Bioactividad in vitro de materiales compuestos de quitosana/poli(dl-láctido)

In vitro bioactivity of chitosan/poly(dl-lactide) composites

S.A. Martel-Estrada^1*, I. Olivas-Armendáriz², C.A. Martínez-Pérez² y J.G. Chacón-Nava³

¹ Instituto de Arquitectura, Arte y Diseño. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Av. Del Charro 450 Norte, Col. Universidad, C.P. 32310, Cd. Juárez, Chihuahua, México. * Autora para la correspondencia. E-mail: mizul@yahoo.com; adriana.martel@uacj.mx Tel. (52-656)-688-4820 Ext. 4635, Fax (52-656 )688-4820

³ Centro de Investigación en Materiales Avanzados, Departamento de Materiales Compuestos, Miguel de Cervantes 120, Complejo Industrial Chihuahua, C.P 31109, Chihuahua, México.

Recibido 5 de Marzo 2012
Aceptado 27 de Septiembre 2012

Resumen

Soportes de materiales compuestos porosos de diferentes concentraciones de quitosana/poli(DL-láctido) fueron fabricados por separación de fases inducida térmicamente y liofilización para aplicación en ingeniería tisular. La bioactividad in vitro de los soportes fue evaluada analizando las capias de apatita producidas después de sumergir los soportes en un fluido fisiológico simulado como medio de incubación. La interacción entre los grupos funcionales del material compuesto fue analizado por medio de calorimetría por barrido diferencial. La formación de apatita fue analizada usando espectroscopía de infrarrojo por Transformada de Fourier, microscopía electrónica de barrido por emisión de campo acoplada a un sistema de espectrometría por energía dispersiva y difracción por rayos X. Los resultados acumulativos de estas pruebas sugieren que los materiales compuestos desarrollados podrían tener aplicaciones potenciales en ingeniería tisular.

Palabras clave: quitosana, poli(DL-láctido), apatita, bioactividad, separación de fases térmicamente inducida.

Porous composites scaffolds of different concentration of chitosan/ Poly(DL,lactide) were fabricated for tissue engineering applications by thermally induced phase separation and lyophilization techniques. The in vitro bioactivity evaluation of the scaffolds was carried out by analyzing the apatite layers produced on them using Simulated Body Fluid (SBF) as incubation medium. The interaction betwern functional groups in the composite was analyzed using differential scanning calorimetry. The apatite formation wat analyzed using FTIR spectroscopy, Field Emission Scanning Electron Microscopy coupled to energy-dispersive electron X-ray spectroscopy and X-ray diffraction. The cumulative results obtained from IR spectra and SEM-EDS, suggest that the developed composites might have potential applications in tissue engineering.

Keywords: chitosan, poly(DL-lactide), apatite, bioactivity, thermally induced phase separation.

1 Introducción

El principal constituyente del hueso es el fosfato de calcio. Esta sustancia es similar en composición y estructura a los minerales en el grupo de apatita (Wopenka y col., 2005). La hidroxiapatita ha sido considerada uno de los principales constituyentes del hueso y de la parte mineralizada del cartílago (Valles y col., 2009). Los materiales biocompatibles forman en su superficie una capta de carbonato conteniendo hidroxiapatita que es similar a la apatita del hueso, la cual in vivo se une al hueso (Oliveira y col., 2009). Debido a esta propiedad, este tipo de materiales han sido ampliamente investigados para aplicaciones en ingeniería tisular (Lukito y col., 2005).

La bioactividad puede ser inducida en superficies bioinertes, por la formación de grupos funcionales o por la formación de fases cerámicas que tienen el potencial de producir grupos funcionales cuando son expuestos al medio ambiente del cuerpo (Leonor y col., 2008). El proceso de formación de hidroxiapatita en materiales bioactivos puede ser reproducido en un fluido fisiológico simulado (SBF, por sus siglas en ingles), que es capaz de predecir la bioactividad in vivo (Kokubo y col., 2006). El fluido fisiológico simulado ha sido utilizado en diferentes concentraciones, incluyendo 1X hasta 5X (Kong y col., 2006; Varna y col.,1999; Mohamed y col., 2008). Su ventaja principal es que es un método biomimético que no requiere equipo especial o procesos de alta temperatura para producir una capa de hidroxiapatita. Las propiedades de esta capa pueden afectar la viabilidad y proliferación celular (Kong y col., 2006). El proceso de formación de apatita requiere consumo de iones de calcio y fosforo de los alrededores del fluido corporal. El fosfato de calcio usa iones de OH^-, , Na⁺, K⁺ and Mg²⁺ de la solución simulada hasta que cristaliza en hidroxiapatita (Vallés y col.,2009). En esta investigación fue utilizada la solución simulada a una concentración de 1.5X ajustada a 7.40 pH y 36.5° C. Además las muestras fueron preparadas utilizando tetraetilortosilicato (TEOS) de acuerdo a un procedimiento establecido previamente (Olivas-Armendariz y col., 2009).

De acuerdo con investigaciones previas, el uso de la quitosana en la ingeniería tisular tiene algunas limitaciones, entre ellas que muestra pérdida de bioactividad (Leonor y col.,2008; Kong y col.,2006). La quitosana es uno de los polímeros mas prometedores debido a sus excelentes propiedades de biodegradabilidad, biocompatibilidad, incluso es antibacteriana y no toxica (Olivas-Armendariz y col., 2009; Duan y col., 2006). Es un polisacarido compuesto de glucosamina y unidades de N-acetil glucosamina unidas por un enlace β (1-4) glicosídico (Becerra-Bracamontes y col., 2009; Huang y col., 2007). Por otro lado, el Poli(DL-láctido) (PDLLA) es un polímero que ha sido ampliamente estudiado para aplicaciones ortopédicas debido a su alta estabilidad mecánica, así como a su biocompatibilidad in vivo y a que posee un buen potencial osteoconductivo (Rezwan y col., 2006).

A pesar de los múltiples estudios realizados sobre estos polímeros, aun no se ha reportado la bioactividad de un material compuesto de quitosana y PDLLA. Wu y col., (2008) realizaron una investigación utilizando estos polímeros, pero no evaluaron su bioactividad y su método de preparación era distinto al propuesto en la presente investigación, ya que involucraba un proceso de extracción de solvente previa a la liofilizacion, puesto que utilizaban acetona para el láctido; además, involucraba una extracción de la parte láctida. Por el contrario, en esta investigación se utilizó cloroformo debido a que tiene un punto de fusión mas alto que la acetona, lo que permitió procesar el material, sin este tipo de extracciones.

De acuerdo con las características anteriormente mencionadas, es razonable creer en la bioactividad de un material compuesto de quitosana/PDLLA. Por lo tanto, en este estudio, diferentes concentraciones de compuestos, biodegradables y biocompatibles de quitosana/PDLLA fueron desarrollados a través del método de separación de fases térmicamente inducida. Estos materiales compuestos fueron utilizados para investigar la bioactividad in vitro de los soportes analizando las capas de hidroxiapatita producidas en ellos por medio del uso de un fluido fisiológico simulado como medio de incubación. La formación de apatita fue analizada utilizando espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier, microscopía electrónica de barrido por emisión de campo, espectrometría por energía dispersiva y difracción por rayos X. Además, se realizó un estudio de calorimetría por barrido diferencial para verificar las interacciones entre los dos compuestos.

2 Metodología

2.1 Preparación de los materiales compuestos

Los soportes de los materiales compuestos de quitosana/poli(DL-láctido) (Ch/PDLLA) en diferentes composiciones, 70/30, 50/50 y 30/70 fueron desarrollados a través de la técnica de separación de fases termicamente inducida, a través de una metodología desarrollada previamente (Martel y col., 2010). Brevemente se elaboro una solución de PDLLA al 5 % (%w/v) en cloroformo. Esta solución se agrego por goteo a una velocidad de 10 μL/min aproximadamente a una solución de quitosana al 2% (%w/w) disuelta previamente en una solución de ácido acético al 1%. Después de que la solución de PDLLA se agregaba completamente, se permitía que la composición se agitara durante una hora a 40º C, seguida de 10 minutos de baño en ultrasonido para eliminar burbujas de la mezcla. Posteriormente, cada material compuesto era inmediatamente congelado en hielo seco (-78^° C) por un tiempo determinado (3 (5 6 horas), para evitar una separación de fases prematura. El solvente fue extraído por un sistema de liofilización Labconco FreeZone 2.5. Los materiales compuestos fueron neutralizados por inmersión en etanol a -20° C durante 12 horas, y posteriormente, por una inmersión en NaOH-CH₃CH₂OH en solución acuosa (preparada utilizando etanol al 80 % previamente mezclado con un 0.5(w%/w%) de NaOH) a la misma temperatura. Entonces, las muestras se lavaron con abundante agua destilada por lo menos 5 veces y se volvieron a liofilizar para extraer la humedad residual.

2.2 Espectroscopía de infrarrojo por transformada de Fourier

Para realizar la caracterización química de los soportes se utilizó un espectrómetro FTIR-ATR Nicolet 6700. Cada muestra seca fue utilizada sin ninguna preparación especial para las pruebas de espectroscopia por Transformada de Fourier. Todos los espectros fueron registrados utilizando una resolución de 100 escaneos y 16 cm^-1.

2.3  Caracterización por calorimetría por barrido diferencial

Las mediciones por calorimetría por barrido diferencial fueron llevadas a cabo en un instrumento Netzsch DSC 200 PC (Alemania). Con la finalidad de borrar el historial térmico de todas las muestras primeramente fueron calentadas desde temperatura ambiente hasta 260° C a 20°C/min. Posteriormente, fueron enfriadas desde 260°C hasta -20°C a la misma temperatura a una velocidad de 20°C/min. Finalmente, fueron calentadas desde -20°C hasta 260°C a 10°C/min en una atmosfera de nitrógeno.

2.4 Caracterización de la morfología y bioactividad in vitro

Antes de someter los materiales compuestos a la solución SBF 1.5X, se les dio una preparación de superficie. Cada muestra de aproximadamente 10 mm x 5 mm x 5 mm, se sumergió en 5 ml tetra-etil-ortosilicato (TEOS) durante 2 horas a 60°C. Una vez transcurrido este tiempo se lavaron con alcohol etílico y se dejaron secar a temperatura ambiente.

Para los estudios de bioactividad, las muestras previamente tratadas se colocaron en 5 mL SBF 1.5X con un pH de 7.40, durante cierto periodo de tiempo medido en semanas a 37 °C. Los periodos de observación fueron 7, 14, 21 y 28 días. Cada dos días se cambiaba la solución SBF para que fuera refrescada de iones. Cuando un intervalo de tiempo se cumplía, las muestras se removían de sus recipientes. Se lavaban con suficiente agua destilada y se ponían a secar al vacío a 30° C por una semana como mínimo.

Un microscopio electrónico de barrido por emisión de campo, acoplado a un sistema de espectrometría por energía dispersiva fue usado para observar la morfología y detectar la concentración de calcio y fosforo en la superficie después del tratamiento con el fluido fisiológico simulado. La relación CA/P fue estimada para cada material compuesto.

Los patrones de difracción por rayos X de la capa formada en la superficie del material fueron analizados entre 2Θ = 10º y 2Θ = 80º con un paso de 2Θ = 0.02° en un instrumento de difracción de rayos X en un modo continuo (PANanalytucal X'Pert PRO), con la finalidad de verificar la presencia de picos que confirmaran la presencia de calcificaciones.

2.5 Materiales

La quitosana fue comprada en Carbomer, Inc (Estados Unidos). El Poli(DL, láctido) con una viscosidad inherente de 0.34 dL/g en CHCl₃ fue adquirido en Lactel (Estados Unidos). Los solventes utilizados fueron etanol y cloroformo (CTR Scientific, Mexico) y ácido acético glacial (Mallinckrodt, Estados Unidos).

También fue utilizado fosfato ácido de sodio (Na₂HPO₄), Tris(Hidroximetril) amino metano (NH₂C(CH₂OH)₃), tetraetilortosilicato (TEOS) y fosfato diácido de potasio (KH₂PO₄) que fueron obtenidos de SIGMA (Monterrey, México); hidróxido de sodio (NaOH), cloruro de sodio (NaCl), carbonato ácido de sodio (NaHCO₃), cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl₂ ⋅ 6H₂O), sulfato de sodio (Na₂SO₄), cloruro de calcio (CaCl₂) y cloruro de potasio (KCl) adquiridos de Fisher-Scientific (Monterrey, México).

3 Resultados y discusión

Mediante el anaáisis de los espectros de infrarrojo, fueron visualizados algunos cambios en los picos característicos de las sustancias. En la Fig. 1 a y b, se muestra el espectro de infrarrojo de la quitosana, PDLLA y los materiales desarrollados a partir de estas sustancias a diferentes rangos de numero de onda. El espectro de la quitosana muestra las bandas características en 1570 cm^-1, que puede ser asignada a la vibración de flexion N-H (amida II), el pico en 1650 cm^-1 corresponde al modo de estiramiento C=O (amida I) (Fig. 1a), y el pico en 1380 cm^-1 (Fig. 1b) es del modo de estiramiento -C-O del grupo primario de alcohol en la quitosana. La banda en 1034 cm^-1 sugiere la presencia de un grupo eter. Además el espectro muestra los picos atribuidos a la estructura sacaridaen 1150 cm^-1 y 897 cm^-1(Fig. 1b).

El espectro PDLLA muestra las principales bandas de este láctido en 2924 cm^-1, 3447 cm^-1, 3862 cm^-1 que corresponden al estiramiento OH, grupo final, mientras que los picos en 751 cm^-1 y 866 cm^-1 pueden ser atribuidos al modo de flexión CH. Otra banda intensa es localizada en 1752 cm^-1 (Fig. 1a) que corresponde al estiramiento C=O del poliláctido. Además, la banda en 1453 cm^-1 es atribuida a las vibraciones del grupo CH₃. Los picos de absorción de las vibraciones de estiramiento =C-O están localizadas en 1050 cm^-1, 1089 cm^-1, 1126 cm^-1 y 1188 cm^-1(Fig. 1b).

La banda N-H fue afectada y desplazada desde 1570 cm^-1 hasta 1543 cm^-1, 1542 cm^-1 y 1543 cm^-1(Fig. 1a), respectivamente para los materiales compuestos 70/30, 50/50 y 30/70. Por otro lado, el pico que corresponde a los grupos primarios de alcohol (estiramiento -C-O) se desplazó desde 1380 cm^-1 a 1397 cm^-1, 1393 cm^-1 y 1394 cm^-1 (Fig. 1b) para los materiales compuestos 70/30, 50/50 y 30/70 respectivamente. El espectro muestra una banda pronunciada en 1752 cm^-1 que corresponde al enlace C=O del poli(DL-láctido) pero ligeramente desplazado a la derecha y con una intensidad reducida para las composiciones 70/30 (1743 cm^-1), 50/50 (1744 cm^-1) y 30/70 (1749 cm^-1) (Fig. 1b).

La quitosana es un polímero semicristalino debido a sus fuertes enlaces moleculares de hidrogeno inter e intra moleculares (Wu y col., 2008). Esta es la razón por la que es difícil encontrar una Tg a través de los metodos de calorimetría por barrido diferencial (DSC, por sus siglas en inglés). No obstante, fue posible encontrar la Tg para el PDLLA y los materiales compuestos Ch/PDLLA. La Tg encontrada a través de este análisis fue 45.3°C, 42.1°C 35.6°C y 39.9°C para los compuestos70/30, 50/50, 30/70 Ch/PDLLA y el PDLLA, respectivamente.

Todos los eventos anteriormente descritos sugieren una interacción entre el grupo amino de la quitosana y los grupos carboxilo del poli(DL-láctido) en la mezcla. Resultados similares fueron reportados por Wan y col. (2007) y Niu y col. (2009) en sus estudios de ácido polilactico/quitosana y poliláctido/quitosana, respectivamente. Durante sus investigaciones, ellos encontraron que es posible que existan enlaces de hidrogeno formados entre los grupos amino de la quitosana y los grupos carboxilos del DL láctido o los grupos hidroxilos de la quitosana y los carboxilos del DL láctido.

Es importante mencionar que durante este estudio, los materiales compuestos mostraron una estructura que consistía principalmente de planos profundos del soporte y pocos poros en la superficie. La formación de poros menores a 100 μm fue considerablemente mayor conforme disminuía la cantidad de quitosana en el soporte, aunque en general se trató de superficies altamente porosas. El tamaño de poro y la porosidad obtenida se muestra en la Tabla 1.

Como se señaló anteriormente, la bioactividad puede ser inducida en superficies bioinertes ya sea por la formación de grupos funcionales o por la formación de capas de fases cerámicas que tengan el potencial de formar grupos funcionales, tales como Ca-P, cuando sean expuestos al medio ambiente del cuerpo (Leonor y col, 2009).

La Fig. 2 muestra las típicas estructuras de hidroxiapatita a los 28 días de cultivo en la solución del fluido fisiológico simulado (Valles y col., 2009), las cuales son aglomerados que forman una capa continua en forma de coliflores compuestas por esferas de 1 a 3 μm. La Fig. 2c muestra la imagen correspondiente al material compuesto 30/70. A mayores amplificaciones, se pueden ver mas capas superpuestas a los agregados originales en forma de pequeños racimos de uva, que sugieren la existencia de sitios de nucleación secundaria para formación adicional de apatita en el compuesto 30/70 pero a los 21 días.

Los resultados de SEM fueron confirmados por el análisis de los espectros de infrarrojo de los materiales compuestos. Utilizando el Principio de Superposición de ondas, para este análisis, se desarrollaron operaciones matemáticas con los espectros obtenidos, con la finalidad de que las bandas correspondientes a las clasificaciones fueran mas visibles. Es decir, a los espectros obtenidos para las muestras con el tratamiento del fluido fisiológico simulado, se resto el espectro original sin tratamiento de cada compuesto. De esta manera, los espectros mostrados en las imagenes solo corresponden a los picos de los grupos funcionales formados durante la incubación de la muestra. El análisis IR (Fig. 4a) reveló la presencia de enlaces P-O en el modo de estiramiento v3, alrededor de 1046.0 cm^-1, así como la banda correspondientes al grupo (Fig. 4b), fuera del plano en modo de estiramiento 1467.6 cm^-1 (Rinaudo y col., 2006; Wopenka y col., 2005). De acuerdo con la presencia de estas bandas es posible sugerir que se formó apatita carbonatada.

La Fig. 5 muestra los espectros de difracción de la muestra 30/70 Ch/PDLLA antes y después de ser sometida al tratamiento del fluido fisiológico simulado por 7 días. Se puede ver que antes de ser sumergido en la solución, no era obvio ningún pico de absorción para el material compuesto. Una vez sumergido en la solución, son visibles ligeros picos en 25.1^°, 31.9^°, 32.5^°, 33.8^°y 34.3^°y que son atribuidos a apatita en los planos (002), (211), (112), (302) y (202). A través de la información obtenida de la difracción por rayos X, espectroscopia por infrarrojo y espectrometría por energía dispersiva se puede deducir que se formó una capa de apatita carbonatada (Zhang y col., 2012; Valles y col., 2009; Lei y col., 2009; Oliveira y col., 2009).

Conclusiones

Se prepararon exitosamente materiales compuestos de quitosana/poli/DL-láctido) a través del método de separación de fases inducida térmicamente utilizando cloroformo como solvente de la parte láctida del compuesto. Además, se encontró una morfología porosa bioactiva que podría ser apropiada para aplicaciones de ingeniería tisular. Los resultados sugieren que los materiales compuestos con un mayor porcentaje de poros menores a 100 μm, forman una mayor nucleación de las capas de apatita carbonatada. La habilidad de los compuestos para formar en su superficie una capa mineralizada fue evidente a través de los resultados acumulativos obtenidos por los espectros de infrarrojo, espectrometría por energía dispersiva y difracción por rayos X.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer y agradecer el financiamiento y apoyo de la Secretaría de Education Pública y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, a través del proyecto Fomix-Gobierno del Estado de Chihuahua CHIH-2010-C01-148041. Además, desean agradecer profundamente el apoyo del M. en C. Christian Chapa durante la caracterización SEM/EDS.

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