Desarrollo temprano de las cavidades cardiacas ventriculares. Importancia de la Neuregulina 1

Early development of cardiac ventricles. Importance of neuregulin 1

Arlett Del Olmo-Turrubiarte,^1,2 Concepción Sánchez-Gómez,² Briseida López-Martínez,³ Alejandra Contreras-Ramos²

¹ Posgrado en Biología Experimental,Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa
² Laboratorio de Investigación en Biología del Desarrollo y Teratogénesis Experimental ]]> ³ Laboratorio Central, Hospital Infantil de México Federico Gómez

México D.F., México

Autor de correspondencia:
Dra. en C. Concepción Sánchez Gómez
Correo electrónico: csgomez_2000@yahoo.com

Fecha de recepción: 05-02-13 ]]> Fecha de aceptación: 05-03-13

Resumen

Introducción. Los defectos septales ventriculares graves, asociados con un ventrículo hipoplásico y otro hiperplásico o con la ausencia total del tabique interventricular, suelen ser incompatibles con la vida embrionaria y fetal. Pese a su gravedad, no se conocen sus causas. Por marcaje in vivo en embriones de pollo se confirmó la importancia de las trabéculas en la morfogénesis del tabique interventricular. Por manipulación genética en embriones de ratón y aves se determinó que la ausencia de la Neuregulina 1 (NRG1) o sus receptores, además de provocar escasa diferenciación de los miocitos ventriculares y deficiente formación de las trabéculas, determina la muerte prematura del embrión. Con base en estos antecedentes, el objetivo fue determinar el papel real de NRG1 en la trabeculogénesis temprana y su importancia en la regulación de la proliferación y apoptosis.

Métodos. Se estableció un modelo de órgano cultivo de corazón de embrión de pollo previo al inicio de la trabeculogénesis. Se realizaron ensayos de inhibición total de la actividad de NRG1 endógena y posterior adición de la proteína exógena a diferentes concentraciones, determinando la actividad cíclica de los miocitos ventriculares con el antígeno nuclear de proliferación celular y la apoptosis con lisotraker.

Resultados. El suero fetal bovino promueve la proliferación, pero impacta negativamente la trabeculogénesis. La adición de NRG1 a concentraciones bajas y períodos cortos de incubación no induce trabeculogénesis. En contraste, a concentraciones medias y períodos de cultivo no mayores a 24 horas, tiene un efecto positivo sobre este proceso. También promueve la proliferación y evita la apoptosis del miocardio ventricular. El incremento en la concentración de NRG1 posiblemente provoca un desbalance molecular que favorece la proliferación desordenada pero no la trabeculogénesis.

Conclusiones. El entendimiento del papel de NRG1 en la trabeculogénesis aporta datos para conocer las redes moleculares involucradas también en el desarrollo del tabique interventricular, información indispensable para entender el origen de los defectos septales ventriculares graves.

Palabras clave: trabeculogénesis ventricular, NRG1, cardiogénesis temprana.

Abstract

Methods. An embryonic chicken heart organ culture system at the age prior to the beginning of the trabeculogenesis process was established. Endogenous activity of NRG1 was inhibited in the organ cultures that were then stimulated with NRG1 at different concentrations. Myocyte proliferation was determined using the proliferating cell nuclear antigen and apoptosis with LysoTracker (LTR).

Results. Fetal bovine serum promotes proliferation but negatively impacts trabeculogenesis. Low concentration of NRG1 and short periods of incubation do not induce trabeculogenesis. In contrast, average NRG1 concentrations and cultivation periods not exceeding 24 h have a positive effect on the onset of this process. This also promotes myocardial proliferation but avoids apoptosis. Higher concentrations of NRG1 possibly cause a molecular imbalance that favors untidy proliferation but not trabeculogenesis.

Conclusions. Understanding of the role of NRG1 on ventricular trabeculogenesis provides valuable information for the molecular pathways also involved in IVS development. This information is essential for understanding the origin of serious ventricular septal defects.

Key words: ventricular trabeculogenesis, NRG1, early cardiogenesis.

Introducción

Las cardiopatías congénitas que involucran al tabique interventricular (TI-V) se denominan defectos septales ventriculares. Se encuentran entre las malformaciones congénitas más comunes y tienen gran impacto en la morbilidad y mortalidad pediátricas.¹ Su frecuencia se aproxima a 0.8 por cada cien nacidos vivos.^1,2 Su complejidad depende de la región del TI-V en que se manifiestan. Los defectos septales relacionados con la región trabeculada del tabique (tercios medio y apical) pueden ser muy sencillos si se encuentran formando pequeñas comunicaciones a lo largo de esta zona. También los hay extremadamente graves y complejos que suelen asociarse a un ventrículo hipoplásico y otro hiperplásico. Incluso, hay casos en los que el TI-V está totalmente ausente.¹ Estas patologías casi siempre son incompatibles con la vida desde las etapas embrionaria y fetal. No obstante, actualmente no existe una explicación convincente sobre el origen de estas enfermedades, a pesar de que se han dedicado múltiples esfuerzos de investigación clínica y básica a desentrañar esta incógnita. En el ámbito de la investigación básica, el tema se ha abordado estudiando el desarrollo trabecular y del TI-V, pues se sabe que los defectos congénitos se forman durante la embriogénesis. De esta manera, se conoce que los esbozos trabeculares comienzan a formarse poco después que ha concluido el proceso de torsión y plegamiento cardiaco; es decir, alrededor del estadío 16-17HH en el corazón de embrión de pollo.^3,4 El primer indicio es la aparición de pequeños grupos de miocitos separados por espacios estrechos aparentemente vacíos. Después incrementa el tamaño y longitud de los grupos de miocitos, se proyectan hacia la cavidad ventricular y permanecen cubiertos por endocardio en su superficie distal, en contacto directo con la cavidad ventricular, dando origen a incipientes esbozos trabeculares. Estos comienzan a alargarse y los espacios van siendo cubiertos por endocardio. A medida que los esbozos se elongan, se van ramificando para formar trabéculas cada vez más diferenciadas.^3,5 Con referencia al desarrollo del TI-V, Contreras y colaboradores, mediante marcaje in vivo , confirmaron la importancia de las trabéculas en este proceso y describieron que las trabéculas, al elongarse y ramificarse, se van adhiriendo progresivamente a una trabécula central hasta formar el TI-V primitivo que se remodela, incrementa de longitud y es alcanzado por los cojines del canal atrioventricular para transformarse en el TI-V definitivo.⁵ Además, al analizar la actividad cíclica de los miocitos durante el desarrollo del tabique, los mismos autores descubrieron dos picos de proliferación: el primero encaminado a la formación de los esbozos trabeculares (estadíos 16-17HH) y el segundo, posterior al estadío 26HH, involucrado en la expansión de las cavidades ventriculares y elongación del TI-V.⁶ En el aspecto molecular, estudios recientes han demostrado que señales moleculares del endocardio hacia el miocardio ventricular inician la formación de las trabéculas.⁷ Una de las proteínas directamente involucradas es la Neuregulina 1 (NRG1), proteína de la familia del factor de crecimiento epidermal. Mediante estudios de cultivo in vitro se descubrió que dicha proteína promueve la organización de sarcómeros y la concomitante diferenciación de miocitos ventriculares, tanto de adultos como de recién nacidos.^8,9 Así mismo, se determinó que NRG1 es sintetizada por el endocardio de atrios y ventrículos y su acción sobre el miocardio puede ser autocrina o paracrina. La transducción de la señal promovida por NRG1 depende de receptores ErbB que, para ser funcionalmente activos, deben formar homodímeros (ErbB4/ErbB4) o heterodímeros (ErbB2/ErbB4 o ErbB3/ErbB4).^10-12 En concordancia con estos hallazgos se encontró que ratones nulos de cualquiera de las isoformas de NRG1 o sus receptores (ErbB2, ErbB4) mueren antes del día 11 de la embriogénesis, debido a la escasa diferenciación de los miocitos ventriculares y la deficiente formación de trabéculas.¹³ También, al inactivar la función de NRG1 mediante retrovirus en embriones de pollo, se provocaron anomalías cardiacas similares a las del ratón.¹⁴ En contraste, ratones mutantes condicionales delectando ErbB2 o ErbB4 en los miocitos ventriculares fetales, a pesar de completar la gestación, presentaban un ventrículo dilatado con baja actividad contráctil, aunque sin afectación aparente del TI-V.^15-17 Pese a toda esta información, aún queda por definir el papel real de NRG1 en la morfogénesis de los esbozos trabeculares. Con el propósito de investigar este aspecto, se realizaron estudios de inhibición e inducción de la actividad de NRG1 en un modelo de órgano-cultivo de corazón de embrión de pollo de estadío 16-17HH, coincidente con el inicio del desarrollo de los esbozos trabeculares. Para inhibir la actividad de NRG1 se utilizaron un anticuerpo y un siRNA específicos. Los ensayos de inducción se llevaron a cabo adicionando NRG1 α/β a diferentes concentraciones. Además, se determinó el efecto de NRG1 sobre la actividad cíclica y apoptótica de los miocitos ventriculares en este mismo período. Se descubrió que NRG1, a concentraciones medias, tiene un efecto positivo sobre la trabeculogénesis inicial, induce la proliferación y evitar la apoptosis del miocardio ventricular. Sin embargo, el incremento en la concentración de NRG1 posiblemente provoca una desregulación molecular que no favorece la morfogénesis de las trabéculas sino la proliferación desordenada.

Métodos

Material biológico

Anticuerpos

Se utilizaron los anticuerpos anti-Neuregulin-1, IgG de cabra policlonal (Santa Cruz CA, USA); anti-PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular), IgG2a de ratón monoclonal (BioGenex, USA); Heregulin beta 1 recombinante, (Neo Markers Fremont CA, USA).

Inclusión en Paraplasto

Las muestras fueron fijadas con Bouin alcohólico, para llevar a cabo estudios de histología o formalina neutra, para análisis por inmunohistoquímica. Se deshidrataron con alcoholes graduales, se transparentaron con aceite de cedro, cloroformo/parafina (1:1) y se incluyeron en parafina Paraplasto. Los corazones fueron orientados en posición ventral para obtener cortes frontales en cuatro cámaras de 5 µm de grosor, empleando micrótomo (Microm HM315).

Histología

Las laminillas, una vez desparafinadas y rehidratadas, se tiñeron con hematoxilina/eosina (H/E). Se tomaron micrografías a 10x y 100x empleando un sistema de captura digital acoplado al microscopio (Olympus BH2) con un lente de 1.7x.

Órgano cultivo

Con el propósito de establecer las condiciones adecuadas de cultivo que permitieran un desarrollo armónico de la región trabecular, los embriones de pollo de estadío 16HH se extrajeron del cascarón y se colocaron en solución fisiológica Ringer de aves (NaCl, KCl, CaCl₂). Los corazones fueron disecados y lavados con amortiguador de fosfatos (PBS) estéril adicionado con antibiótico (penicilina-estreptomicina a 0.1%). Después, se incubaron a 37°C y 5% de CO₂ en cajas de cultivo de 8 pozos en 0.3 ml de medio líquido (DMEM) suplementado con antibiótico y suero fetal bovino (SFB) a diferentes concentraciones (2%, 4%, 6%). Se incubaron por 12 horas. Posteriormente, se eliminó el medio de cultivo y los corazones fueron lavados con PBS 1X y fijados inmediatamente en Bouin alcohólico para elaborar cortes histológicos seriados y evaluar el desarrollo trabecular. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado. Los corazones de embriones de pollo en estadíos 16HH a 18HH cultivados in ovo fueron empleados para conocer las características histológicas de este órgano y compararlas con los tejidos cultivados in vitro .

Inducción con NRG1α/β exógena

Evaluación de la actividad cíclica de los miocitos ventriculares

Basados en las instrucciones del fabricante (EnVision™ Stain System, Dako, USA), las laminillas con muestra fueron tratadas con solución de citratos a presión (15 lbs/pulg²) para liberar el antígeno. Después de los lavados con PBS-tween 20, se inhibió la actividad de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno 0.1% (Dako, USA); a continuación, se incubó de 5 a 10 min con solución bloqueadora de proteínas (Biogenex, USA) y con el anticuerpo primario (Anti-PCNA) durante 30 min. Posterior a los lavados, el polímero acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) fue incubado 30 min. El complejo de reacción fue visualizado con una solución de 3-3' diaminobecidina (DAB) como cromógeno. Las laminillas se montaron con PBS/glicerol 1:1 y se tomaron micrografías a 40x empleando un sistema de captura digital acoplado al microscopio (Olympus BH2) con un lente de 1.7x.

Análisis de la apoptosis

Los corazones obtenidos del cultivo de ensayos de inducción de actividad de NRG1 fueron incubados a 37°C con Lisotraker (LTR) 1M (Molecular Probes, USA) en DMEM durante una hora, lavados con PBS 1X, fijados con formalina neutra e incluidos en parafina para obtener cortes histológicos seriados de 5 µm. Las preparaciones fueron analizadas en un microscopio confocal, empleando un láser de excitación de 594 nm, una emisión de 633 nm y el programa LSM 510.

Resultados

Características histológicas del corazón cultivado in ovo

El corazón del embrión de pollo en estadíos 16-17HH cultivado in ovo mostró la pared miocárdica ventricular relativamente delgada, conformada por 2 a 3 células de grosor y cubiertas internamente por endocardio (Figura 1 A-B). Doce horas más tarde (estadío 18HH), la región ventricular presentó una delgada capa compacta y pequeñas protuberancias de miocardio rodeadas de endocardio que se proyectaban a la luz ventricular, denominadas esbozos trabeculares (Figura 1 C-D).

Condiciones de órgano cultivo

Los corazones de estadío 16-17HH cultivados in vitro por 12 horas tuvieron una organización tisular diversa, dependiendo de la cantidad de SFB adicionado (Figura 2). Los controles cultivados en medio DMEM sin SFB no aumentaron de tamaño. Sin embargo, aunque su pared miocárdica ventricular incrementó de grosor, era poco compacta y presentaba pequeños espacios libres de miocitos en la superficie opuesta al endocardio. No se llegaron a organizar esbozos trabeculares individuales (Figura 2 A-A'). El SFB produjo crecimiento del corazón e incremento del grosor de la pared miocárdica ventricular (con escasa compactación y mayor desorganización al incrementar la concentración del SFB) (Figura 2 B-B', C-C', D-D').

Inducción con NRG1α/β exógena

El corazón en estadío 16-17HH cultivado en DMEM libre de SFB -empleado como control para analizar el posible proceso inductivo de NRG1 sobre el miocardio ventricular cuando se cultivó por 12 o 24 horas- fue capaz de desarrollar incipientes esbozos trabeculares delimitados por endocardio (Figura 3 A-B). Sin embargo, al prolongar el período de incubación hasta 36 horas, los esbozos mostraron una incipiente desorganización histológica y pérdida de la individualidad (Figura 3C). Al adicionar NRG1 exógena (Heregulin beta 1), previa inhibición de su actividad endógena, se encontró que la menor concentración empleada (5 ng) en cultivos de 12 horas no fue suficiente para inducir crecimiento del tamaño del corazón; tampoco afectó el grosor de la pared miocárdica ventricular ni la trabeculogénesis (Figura 3D). A las 24 horas de incubación, no creció el corazón ni incrementó el grosor de la pared compacta ventricular, pero se observaron incipientes esbozos trabeculares bastante bien organizados (Figura 3E). Sin embargo, al prolongar el cultivo hasta 36 horas, los corazones mostraron una pared ventricular completamente desorganizada en la que no se distinguió ni el miocardio compacto ni esbozos trabeculares (Figura 3F). La concentración media de NRG1 (10 ng) en los cultivos de 12 horas fue suficiente para inducir no solamente un crecimiento en el tamaño del corazón con un notable aumento de grosor de la pared miocárdica, sino también provocó trabeculogénesis incipiente, con esbozos trabeculares mejor organizados en los cultivos de 24 horas (Figura 3 G-H). En contraste, a las 36 horas, aunque incrementó el tamaño del corazón y el grosor de la pared compacta ventricular, no se notaron trazos de esbozos trabeculares (Figuras 3I). Finalmente, todos los cultivos adicionados con 20 ng de NRG1 generaron corazones con nula trabeculogénesis. En este caso, el miocardio ventricular compacto tenía varias capas de grosor, que se diferenciaban del miocardio en contacto directo con la luz ventricular, relativamente laxo y completamente desorganizado (Figura 3 J-K). En los cultivos de 36 horas, la pared compacta fue poco menos gruesa (Figura 3L).

Con la finalidad de determinar si la NRG1 está involucrada en la regulación de la proliferación y apoptosis durante la formación de los esbozos trabeculares y el incremento en el grosor de la pared miocárdica ventricular, se llevaron a cabo experimentos de inducción de la actividad de NRG1. Después de 12 horas, se evaluó la actividad cíclica empleando PCNA y la apoptosis mediante marcaje con LTR. Los corazones cultivados con DMEM sin SFB mostraron características histológicas similares a las descritas previamente. Además, manifestaron alta positividad a PCNA y prácticamente nulo marcaje de LTR (Figura 4 A-D). En cambio, en los corazones en los que se inhibió parcialmente la función de NRG1 endógena, además de presentar escasa trabeculogénesis, se redujo severamente la actividad cíclica de las células y comenzaron a manifestarse algunos focos de apoptosis (Figura 4 E-H). En contraste, cuando se inhibió totalmente la actividad de NRG1 adicionando simultáneamente anti-NRG1 y siRNA, no se notaron indicios de trabeculogénesis ni actividad cíclica del miocardio. Sin embargo, el marcaje de LTR mostró un incremento notable (Figura 4 I-L). Finalmente, al adicionar 10 ng de NRG1 exógena a los cultivos previamente inhibidos, se apreciaron indicios de trabeculogénesis acompañados de elevada positividad al PCNA y prácticamente nulo marcaje de LTR (Figura 4 M-P).

Discusión

Los esbozos trabeculares comienzan a formarse poco después que ha concluido el proceso de torsión y plegamiento cardiaco, es decir, alrededor del estadío 16-17HH en el corazón de embrión de pollo.^3,4,19 Inicialmente, el miocardio trabeculado ventricular sirve tanto para incrementar la oxigenación del tejido cardiaco previo a la formación de las arterias coronarias como para separar el flujo sanguíneo en las cámaras cardiacas antes de que se forme el TI-V. Así mismo, en la actualidad se ha documentado el papel que juegan las trabéculas en el desarrollo del TI-V.^5,6 En los casos extremos en que no se forman las trabéculas o su desarrollo es deficiente, se afecta directamente la cardiogénesis temprana y se provoca la muerte prematura del embrión o bien, si se altera la morfogénesis del TI-V se originan defectos septales ventriculares. De ahí la importancia de conocer las redes moleculares que regulan la trabeculogénesis. Con base en lo anterior, en el presente trabajo se planteó como objetivo determinar el papel de NRG1 en la trabeculogénesis y su posible función en la regulación de la proliferación celular y apoptosis del miocardio ventricular, procesos indispensables en el desarrollo de trabéculas y TI-V.

Inicialmente, se implementó un modelo de órgano-cultivo del corazón de embrión de pollo en estadío 16-17HH in vitro , por ser la etapa en la que aún no existen esbozos trabeculares. En esta etapa fue posible analizar el efecto inductivo de NRG1 en la trabeculogénesis. Se notó que el corazón cultivado en DMEM sin SFB, manifestó un retraso de aproximadamente 6 horas respecto de lo que ocurre in ovo y conservó la estructura y características citodinámicas similares a las del corazón en estadío 17HH, cuando se observaron los primeros indicios de trabeculogénesis (Figura 2 A-A'). En contraste, el SFB adicionado al órgano-cultivo, en concordancia con lo reportado en la literatura, tuvo un efecto mitogénico en los miocitos cardiacos ventriculares.^20,21 No obstante, provocó un crecimiento descompensado del corazón y ocasionó pérdidas de compactación y extrema desorganización del miocardio de la pared ventricular. Estos resultados indicaron un efecto negativo de SFB en la trabeculogénesis, hecho que determinó que en los cultivos de los ensayos de inducción de la actividad de NRG1 no se empleara SFB.

Una vez establecido el modelo de órgano-cultivo, se analizó el efecto de la NRG1α/β exógena. Por tanto, primero se inhibió la actividad endógena de la proteína, así como la síntesis de nueva proteína adicionando al medio un anticuerpo primario y un siRNA específicos. Se observó que las concentraciones bajas de NRG1 exógena (5 ng/ml) y los tiempos cortos de cultivo (12 horas) no son suficientes para inducir la formación de los esbozos trabeculares (Figura 3 D-F). Así mismo, las concentraciones altas de NRG1 exógena (20 ng/ml) generaron, desde un principio, el crecimiento elevado del corazón, pero con una evidente desorganización celular. Además, no se formaron trabéculas delimitadas por endocardio; en su lugar se observaron abundantes miocitos altamente desorganizados (Figura 3 J-L). Respecto de los cultivos adicionados con 10 ng/ml de NRG1, se observó que el corazón incrementó en tamaño y conservó su morfología. La pared miocárdica, además de manifestar alta actividad cíclica, mostró esbozos trabeculares en desarrollo que mantenían su individualidad; sin embargo, dicha característica se perdió al cultivar el corazón por más de 24 horas (Figura 3 G-I). Estos resultados permitieron concluir, en concordancia con los resultados de Gassmann y colaboradores y Lee y colaboradores en ratones knockout ,^12,13 que la NRG1 a concentraciones intermedias puede tener un efecto inductor de la trabeculogénesis inicial, aunque no parece estar involucrada en el desarrollo ulterior de las trabéculas, pues su efecto se redujo en los cultivos que duraron más de 24 horas. Otra posibilidad es que la capacidad inductora de NRG1 en la trabeculogénesis dependa de la actividad sinérgica de esta proteína con el factor de crecimiento similar a la insulina, también secretado por el endocardio, como lo sugirieron inicialmente Herting y colaboradores²² y, recientemente, Li y colaboradores.²³

La adición excesiva de NRG1 no provocó mayor trabeculogénesis, aunque sí incrementó la actividad mitótica del miocardio. Estos hallazgos permiten suponer que el exceso de NRG1 provoca un desequilibrio molecular, que sobrepasa la capacidad morfogenética del miocardio para formar las trabéculas, y privilegia la proliferación desordenada.

El análisis de la actividad cíclica mediante la inmunodetección de PCNA y la apoptosis por LTR en el órgano-cultivo de corazones en estadío 16-17HH reveló que la actividad cíclica del miocardio disminuye cuando se inhibe la función de NRG1, parcial o totalmente, mientras que la muerte celular se incrementa (Figura 4G, H, K, L). En contraste, cuando se indujo la sobreexpresión de NRG1 se notó una elevada actividad mitótica y nula apoptosis (Figura 4 O-P). Estos resultados concuerdan con lo observado en cultivos primarios de cardiomiocitos de neonatos por Zhao y Lemke, quienes concluyeron que la NRG1 induce la proliferación del miocardio y protege contra la apoptosis.¹⁴

Los hallazgos de este trabajo muestran un papel importante de NRG1 en el inicio de la trabeculogénesis promoviendo, además de la proliferación del miocardio, una actividad protectora contra la apoptosis. Sin embargo, es importante resaltar que el exceso de NRG1 provoca un desequilibrio molecular que puede privilegiar la proliferación del miocardio sobre la morfogénesis inicial de las trabéculas ventriculares. De esta manera, el entendimiento del papel de NRG1 y su desregulación durante la cardiogénesis temprana -ya sea por exceso o carencia- continúa siendo una prioridad de la investigación básica para aportar datos que permitan conocer las redes moleculares involucradas en la trabeculogénesis y ulterior desarrollo del TI-V.

Agradecimientos ]]>
A la técnica Lucía Lima García, por su apoyo en las técnicas histológicas.
Al Financiamiento Fondos Federales Institucionales HIM/20007/006.
Al Programa de Becas de inicio a la Investigación (PROBEI), que otorgó una beca a Arlett Del Olmo de agosto del 2008 a diciembre de 2009.

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