Diversidad filogenética de especies de Microcoleus de costras biológicas de suelo de la península de Baja California, México
Phylogenetic diversity of Microcoleus species from biological desert crusts of the Baja California Peninsula, Mexico
Alejandro López–Cortés*, Yolanda Maya y José Q. García–Maldonado
Laboratorio de Ecología Microbiana Molecular, Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR), Mar Bermejo 195, Colonia Playa Palo de Santa Rita, 23090 La Paz, Baja California Sur, México.
]]>*Correspondencia:
alopez04@cibnor.mx
Recibido: 09 septiembre 2008
Aceptado: 20 agosto 2009
Resumen
Microcoleus vaginatus fue proclamada como especie cosmopolita. Este supuesto no lo confirman los estudios morfológicos previos que se realizaron en poblaciones naturales de costras de suelo en una región con historia geológica particular, llamada sierra de la Laguna (SL), al sur de la península de Baja California (México). Por ello, en este estudio se comparó la estructura de comunidades de cianobacterias, con énfasis en el género Microcoleus, en costras biológicas de 10 localidades situadas a lo largo de la península. Se analizaron y cotejaron poblaciones naturales de cianobacterias con cepas tipo de colecciones públicas: Microcoleus sociatus (Sammlung von Algenkulturen Germany–SAG 26.92), M. paludosus (SAG 1445. 1a), M. vaginatus (Pasteur Culture Collection–PCC 9802) y M. chthonoplastes (PCC 7420). Se realizaron análisis microscópicos y de clusters de patrones de bandeado de secuencias del 16S rRNA, obtenidos por electroforesis de gel en gradiente desnaturalizante (DGGE). En los análisis microscópicos de muestras naturales no se detectaron morfotipos de M. vaginatus en 6 de las 10 localidades, 4 de ellas de la SL. La comparación de patrones de bandeado obtenidos por DGGE mostró diferencias significativas en la estructura de las comunidades de cianobacterias y ausencia de bandas equivalentes a M. vaginatus (PCC9802), en todas las localidades de la SL.
Palabras clave: Microcoleus vaginatus, cianobacteria, DGGE.
]]>Abstract
Microcoleus vaginatus has been proclaimed to be a cosmopolitan species. However, morphological studies performed on natural populations of cyanobacterial crusts in a region with a particular geological history at the southern part of the Baja California Peninsula, Mexico, called Sierra de la Laguna (SL), do not support the last assertion. We compared the community structure of cyanobacteria, with emphasis in the genus Microcoleus, in biological desert crusts from 10 different localities along the Baja California Peninsula. We analyzed natural cyanobacterial populations and matched them with type cultures from public collections: Microcoleus sociatus (Sammlung von Algenkulturen Germany– SAG 26.92), M. paludosus (SAG 1445. 1a), M. vaginatus (Pasteur Culture Collection–PCC 9802), and M. chthonoplastes (PCC 7420). Microscopy and cluster analysis of band patterns of 16S rRNA sequences from denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) were applied. The microscopic analysis of natural samples resulted in the undetection of morphotypes of M. vaginatus in 6 of the 10 localities, 4 or them from the SL. Comparison of band profiles from denaturing gradient gel electrophoresis showed significant differences in the natural cyanobacterial community structure and the absence of the band that matches with that of M. vaginatus (PCC 9802) in all of the SL localities.
Key words: Microcoleus vaginatus, cyanobacteria, DGGE.
Introducción
Las costras biológicas de suelo (que también se conocen como costras cianobacterianas, algales, criptobióticas o microbióticas) son el resultado de la íntima asociación que se forma entre partículas de suelo y cianobacterias, algas, microhongos, líquenes y briofitas que viven sobre la superficie del suelo o justo por debajo. Microcoleus vaginatus (Vaucher) Gomont es el taxón de cianobacterias con distribución cosmopolita de los suelos de regiones áridas y semiáridas. Algunos investigadores lo han considerado desde hace tiempo como la especie dominante de las costras microbióticas (Metting, 1991; García–Pichel et al., 2001). Sólo algunos autores han reconocido más de una especie de Microcoleus en suelos áridos (Cameron, 1964; Novichkova–Ivanova, 1980; Boyer et al., 2002, Maya et al., 2002). Las especies reconocidas son: M. chthonoplastes Thuret ex Gomont, M. lacustris (Rabenh.) Farlow, M. paludosus (Kütz.) Gomont ex Gomont, M. sociatus West et West, M. subtorulosus (Bréb.) y M. steenstrupii Boye–Pet.
En la península de Baja California, M. vaginatus y M. steenstrupii fueron registradas para el área de Cataviña por Flechtner et al. (1998), y M. paludosus y M. sociatus para la sierra de la Laguna por Maya et al. (2002). Estos patrones de distribución de especies de Microcoleus en la península de Baja California podrían explicarse a partir de su historia geológica, la cual involucra levantamientos tectónicos, deriva peninsular y aislamiento: el eje longitudinal de la península está formado por una serie de cadenas montañosas que se separaron del macizo continental en un proceso que se inició hace alrededor de 40 millones de años. Cambios en la dirección del movimiento de las placas oceánicas y el avance hacia el este de la placa continental crearon un enorme sistema de fallas en lo que es ahora el golfo de California. La masa montañosa de la sierra de la Laguna (Fig. 1a, en negro) se desprendió del continente y migró rumbo al noroeste, transportando un conjunto de comunidades biológicas continentales. Finalmente, la masa de la sierra de la Laguna se fusionó con las rocas ígneas y sedimentarias emergentes que componen la península como la conocemos hoy en día (Karig y Jensky, 1972; Murphy, 1983; Hausback, 1984) (Fig. 1a).
La sierra de la Laguna se ubica en la Región Árido–Tropical, de Wiggins (1980) y en el Distrito del Cabo, de Nelson (1921). Se ha demostrado que la sierra de la Laguna es una zona muy rica en endemismos vegetales y animales (León de la Luz y Domínguez, 1989; Arriaga et al., 1990; Álvarez–Cárdenas et al., 1999; Rodríguez–Estrella, 2005), lo que se debe tanto al temprano aislamiento que tuvo su biota del resto de la fauna y flora del desierto sonorense, como a que las condiciones climáticas actuales la convirtieron en una isla y refugio para muchas especies con requerimientos específicos de hábitat, constituyéndose en una "isla biológica" (Durham y Allison, 1960).
Análisis morfológicos previos de comunidades de cianobacterias de costras biológicas de suelo sugirieron que M. vaginatus estaba ausente de la sierra de la Laguna (Maya et al., 2002), aunque se ha registrado su presencia en otras localidades de la península de Baja California (Flechtner et al., 1998). Es por ello que se plantea la posibilidad de que procesos similares a los que han actuado sobre la flora y la fauna de la sierra estén ejerciendo su efecto en grupos menos conocidos y conspicuos, como son los microorganismos.
]]> Los estudios sobre la biogeografía de cianobacterias no son comunes, menos aún cuando se abordan en forma independiente de cepas cultivadas. Este estudio es una contribución al conocimiento de la distribución de las especies de Microcoleus en la península de Baja California.
Materiales y métodos
Muestreo, reactivación de las costras y microscopía. Se recolectaron muestras de costras biológicas de alrededor de 5 × 5 cm de la superficie del suelo en 10 localidades a lo largo de la península de Baja California (Fig. 1b). Las muestras se transportaron al laboratorio en cajas de Petri estériles, donde se reactivaron agregando agua dulce corriente hasta saturación y se mantuvieron permanentemente húmedas en condiciones controladas de temperatura e iluminación, a 29 °C y 50 µE m–2 s–1, respectivamente. Se hicieron observaciones periódicas de las costras reactivadas utilizando un microscopio estereoscópico (Zeiss). Con un microscopio de contraste de fases (Nikon) se observaron preparaciones frescas de filamentos y colonias, los cuales se tomaron de diferentes talos cianobacterianos por medio de micromanipulación (Maya et al., 2002). La asignación botánica de las especies del género Microcoleus se basó en Boyer et al. (2002) para M. vaginatus, y en Geitler (1932) para M. chthonoplastes, M. paludosus y M. sociatus.
Medio de cultivo y cepas tipo de cianobacterias. Con el objeto de obtener DNA de cultivos de referencia, se adquirieron 4 cepas tipo de colecciones públicas: .M. chthonoplastes (PCC 7420) y M. vaginatus (PCC 9802) de la Pasteur Culture Collection del Instituto Pasteur, y M. sociatus (SAG 26.92) y M. paludosus (SAG 1445.1a) de la Algae Culture Collection de la Universidad de Göttingen (Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen). Para la reactivación y cultivo de estas cepas se usaron 3 medios de cultivo: Z8 (Carmichel, 1986), BG11, y ASNIII (Rippka et al., 1979). Los cultivos se incubaron en condiciones controladas de temperatura e iluminación, a 29 °C y 50 µE m–2 s–1, respectivamente.
Extracción de DNA. Para la extracción del DNA se utilizaron: (1) el FastDNA Spin Kit (Bio 101 System) para las muestras naturales de suelo, y (2) el DNeasy Tissue Kit (Qiagen) para los cultivos axénicos de las cepas tipo.
Protocolo de PCR. Las amplificaciones por PCR se realizaron con un termociclador (Bio–Rad). Para amplificar selectivamente segmentos de genes que codifican para el 16S rRNA de cianobacterias en muestras naturales y de los cultivos cianobacterianos se aplicaron los primers CYA359F+GC y CYA781R (Nübel et al., 1997). La amplificación parcial del gen 16S rRNA se llevó a cabo con la siguiente mezcla de reacción: cada 25µL de mezcla contenía 14.46 µL de agua estéril, 5 µL de buffer de reacción verde 5X (Promega), 1.5 µL de solución de MgCl2 25 mM (Promega), 1.32 µL de dNTP's (G,A,T,C) a 2.5 mM, 0.26 µL de cada primer a una concentración de 250 ng µL–1, y 2 µL de DNA templete. El protocolo de amplificación PCR comenzó con un paso de desnaturalización inicial (5 minutos a 94°C). Posterior a este paso se añadieron 0.2 µL de GoTaq® Flexi DNA Polymerase (Promega) a la mezcla de reacción y se incubó a 80°C por 1 minuto. Posteriormente, siguieron 35 ciclos, cada uno de 3 minutos, de los cuales uno fue a 94°C, otro a 60°C y el tercer minuto a 72°C.
Análisis DGGE. Los productos de PCR fueron separados por electroforesis de gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), con un gel de poliacrilamida al 6% (w/v) de 1 mm de espesor, conteniendo un gradiente químico de 30 a 70% de desnaturalizantes (definiendo un agente 100% desnaturalizante como 7M de urea y 40% de formamida; la relación acrilamida:bisacrilamida es de 37.5:1). La corrida electroforética fue por 18 horas a 50 V en un sistema de detección de mutaciones (Bio–Rad), con buffer de corrimiento TAE 1X (40 mM Tris, 20 mM ácido acético, y 1 mM EDTA pH 8.3), que se mantuvo a temperatura constante de 60°C (Muyzer et al., 1998). Para la visualización de las bandas, el gel se tiñó con bromuro de etidio (EtBr) diluido en buffer TAE 1X y se fotodocumentó con un transiluminador UV (UVP BioDoc–ItTM System).
Análisis cluster. Las imágenes del gel de DGGE se normalizaron y analizaron con el programa GelCompare 4.6 (Applied Maths, Kortrijk, Bélgica). Se aplicó el coeficiente de similitud Dice para crear una matriz de similitud. Para proceder a la comparación de posición de patrones de bandeado se permitió un valor de tolerancia de 1.0%, que compensaría el mal alineamiento ocasionado por imperfecciones técnicas. Para formar los grupos (clusters) de los patrones de bandeado se utilizó el método de grupos pareados no ponderados (unweighted–pair group method –UPGMA) usando las medias aritméticas (Vauterin y Vauterin, 1992).
]]> Resultados
Identificación de los morfotipos y filotipos de cianobacterias. A partir de las observaciones hechas en preparaciones frescas de costras naturales y los cultivos de referencia, fue posible identificar los morfotipos presentes en las costras naturales. Las características morfológicas de las especies se presentan en el Cuadro 1.
Los análisis microscópicos y de DNA de las poblaciones naturales de cianobacterias de las 10 localidades confimaron las determinaciones previas a este trabajo, las cuales demostraron la presencia de M. sociatus y M. paludosus en 5 y 6 localidades respectivamente. M. vaginatus estuvo ausente en 6 localidades, 4 de ellas de la sierra de la Laguna; la excepción fue la localidad SL cañada de los Naranjos, en la que se detectó sólo por microscopía con una baja densidad de filamentos (Fig. 3).
Sólo se detectaron filotipos de M. chthonoplastes en la sierra de San Francisco (localidad 2). Ésta fue la especie menos respresentada en las 10 localidades (Fig. 3).
Análisis de clusters de las comunidades cianobacterianas. Se pudieron reconocer 7 clusters. El primer grupo estuvo conformado por las localidades 1, 2 y 9. Las 2 primeras, que tuvieron una relación cercana tanto en composición como en proximidad geográfica, mostraron un 68% de similitud. Por otra parte, la localidad 9 resultó distante tanto en composición como en proximidad geográfica de las otras 2, con un 55% de similitud.
El segundo cluster estuvo conformado por cianobacterias con un 63% de similitud entre las localidades 5 y 7, ambas de la sierra de la Laguna. Estas fueron además las que presentaron una mayor riqueza de especies (Cuadro 2) y con una composición relacionada cercanamente. El tercer cluster lo formó la localidad 10, y el cuarto cluster la localidad 4. Otros 3 clusters estuvieron conformados por las localidades 3, 6 y 8 (Fig. 2).
Discusión
]]> En este trabajo se combinaron análisis morfológicos y filogenéticos, éstos últimos con base en el alineamiento de patrones de bandeo de filotipos del 16S rRNA de muestras naturales con los de cultivos de cianobacterias de referencia, obtenidos por DGGE como un criterio para determinar la presencia o ausencia de 4 especies del género Microcoleus en 10 localidades geográficas ubicadas a lo largo de la península de Baja California.La detección de morfotipos y filotipos de M. paludosus y M. sociatus sugiere que éstos son los más conspicuos en la sierra de la Laguna. Más aún, la presencia de M. vaginatus fue detectada en la localidad SL cañada de los Naranjos, pero sólo a partir de análisis microscópico, no por análisis de filotipos. Esto sugiere que en la región de la sierra de la Laguna, especies de Microcoleus diferentes a M. vaginatus han logrado mejor adaptación (Cuadro 1 y Fig. 3).
Análisis de clusters de las comunidades cianobacterianas. Las localidades 1, 2 y 9 conformaron el primer grupo. Las localidades 1 y 9 comparten un origen marino de tierras emergidas, en tanto que la localidad 2 tiene un origen continental. La similitud en diversidad en la composición cianobacteriana entre estos sitios se podría explicar por la fuerte influencia marina que recibe la localidad 2 debido al viento constante proveniente de las grandes extensiones de las llanuras de evaporación que rodean el sistema lagunar localizado en el desierto de Vizcaíno, al oeste de la localidad.
En contraste, la similitud y riqueza de especies del segundo cluster dado por el número de bandas, conformado por las localidades 5 y 7 de la sierra de la Laguna, se podría explicar por su ubicación en la misma sierra y por su origen continental, respectivamente.
El tercer cluster y el cuarto (formados por las localidades 10 y 4 respectivamente) se relacionaron cercanamente tanto por su ubicación geográfica como por su origen continental, pero lejos en composición con los sitios 5 y 7, con un 48% de similitud. Aunque comparten el mismo origen geológico, los otros 3 clusters (localidades 3, 6 y 8) resultaron con una relación distante en composición y en geografía entre ellos (Fig. 2).
La ausencia de M. vaginatus en la mayor parte de los sitios de la sierra de la Laguna se pudo confirmar tanto por los análisis morfológicos como por los patrones de concordancia de perfiles de bandas del 16S rRNA en DGGE entre cultivos tipo de colecciones públicas y DNA de muestras naturales. Estos resultados sustentan nuestra hipótesis de que la historia geológica de la península y el aislamiento por las condiciones climáticas actuales, que han favorecido el desarrollo de procesos de especiación y endemismo en la flora y fauna de la sierra de la Laguna, podrían estar actuando igualmente sobre grupos de microorganismos, como las cianobacterias.
Agradecimientos
Los autores desean hacer patente su agradecimiento a Mario Josué Aguilar Méndez por su ayuda en el uso del programa GelCompare II 4.6, así como al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por su apoyo financiero a los proyectos SEMARNAT–2002–C01–847 (YM) y SEP–45914 (ALC).
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