Producción de péptidos fijadores de calcio y hierro por Lactococcus lactis subsp. cremoris NCFB 712

Calcium and iron binding peptides production by Lactococcus lactis subsp. cremoris NCFB 712

C. Figueroa-Hernández¹*, A. Cruz-Guerrero¹, G. Rodríguez-Serrano¹, L. Gómez-Ruiz¹, M. García-Garibay^1,2 y J. Jiménez-Guzmán¹

¹ Departamento de Biotecnología Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa., Av. San Rafael Atlixco No. 186 Col. Vicentina, México D.F. 09340, México.* Autora para la correspondencia. E-mail: claudiafigueroa26@gmail.com Tel. +(52 55) 5804-4720; Fax: +(52 55) 5804-4712

Recibido 28 de Mayo 2012;
Aceptado 5 de Julio 2012

Resumen

Lactococcus lactis es una bacteria que presenta un alto potencial de generación de péptidos bioactivos. Una de las actividades más importantes que ejercen los péptidos bioactivos es la fijación de minerales como el calcio, hierro y zinc. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del pH en la producción de péptidos fijadores de calcio y hierro en fermentaciones con Lactococcus lactis subsp. cremoris NCFB 712. Se observó que en la fermentación con control de pH se favoreció la producción de péptidos fijadores de calcio (0.28 mmoles de Ca²⁺ mg-¹ de proteína), con respecto a la fermentación sin control de pH (0.23 mmoles de Ca²⁺ mg-¹ de proteína). Existe una correlación entre la actividad proteolítica y el calcio fijado por los sobrenadantes de las fermentaciones con y sin control de pH. En cuanto a la actividad fijadora de hierro se observó un aumento en la fermentación con control de pH con respecto a la fermentación sin control, en la cual se mantuvo la actividad fijadora inicial propia de las proteínas de la leche. Se encontró que los pesos moleculares de algunos de los péptidos generados coinciden con los pesos moleculares de secuencias reportadas como fijadoras de calcio y hierro.

Palabras clave: péptidos bioactivos, Lactococcus lactis, hierro fijado, calcio fijado.

Abstract

Keywords: bioactive peptides, Lactococcus lactis, iron-binding, calcium-binding.

1 Introducción

La deficiencia en la ingesta de algunos minerales como el calcio, hierro y zinc es un problema de salud a nivel mundial. Se ha visto que deficiencias en la ingesta de hierro pueden afectar a la mitad de la población mundial, presentándose en un 35% en los niños y en un 42% en las mujeres. La deficiencia en la ingesta de hierro provoca problemas en el funcionamiento del sistema inmune (Bouglé y Bouhallab, 2006), mientras que la deficiencia en la ingesta de calcio puede provocar el desarrollo de osteoporosis. La osteoporosis afecta al 20% de las mujeres postmenopáusicas en EE.UU y a 7.8 millones a nivel mundial (Heaney, 2000). Es por ello que se buscan alternativas que permitan aumentar la fijación de minerales en el cuerpo. Una de las alternativas son los péptidos fijadores de minerales. Los péptidos fijadores de minerales o caseinofosfopéptidos (CPP) tienen la habilidad de aumentar la absorción del calcio y otros minerales divalentes como el hierro, el zinc y el magnesio ya que tienen la capacidad de formar complejos solubles con éstos. La actividad biológica de estos péptidos se debe a que contienen en su estructura tres serinas fosfatadas (SerP) formando la estructura aniónica SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (Kitts, 2006). La alta concentración de cargas negativas de los CPP en especial, la de los grupos fosfatos fijados a los residuos de serina, son los sitios potenciales para la unión de los minerales. Se ha visto que la mayoría de los péptidos fijadores de minerales son generados a partir de las caseínas pero también pueden ser producidos a partir de algunas proteínas del suero como la β-lactoglobulina y la α-lactoalbúmina (Vegarud y col., 2000). Estos péptidos se encuentran encriptados en la proteínas de la leche y deben ser liberados para ser bioactivos (Vasiljevic y Shah, 2008), siendo la fermentación de la leche con bacterias ácido lácticas proteolíticas y algunas bacterias probióticas, uno de los métodos para la obtención de secuencias peptídicas bioactivas (Figueroa-González, 2010; González-Olivares, 2011). Se han encontrado una gran cantidad de péptidos bioactivos en quesos y leches fermentadas, ya que durante la elaboración de estos productos, las bacterias ácido lácticas utilizadas como cultivos iniciadores, degradan las proteínas de la leche, debido a que cuentan con un sistema proteolítico. Este sistema consta de tres componentes principales: la proteinasa ligada a pared celular (CEP o PrtP), sistemas de transporte de oligopéptidos y aminoácidos y una gran cantidad de peptidasas, la gran mayoría de ellas, situadas intracelularmente (Hayes y col, 2007).

Dos de los géneros bacterianos más utilizados para la generación de péptidos bioactivos durante el proceso de fermentación de la leche son Lactobacillus helveticus y Lactococcus lactis. Éste último es utilizado en la producción de diversos quesos y leches fermentadas. La mayoría de los trabajos de producción de péptidos bioactivos, a partir del sistema proteolítico de las bacterias ácido lácticas, se enfocan a la producción de péptidos antihipertensivos y existen pocos trabajos que estudian la generación de péptidos que presentan otro tipo de actividad, como la actividad fijadora de minerales. Por lo que el objetivo de este trabajo fue evaluar la producción de péptidos fijadores de calcio y hierro a partir de la fermentación con Lactococcus lactis subsp. cremoris NCFB 712, bajo diferentes condiciones de pH. Se realizó la fermentación bajo dos condiciones de pH, una en la que se dejó evolucionar libremente el pH (fermentación sin control de pH) y otra manteniendo el pH a 6.2, valor reportado como óptimo para la proteinasa de pared celular (Kunji y col., 1996).

2 Materiales y métodos

2.1    Microorganismo

Se empleó la cepa Lactococcus lactis subsp. cremoris NCFB 712 (Colección Nacional de Bacterias en Alimentos, Reino Unido), la cual fue conservada en medio litmus milk (Difco^TM, EUA) a 4°C. El inoculo fue crecido en leche descremada en polvo (Alpura, México) por 24 h a 30°C obteniendo una concentración final de 10⁸ ufc/mL.

Se evaluaron dos condiciones de fermentación en función del pH: una manteniendo el pH a 6.2 (adicionando NaOH 10 N cada dos horas) y otra dejando que el pH disminuyera por efecto de los ácidos producidos por el microorganismo. La fermentación se llevó a cabo en matraces Erlenmeyer de 1L con 600 mL de leche reconstituida al 20% (Figueroa-Hernández, 2007). La leche se pasteurizó a 121°C durante 5 minutos. El medio de fermentación fue inoculado al 5% (v/v). Las fermentaciones se llevaron a cabo a 30°C durante 28 h. Se tomaron muestras a las 0, 8, 16, 24 y 28 h. Se ajustó el pH de cada muestra a 9 (para solubilizar la caseína) y se centrifugaron a 25000xg por 30 min a 4°C (centrífuga Beckman J2-MI, EUA), los sobrenadantes obtenidos se almacenaron a -20°C para realizar los análisis posteriores. Las fermentaciones fueron realizadas por duplicado y los análisis de los sobrenadantes por triplicado.

2.3    Determinación de calcio fijado

Para cuantificar la capacidad de fijación de calcio de los hidrolizados de las fermentaciones se empleó la técnica reportada por Brown y Rydvist (1981) con ligeras modificaciones. Se mezclaron 2 mL de cloruro de calcio 5 mM con 1 mL de la muestra diluida (1:10) con solución amortiguadora de fosfatos 0.05 M (pH 8). Se incubó la mezcla durante 30 min con agitación de 100 rpm a 22°C. Posteriormente se tomó una alícuota de 10 μL y se le adicionó 1 mL del reactivo de calcio arsenazo III (Diagnostic Chemical Limited, Canadá), finalmente se midió la absorbancia a 650 nm (espectrofotómetro Shimadzu UV-160, Japón) y se cuantificó el calcio no fijado. El calcio total se determinó tomando 10 μL de cloruro de calcio 5 mM y se le adicionó 1 mL del reactivo de calcio arsenazo III. Se elaboró una curva patrón de calcio (0-100μg mL-¹). El calcio fijado se determinó con la ecuación 1.

donde:

C₀ = Concentración de calcio total

C₁ = Concentración de calcio no fijado

2.4    Determinación de hierro fijado

donde:

C₀ = Concentración de hierro total

C₁ = Concentración de hierro no fijado

2.5 Determinación de proteína

La determinación de proteína se realizó por el método de Lowry (1951) con algunas modificaciones. Se mezclaron 100 μL de la muestra con 100 μL de buffer de fosfatos (0.1M), se le adicionó un lml de reactivo de Lowry, el cual fue previamente preparado con 49 mL de Na₂CO₃ al 2% en NaOH 0.1 M, 0.5 mL de CuSCm al 1% y 0.5 mL de tartrato de sodio y potasio (NaKC₄H₄O₆) al 1%. La solución fue incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente se le adicionaron 100 μL de reactivo de Folin (Hycel, México). La reacción nuevamente fue incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente se leyó la absorbancia a 595 nm. Se elaboró una curva patrón de seroalbúmina bovina (0-100 μg mL^-1).

2.6 Determinación de actividadproteolítica

Se determinó por el incremento de grupos amino libres (Adler, 1979). Se mezclaron 2 mL de buffer de fosfatos pH 8.2 con 250 μL de muestra, posteriormente la mezcla fue agitada vigorosamente y se le adicionaron 2 mL de la solución de ácido trinitrobencensulfónico (TNBS) al 0.1% (Fluka, Buchs, Suiza). La mezcla de reacción fue agitada y se incubó a una temperatura de 50°C durante 60 minutos. Los tubos de reacción se mantuvieron aislados de la luz. Para detener la reacción se adicionaron 4 mL de HC1 0.1N. Se leyó la absorbancia a 340 nm. Se elaboró una curva patrón utilizando una solución de glicina 3mM con 1% de SDS.

2.7 Estimación del peso molecular de los péptidos generados

Se realizó una cromatografía de exclusión molecular para estimar el peso molecular de los péptidos generados durante las fermentaciones con un cromatografo (Lab Alliance, EUA) y un detector de arreglo de diodos UV-Visible (SpectraSystem UV6000 LP, EUA). La columna utilizada fue la BioSep SEC-S-2000 con un tamaño de 300 x 7.80 mm (Phenomenex®, EUA). Se utilizó un buffer de fosfatos (0.1M, pH 6.8) como fase móvil. El flujo de trabajo utilizado fue de 0.9 mL min^-1.

2.8 Análisis estadístico

Se realizaron pruebas de análisis de varianza (α=0.05) con el programa estadístico NCSS 2000 (Hintze, 2001) para determinar si existían diferencias significativas en el porcentaje de hierro fijado y la concentración de calcio fijado durante las fermentaciones. Se estimó la correlación existente entre la actividad proteolítica y la concentración de calcio fijado o el porcentaje de hierro fijado por los péptidos producidos durante las fermentaciones con el programa Office Excel 2007 (Microsoft, EUA).

3 Resultados y discusión

3.1 Producción de péptidos fijadores de calcio

Se llevaron a cabo fermentaciones con dos diferentes condiciones de pH con Lactococcus lactis subsp. cremoris NCFB 712, a una de ellas se le controló el pH, al valor óptimo de la proteinasa ligada a pared celular (pH = 6.2) (Kunji y col., 1996), mientras que el pH en la fermentación sin control varió de 6.44 a 5.01 a las 28 h de fermentación (Fig. 1). Se evaluó el grado de fijación de calcio de los sobrenadantes obtenidos de las fermentaciones, y se observó un aumento en la concentración de calcio que puede ser fijado por las muestras de la fermentación con control de pH a partir de la octava hora de fermentación hasta las 24 h. Este mismo efecto se observó en la fermentación sin control de pH pero en menor proporción. Esto se corroboró al realizar el análisis estadístico encontrándose que la concentración de calcio fijado por los sobrenadantes de las fermentaciones es significativamente diferente a las 16, 24 y 28 h, siendo mayor la concentración de calcio fijado en la fermentación con control de pH. Las máximas concentraciones de calcio fijado fueron de 0.28 mmoles de Ca²⁺ mg-¹ de proteína en la fermentación con control de pH y de 0.23 mmoles de Ca²⁺ mg-¹ de proteína para la fermentación sin control de pH, ambos valores se alcanzaron a las 24 h de fermentación. Se ha visto que el grado de fijación de calcio al péptido se encuentra muy relacionada con el grado de fosforilación de la caseína de la que se obtuvo el péptido, selección de la enzima con la cual fueron obtenidos los fragmentos peptídicos y de las condiciones en las que se llevan a cabo los estudios de interacción péptido-mineral como: el pH, temperatura y fuerza iónica (Kitts, 2006).

En un trabajo realizado por Kim y Lim (2004) donde se estudió el hidrolizado tríptico de proteínas del suero de la leche, se encontró que se producen péptidos fijadores de calcio con pesos moleculares entre 3.4 y 1.4 kDa. Los péptidos pueden fijar entre 0.1 a 2 mmoles de Ca²⁺ mg-¹ de proteína. Por lo que las concentraciones de calcio fijado encontradas en esta investigación con Lactococcus lactis subsp. cremoris NCFB 712 se encuentran dentro del intervalo de valores reportado por dichos autores.

Dimitrov (2009) realizó un estudio para determinar la capacidad fijadora de calcio de sobrenadantes ultrafiltrados de leches fermentadas con cepas de bacterias lácticas, encontrando cepas que presentaban fracciones peptídicas con mayor capacidad de fijación de calcio, entre las cepas que mostraron tener una mayor actividad se hallaban cepas de Lactobacillus helveticus, Lactococcus lactis y Lactobacillus casei; la máxima concentración de calcio fijado por los sobrenadantes de Lactococcus lactis fue de 20.68 mmoles de Ca²⁺ mL^-1. Se calcularon los valores de calcio fijado en las fermentaciones realizadas con Lactococcus lactis subsp. cremoris NCFB 712, los cuales van de 3.36 a 23.8 mmoles de Ca²⁺ mL^-1 en la fermentación con control de pH y de 3.70 a 15.52 mmoles de Ca²⁺ mL^-1 para la fermentación sin control de pH. Se observó que los valores máximos obtenidos de calcio fijado por los sobrenadantes de las fermentaciones con control de pH son muy similares al obtenido por la cepa de Lactococcus lactis reportada por Dimitrov (2009).

Se determinó la correlación entre el calcio fijado y la actividad proteolítica, debido a que se ha reportado que puede existir una correlación entre la actividad proteolítica y la actividad biológica de los péptidos (Pihlanto y col., 2010). Se encontró una correlación de 0.967 para la fermentación con control de pH (Fig. 2) y de 0.830 para la fermentación sin control de pH (Fig. 3). Esto nos indica que la producción de péptidos fijadores de calcio está relacionada con la actividad proteolítica de la proteinasa de pared celular de Lactococcus lactis subsp. cremoris NCFB 712.

3.2 Producción de péptidos fijadores de hierro

En el inicio de la fermentación se observó un alto porcentaje de hierro fijado (30%), debido a que la leche contiene proteínas que tienen la capacidad de ligar hierro, como la α-lactoalbúmina, la β-lactoglobulina y la lactoferrina. Los porcentajes máximos de hierro fijado en las fermentaciones con control de pH y sin control son 60 y 38 % respectivamente.

Existen pocos trabajos acerca de la capacidad de fijación de hierro por péptidos generados durante la fermentación o hidrólisis enzimática de las proteínas de la leche. Farvin y col. (2010) demostraron que las fracciones peptídicas del yogurt tenían la capacidad de fijar hierro (7.7%), sin embargo utilizaron otra técnica para la determinación de hierro y la cantidad de proteína de los sobrenadantes utilizados era menor al encontrado en las fermentaciones realizadas en esta investigación con Lactococcus lactis subsp. cremoris NCFB 712.

Liu y col. (2005) determinaron la capacidad fijadora de hierro de los sobrenadantes de las muestras obtenidas a diferentes tiempos durante la elaboración de kéfir con leche de vaca y soya cuyo contenido proteico era 10 mg mL^-1. En este estudio no se encontraron incrementos significativos en la actividad fijadora de hierro de las muestras de kéfir cuando son comparadas con las muestras sin fermentar (26%). Aunque no se puede comparar la actividad fijadora de hierro obtenido por los sobrenadantes del kéfir con los obtenidos por los sobrenadantes las fermentaciones de esta investigación con Lactococcus lactis subsp. cremoris NCFB 712 si se observa claramente que las fermentaciones con control de pH presentan una mejor actividad fijadora de hierro, lo cual no se observa en las fermentaciones realizadas sin control de pH.

Por otro lado, se encontró que en este caso no existe correlación entre la actividad proteolítica y el porcentaje de hierro fijado. Esto se debe a que la capacidad fijadora de las proteínas presentes, observada desde el inicio de la fermentación, es más alta que la de los péptidos producidos (Fig. 4).

3.3 Comparación de los péptidos encontrados con péptidos fijadores de minerales reportados

Por medio de la cromatografía de exclusión molecular se estimó el peso molecular de los péptidos generados durante las fermentaciones realizadas con Lactococcus lactis subsp. cremoris NCFB 712. En la Fig. 5 se observa el cromatograma del sobrenadante obtenido a la 28 h en ambas fermentaciones, en donde se pudo observar que los perfiles peptídicos de las fermentaciones realizadas mostraban diferencias sobre todo en la concentración de algunos de los péptidos producidos durante la fermentación, aunque también se observaron diferencias en los pesos moleculares de los péptidos generados en ambas fermentaciones. Los pesos moleculares de los péptidos producidos en las fermentaciones fueron comparados con péptidos fijadores de minerales reportados, encontrándose varias coincidencias (Tabla 1). En la Tabla 1 se hace una compilación de los reportes más relevantes al respecto y como se puede observar dentro de los fragmentos peptídicos de las fermentaciones realizadas con control de pH, se encuentran dos fragmentos fijadores de minerales muy comúnmente producidos por medio de la hidrólisis enzimática con pepsina o tripsina a partir de la caseína, que son las secuencias β-CN(1-25) y α_s1-CN(59-79). Estos fragmentos contienen en su secuencia el triplete amónico SerP-SerP-SerP, que se reporta como responsable de la unión de los minerales divalentes al péptido (Kitts, 2006). Sin embargo se ha visto que existen otros sitios potenciales para la fijación de los minerales dentro de la estructura de los péptidos, como los grupos carboxílicos libres del ácido glutámico y aspártico, pero su actividad es menor (Kitts, 2006).

Se debe mencionar que también existen secuencias peptídicas que coinciden con péptidos fijadores de minerales derivados de la proteínas del suero, los cuales han sido estudiados en los últimos años como fuentes de péptidos fijadores de minerales ya que también se ha visto que las proteínas del suero de la leche presentan sitios en donde se puede fijar el calcio, estos sitios se encuentran en la β-lactoglobulina (β-LG) y la α-lactoalbúmina (α-LA). En la α-LA existe un sitio que tiene una alta afinidad por el calcio, los aminoácidos en donde se fija este mineral son la asparagina y la lisina (Kim y Lim, 2004).

Conclusiones

En este trabajo se encontró que durante la fermentación con Lactococcus lactis subsp cremoris NCFB 712 se generaron secuencias peptídicas que tienen la capacidad de fijar hierro y calcio. Con respecto a las fermentaciones efectuadas para evaluar la actividad fijadora de calcio se observó que en los sobrenadantes de las fermentaciones con control de pH se produjo un incremento en esta actividad. También se determinó que existe una correlación entre la actividad proteolítica y el calcio fijado encontrándose una mayor correlación con los sobrenadantes de las fermentaciones con control de pH. En cuanto a la actividad fijadora de hierro, se observó que en las fermentaciones con control de pH se incrementó la actividad con respecto a las fermentaciones realizadas sin control, en las que se mantuvo la actividad propia de la leche. Los pesos moleculares de algunos péptidos producidos durante las fermentaciones con Lactococcus lactis subsp. cremoris NCFB 712 coincidieron con algunas secuencias fijadoras de calcio y hierro reportadas.

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