Materiales y métodos 

Procedencia de las cepas: se utilizaron las cepas N7, perteneciente a A. zeae, así como la cepa DS2, perteneciente a A. canadense, donadas por Agriculture and Agri-Food Canada (London). Asimismo, se utilizaron las cepas A2 y NRG34 pertenecientes a S. meliloti y donadas por Agriculture and Agri-Food Canada (Quebec).

Procedimiento experimental: utilizaron metodologías previamente descritas por Sabry et al. (1997) y Webster et al. (1997). Todas las cepas crecieron en medio sólido Levadura-Manitol (Vincent, 1970) y se resuspendieron en medio liquido Levadura-Manitol hasta lograr una concentración celular de 10⁷-10⁸ UFC/mL. Se aplicó el inóculo bacteriano en el momento de la siembra (1.0 mL/ semilla), con una concentración celular de 10⁷-10⁸ UFC/mL y diluido en proporción de 1:10 mediante una solución salina estéril (0.85% NaCl). Una segunda inoculación, con la misma concentración, fue aplicada a los 5 días de siembra.

Se utilizaron macetas plásticas con 0.90 kg de suelo sin esterilizar, que se colectó en áreas pertenecientes a Agriculture and Agri-Food Canada, Estación Experimental Delhi (London, Ontario, Canadá) (42° 5' latitud norte, 80° 3' longitud oeste). Este suelo está clasificado como Luvisol Marrón-Brunosólico Gris (Brunisolic Gray Brown Luvisol) (Canadian System of Soil Classification) (Chapman y Putman, 1966) y se caracteriza por su predominio de arena (88%). Composición química: (N: 0.01 %; materia orgánica: 1%; P₂O₅: 217 ppm; K₂O: 101 ppm, NaCl: 6 ppm, Mg: 115 ppm; Ca: 62 ppm; pH: 6). Se sembraron las macetas con 10 semillas cada una, sin esterilizar. La evaluación fue realizada a las tres semanas de siembra con la utilización de técnicas de evaluación agronómicas convencionales para ensayos de invernadero (Somasegaran y Hoben, 1994), así como la determinación del contenido de clorofila foliar, con un detector de clorofila Minolta SPAD-501 (Rodríguez-Mendoza et al., 1998).

Diseño experimental y análisis estadístico: se realizó el análisis de varianza de un experimento bifactorial con un diseño completamente aleatorizado, con el objetivo de evaluar dos variedades de trigo con 10 tratamientos: control fertilizado químicamente (NH₄NO₃: 150 ppm N/kg de suelo), tratamientos inoculados con las cepas NRG34, A2, N7, DS2; tratamientos coinoculados con NRG34+N7, A2+N7, NRG34+DS2, A2+DS2, así como el control absoluto. Se utilizaron 4 réplicas, y se evaluaron 5 plantas por tratamiento. Las diferencias entre las medias para la interacción de los dos factores y del tipo de fertilización, se determinaron mediante Duncan (1955) y las diferencias entre las variedades se determinaron con t-Student. Los datos fueron procesados en SPSS/PC versión 15.0 para Windows. Se evaluaron las variables: peso seco aéreo (g/ planta), peso seco radical (g/planta), longitud del tallo (cm/ planta), germinación (%) y contenido de clorofila foliar (SPADS/planta).

Resultados y discusión

La longitud del tallo, peso seco aéreo y peso seco radical difirieron (p< 0.001) sólo al comparar las variedades de trigo probadas. En el Cuadro 1 se observa que para la longitud del tallo, Hoffrnan muestra un comportamiento superior (10.11 cm). También esta misma variedad se mantiene por encima de Barrie para el peso seco aéreo (1.08 g/planta) y el peso seco radical, con 0.61 g/planta.

Es evidente que existió una alta diferenciación entre los representantes de las dos variedades al constatar la superioridad de la variedad Hoffman. Esta diferencia de significación estadística indica una influencia marcada de la variedad vegetal en las variables agronómicas antes mencionadas. Askary et al. (2009) encontraron que la coinoculación de trigo con Azospirillum brasilense y Sinorhizobium meliloti influyó favorablemente en determinados parámetros de crecimiento de la planta, pero que esos resultados dependieron también de las variedades de trigo utilizadas. Diversos autores, como Dóbbelaere et al. (2002) y Pecina-Quintero et al. (2005) consideraron que la respuesta de la planta a la inoculación depende de factores diversos, entre los que se encuentra el genotipo de la planta, lo cual se corrobora en el informe de Van Loon (2006), de que las bacterias pertenecientes al género Pseudomonas alteran la expresión genética de las plantas en raices y hojas a diferentes niveles, lo cual es un indicativo del reconocimiento de uno o más factores bacterianos determinantes por los receptores específicos de la planta.

Esta propiedad indudablemente debe variar entre las especies vegetales por estar condicionada, tanto al genotipo vegetal, como al genotipo del microorganismo. También Bosco et al. (2006) detectaron una clara tendencia en la correlación entre las variedades de plantas y el efecto de un inóculo probiótico, compuesto de bacterias rizosféricas y micorrizas vesiculo arbusculares.

Esta tendencia de la influencia de la variedad en los resultados agroproductivos se observó también en la interacción de los factores variedad x tipo de fertilización, la cual presentó en el análisis de varianza diferencias significativas (p< 0.001) ante peso seco aéreo y peso seco radical. En el Cuadro 2 se observa, en peso seco aéreo, que los tratamientos más sobresalientes fueron Hoffman-fertilizado (1.34 g), Hoffman+N7 (1.19 g) y Hoffman-control absoluto (1.12 g). El primer tratamiento fue estadisticamente superior al resto, excepto Hoffman+ N7. Es evidente la marcada influencia del factor variedad en dicha interacción de factores, pero también la población autóctona de la rizosfera debió jugar un papel importante. Según Chelius y Triplett (2000) estas rizobacterias, al igual que las introducidas, se asocian a las raices de la planta debido a la influencia de compuestos orgánicos producto de los exudados radicales, como carbohidratos, ácidos orgánicos y factores de crecimiento microbiano. Una prueba de ello fue, que en peso seco radical, aunque persistió la influencia varietal en los resultados, los valores estadisticamente superiores correspondieron a Hoffman-control absoluto (0.84 g), el cual compartió superindices comunes con Hoffman+A2+DS2 (0.79 g), Hoffmann+NRG34+DS2 (0.74 g), Hoffman+N7 (0.65 g) y Hoffman+DS2 (0.62 g). Al igual que en peso seco aéreo, los valores inferiores correspondieron a los tratamientos de la variedad Barrie.

Brasil et al. (2005 y 2006), así como Kuss (2006), encontraron presencia de Azospirillum no sólo en el interior de las raíces, sino también en la parte aérea de las plantas, debido a lo cual esta bacteria puede presentar ventajas sobre otros géneros bacterianos de la rizosfera.

Por otra parte, Vessey (2003) asegura que el ácido indol acético producido por las rizobacterias puede provocar iniciación radicular y elongación celular; la producción de citoquininas puede favorecer la división celular y la expansión de los tejidos; así como las giberelinas influyen en la elongación del tallo. De la forma exacta en que estas sustancias pudieron haber influido en los resultados expuestos no se estudió en este trabajo, pero evidentemente los mismos deben depender de alguna u otra forma del tipo y cantidad de metabolitos segregados por los diferentes géneros y especies de bacterias que se usan en la biofertilización, así como de la población autóctona de la rizosfera. Se impone una profundización adecuada en este campo de estudio.

El contenido de clorofila foliar sólo presentó diferencias significativas (p< 0.001) ante los diferentes tipos de fertilización probados. En el Cuadro 3 se observó que el tratamiento fertilizado (40.38 SPADS/planta) presentó los mayores valores (p< 0.001) en comparación con el resto de los tratamientos, seguido por el tratamiento inoculado con A2 +N7 (35.99 SPADS/planta). El resultado de dicho tratamiento inoculado pudiera estar vinculado al efecto de las citoquininas en la planta, secretadas en este caso por las cepas que conformaron dicha combinación. Según Zahir et al. (2001), en experimentos de campo con arroz existió aumento en el rendimiento y en contenido de N, P y K, después de aplicaciones exógenas de citoquininas; lo cual reafirma la hipótesis de que estas hormonas, suplementadas a través de bacterias, pueden mejorar el crecimiento y rendimiento de los cultivos. Cacciori et al. (1989) demostraron la producción de estas hormonas en Azospirillum spp., así como Upadhyaya et al. (1991) lo hicieron en Rhizobium spp. Otro enfoque de estos resultados podría tenerse en cuenta, en base al posible efecto sinérgico de estas cepas. Tejeda et al. (2009) consideran que la coinoculación de cultivos de plantas con el empleo de diferentes géneros bacterianos conlleva a efectos positivos.

Askary et al. (2009) observaron que la combinación de dos cepas, pertenecientes a Sinorhizobium meliloti y a A. brasilense, conllevó al aumento 45% de N en grano de trigo en el tratamiento inoculado, en comparación con el control no inoculado. Estos resultados pudieran de la misma forma responder a un sinergismo significativo de la cepa N7 (A. zeae) en cuanto a su aporte de nitrógeno a la planta. Además de su alta capacidad de producir ácido indolacético (Reis Junior et al, 2004), existen informes que aseguran la influencia de Azospirillum en la formación de raíces laterales en trigo por la secreción de nitritos, producto de la nitratación (Bashan y Holguin, 1997). No se descarta, aún en discrepancia con Mehnaz y Lazarovits (2006), quienes informaron sobre la pobre actividad fijadora de nitrógeno de N7 en maíz; que el tratamiento coinoculado con A2 (S. meliloti) y N7, al presentar los mayores índices de clorofila foliar entre los tratamientos inoculados, indicara una fuerte actividad de la enzima nitrogenasa en N7, superior a la de producción de fitohormonas.

Se demostró por Khammas y Kaiser (1992) que la actividad nitrogenásica de Azospirillum se incrementa cuando crece en combinación con otras bacterias, incluso cuando éstas provengan de hábitats diferentes; lo que pudo ocurrir con la combinación usada en el presente experimento. Existen informes de Holguin y Bashan (1996) de que un inóculo mixto de Staphylococcous y Azospirillum promovió la actividad dinitrofijadora de Azospirillum; así como la inoculación combinada de A. brasilense con Pseudomonas striata incrementó significativamente el rendimiento de grano, nitrógeno y absorción de P en sorgo (Alagawadi y Gaur, 1992). Cárdenas et al. (2010) observaron altos índices de reducción de acetileno en cepas de A. brasilense inoculadas en Guinea (Panicum maximum Jacq.), bajo condiciones de campo en Colombia.

Se constató, por otra parte, que las combinaciones de A2+DS2 (34.14 SPADS/planta) y NRG34+DS2 (33.13 SPADS/planta), así como las aplicaciones simples de A2 (33.85 SPADS/planta) y N7 (34.07 SPADS/planta) y el control absoluto (34.33 SPADS/planta), compartieron superíndices comunes y presentaron valores por debajo de los tratamientos antes mencionados, aunque fueron estadísticamente superiores (p< 0.001) a NRG34+N7 y a NRG34 (Cuadro 3).

El efecto de estas cepas y de sus combinaciones sobre la planta, pudiera responder a problemas de supervivencia en el suelo que puede variar en dependencia de la cepa. Okon (1982) aseguró que en suelo no estéril los microorganismos nativos interfieren con la colonización de la bacteria Azospirillum. Según Prigent-Combaret et al. (2007), la actividad fitoestimuladora de Azospirillum puede ser reducida por la presencia de ciertas especies de Pseudomonas en el suelo. Además, Kiers y Denison (2008) demostraron que las cepas de rizobios pueden variar significativamente en su habilidad de mejorar las variables agronómicas de los cultivos; desde no tener ningún impacto, hasta incrementar los rendimientos el doble o el triple en comparación con el tratamiento no inoculado.

Es válido tener en cuenta también de que Hilali et al. (2001) reportaron que varias cepas pertenecientes a Rhizobium leguminosarum, tuvieron diferentes efectos en el rendimiento de trigo en dependencia del tipo de suelo. Se demostró por Egamberdiyeva et al. (2006) que los diferentes tipos de suelo afectan la eficiencia promotora del crecimiento vegetal de las rizobacterias en trigo, chícharo, algodón y maíz. En el actual ensayo, sólo se utilizó un tipo de sustrato, por lo que se desconoce de qué forma podrían influir en las plantas las cepas evaluadas al utilizar otros ambientes edáficos.

También en el Cuadro 3, esta vez sin la intervención del factor varietal que pudiera enmascarar de cierta forma el efecto de la inoculación, se observó en peso seco radical que la combinación de la cepa A2 (Sinorhizobium meliloti) con DS2 (Azospirillum zeae), superó al control absoluto (0.41 g) (p< 0.001), aunque se igualó al control fertilizado (0.71 g) y al resto de los tratamientos. Independientemente que la producción de la auxina indol-3-acido acético (AIA), está reconocida como un factor importante en las habilidades directas de A. brasilense en su efecto promotor del crecimiento vegetal (Dobbelaere et al, 2001), el efecto producido por esta combinación de cepas pudiera deberse a que la inoculación con rizobios con capacidad estimuladora del crecimiento vegetal, conlleva a cambios morfológicos en las raíces (Biswas, 1998), por lo que las hormonas producidas específicamente por estas dos cepas, quizás ejercieron un mayor estimulo en el desarrollo del sistema radical de la planta, lo que conllevó a un efecto superior al producido por las demás cepas. Este efecto pudiera tenerse en cuenta en la aplicación práctica de estos estudios, para la inoculación de cultivos en condiciones de estrés hídrico, por la ventaja de absorción eficiente de humedad y de nutrientes que presupone un sistema radical desarrollado (Yang et al, 2009).

Conclusiones

La inoculación combinada de la cepa A2 (Sinorhizobium meliloti) con la cepa N7 (Azospirillum zeae), fue la de mayor influencia positiva en el contenido de clorofila de las plantas, debido probablemente a un incremento de la actividad de la enzima nitrogenasa en Azospirillum, provocado por su combinación con Sinorhizobium.

Existió una alta diferenciación entre las dos variedades de trigo en la longitud del tallo, peso seco aéreo y peso seco radical, lo que indica una influencia marcada de las características varietales de las plantas en dichas variables.

Los resultados en peso seco aéreo y peso seco radical, al combinarse los dos factores estudiados, dependieron notablemente de las características varietales de la planta y del efecto significativo de la población autóctona de rizobacterias.

La germinación de las plantas no estuvo vinculada a ninguno de los factores aplicados en el experimento.

Agradecimientos

Este trabajo fue llevado a cabo con la ayuda de una beca concedida por el Centro de Desarrollo Internacional, Ottawa, Canadá.

Literatura citada

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