Comparación del efecto de osmorreguladores e inhibidores del crecimiento en la conservación in vitro de caña de azúcar

Comparison of effect of osmoregulators and growth inhibitors on in vitro conservation of sugarcane

Jericó Bello-Bello^1*, Wilberth Poot-Poot², Lourdes Iglesias-Andreu², Humberto Caamal-Velázquez³, María de la Cruz Diaz-Sanchez⁴

¹ Campus Córdoba. Colegio de Postgraduados. 94946. Veracruz, México. *Autor responsable (jericobello@gmail.com).

³ Campus Campeche. Colegio de Postgraduados. 24450. Campeche, México.

⁴ Laboratorio de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales de Caña de Azúcar del Ingenio San Rafael de Pucté, Domicilio Conocido, Othón P. Blanco, Chetumal, Quintana Roo, México. C.P. 77980.

Recibido: mayo, 2013.
Aprobado: abril, 2014.

Resumen

Los sistemas de conservación in vitro son una alternativa para preservar el germoplasma de la caña de azúcar (Saccharum spp.) y el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de los osmorreguladores manitol y sorbitol (0, 15, 30 y 45 g L^-1) y los inhibidores del crecimiento vegetal ácido abscísico (ABA) y paclobutrazol (PAC) (0, 1, 2 y 3 mg L^-1) sobre el crecimiento in vitro de caña de azúcar. Para ello se usaron brotes in vitro de 2 cm de altura de la variedad Mex-69-290 obtenidos en fase de multiplicación y en todos los casos se empleó el medio MS (Murashige y Skoog). El diseño experimental fue completamente al azar con 10 explantes por tratamiento, con los datos se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) y una comparación de medias con la prueba de Tukey (p≤0.05). A los 180 d de cultivo se evaluó el porcentaje de supervivencia, el número y longitud de los brotes, número de hojas, número y longitud de las raíces. El análisis de los resultados mostró que el aumento en las concentraciones de los osmoreguladores causó una reducción dependiente de la concentración en todas las variables evaluadas. Para los inhibidores, los tratamientos con PAC mantuvieron 100 % de supervivencia, promoviendo el número de brotes por explante. Esto contrastó con los tratamientos con ABA donde disminuyeron las variables evaluadas. La reducción en altura y presencia de brotes axilares observada en los tratamientos con PAC sería de interés para la conservación in vitro, y se concluye que el uso de PAC puede ser una nueva alternativa para la conservación in vitro del germoplasma de esta especie.

Palabras clave: Saccharum sp., sorbitol, manitol, ácido abscísico, paclobutrazol.

Abstract

In vitro conservation systems are an option for preserving sugarcane germplasm (Saccharum sp.). The objective of this study was to assess the effect of the osmoregulators manitol and sorbitol (0, 15, 30 and 45 g L^-1) and the plant growth inhibitors abscisic acid (ABA) and paclobutrazol (PAC) (0, 1, 2 and 3 mg L^-1) on in vitro growth of sugarcane. The plants used were 2 cm tall in vitro shoots of the variety Mex-69-290 obtained in the multiplication phase. In all cases MS (Murashige and Skoog) medium was used. The experimental design was completely random with 10 explants per treatment. Data were analyzed with an analysis of variance (ANOVA) and means were compared with the Tukey test (p≤ 0.05). After 180 d of culture, survival percentage, number and length of the shoots, number of leaves, and number and length of roots were assessed. Analysis of the results showed that an increase in concentrations of osmoregulators produced a decrease in all of the variables assessed. For the inhibitors, the PAC treatments maintained 100 % survival and promoted more shoots per explant. This contrasted with the ABA treatments in which the assessed variables decreased. Reduction in height and presence of axillary shoots observed in treatments with PAC may be of interest for in vitro conservation, and, it is concluded that the use of PAC would be a new option for in vitro conservation of sugarcane germplasm.

Key words: Saccharum sp., sorbitol, manitol, abscisic acid, paclobutrazol.

INTRODUCCIÓN

Los recursos fitogenéticos de la caña de azúcar (Saccharum sp.) son la base del desarrollo de los programas de mejoramiento genético y de producción de semilla en esta especie (Flores, 2001). El cultivo de tejidos vegetales (CTV) es una herramienta de la biotecnología que se puede aplicar a los esquemas de conservación in vitro de germoplasma (Pence et al., 2002), para lo cual se requiere reducir el crecimiento de las células o tejidos para prolongar los periodos entre subcultivos y disminuir los costos durante el proceso de conservación in vitro.

Una alternativa para reducir la tasa de crecimiento in vitro es usar inhibidores del crecimiento como el ácido abscísico (ABA) (Pence et al., 2002; Sarasan et al., 2006; Barrueto y Carvalho, 2008) y el paclobutrazol (PAC) (Ziv, 2000). El PAC pertenece al grupo de los triazoles, actúa como un retardador de crecimiento bloqueando la síntesis del ácido giberélico (AG), el cual es transportado por el xilema y puede ser absorbido por las hojas, tallos o raíces (Jankiewicz, 2003). Además, el PAC se usa en el cultivo de tejidos vegetales por su efecto positivo en la inducción de los procesos de organogénesis y embriogénesis somática (Ziv, 2000). Los métodos de crecimiento mínimo y crioconservación de caña de azúcar fueron evaluados por González-Arnao et al. (1999), García et al. (2004) y Sarwar y Siddiqui (2004), pero en la literatura revisada no hay estudios comparativos sobre el uso de compuestos con efecto de estrés osmótico (osmorreguladores) e inhibidores del crecimiento que demuestren su eficiencia durante la conservación in vitro de esta especie.

Un aspecto importante cuando se establece un protocolo de conservación in vitro es mantener en el tiempo un número reducido de plántulas sin afectar su supervivencia. El método de conservación convencional del germoplasma in vitro es laborioso por el alto número de subcultivos y costos energéticos cuando la refrigeración se usa para reducir la temperatura. La crioconservación requiere un suministro constante de nitrógeno líquido cuyo uso no es rentable en laboratorios comerciales.

El Laboratorio de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales de Caña de Azúcar del Ingenio San Rafael de Pucté, Chetumal, Quintana Roo, México, ha establecido más de 80 accesiones in vitro, que incluyen híbridos nacionales y extranjeros. Esta cifra aumenta sistemáticamente con las nuevas variedades generadas de los programas de mejoramiento genético en este cultivo. Por ello, el objetivo del presente estudio fue mantener la supervivencia y reducir la tasa de crecimiento in vitro de los brotes para la conservación de germoplasma de la caña de azúcar a través de un estudio comparativo entre osmorreguladores (manitol y sorbitol) e inhibidores del crecimiento vegetal (ABA y PAC).

MATERIALES Y MÉTODOS

Área de trabajo y material vegetal

Este estudio se realizó en el Laboratorio de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales de Caña de Azúcar del Ingenio San Rafael de Pucté, ubicado en Chetumal, Quintana Roo, México (18° 30' 13" N; 88° 18' 19" O). Los explantes usados fueron brotes in vitro de 2 cm de altura de caña de azúcar var Mex 69-290 generados después de tres subcultivos de meristemos apicales (0.5-0.8 mm) en medio MS (Murashige y Skoog, 1962), más un suplemento de 0.2 mg L^-1 de benzilaminopurina (BAP), según la metodología de Jiménez et al. (1995).

Efecto de agentes osmóticos e inhibidores de crecimiento sobre la tasa de crecimiento in vitro

Los agentes osmóticos fueron manitol y sorbitol (Sigma^®) a 0, 15, 30 y 45 g L^-1, y los inhibidores del crecimiento fueron ABA (Sigma^®) y PAC (Syngenta^®) a 0, 1, 2 y 3 mg L^-1. En todos los experimentos se usaron tubos de ensayo de 22x220 mm con tapa de polipropileno (MOLLER^®), conteniendo 15 mL de medio MS y 0.22 % (p/v) de Gelrite™ (Sigma^®) como agente gelificante y se esterilizaron 15 min en autoclave a 1.5 kg cm^-2 de presión y 121 °C. El pH de los medios de cultivo fue 5.8. Los recipientes de cultivo, con un brote cada uno, fueron incubados a 24±2 ^oC y se mantuvieron con luz fluorescente (40-50 μmol m^-2 s^-1) y un fotoperiodo de 16 h luz. Después de 180 d de incubación se evaluó el porcentaje de supervivencia y la tasa de crecimiento in vitro de los brotes. Los testigo fueron brotes desarrollados en medio basal MS sin agentes osmóticos ni inhibidores.

Los brotes sobrevivientes fueron transferidos a fase de enraizamiento, colocando cada brote en medio MS adicionado con 3 mg L^-1 de ácido indolacético (AIA). Finalmente, las vitroplantas fueron aclimatadas en invernadero y transferidas a campo bajo condiciones de riego.

Análisis estadístico

El diseño experimental fue completamente al azar, los tratamientos se describen en el Cuadro 1, y se usaron 10 explantes por tratamiento. Los experimentos se realizaron por triplicado, con los datos se realizó un ANDEVA y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05) usando SPSS v. 11.5 para Windows.

Los dos osmorreguladores afectaron negativamente supervivencia y crecimiento de plántulas, lo cual se acentuó al aumentar las concentraciones de estos compuestos (Cuadro 1). Los tratamientos con 15, 30 y 45 g L^-1 de manitol mostraron supervivencias de 80, 70 y 43 %. No hubo diferencias significativas para el número de brotes en las concentraciones de manitol evaluadas. Sin embargo, 30 y 45 g L^-1 de manitol causaron diferencias significativas en longitud de los brotes, número de hojas, número y longitud de las raíces (Figura 1A). En los tratamientos con sorbitol el comportamiento fue similar, pero en los tratamientos con 15, 30 y 45 g L^-1 la supervivencia fue 90, 83 y 66.5 % más alta que el testigo, respectivamente, aunque con 30 y 45 g L^-1 hubo una reducción gradual en la altura de las plantas (Figura 1B).

Resultados similares fueron observados por Skalova et al. (2012) durante la conservación in vitro de yacón (Smallanthus sonchifolius), excepto que la concentración de sorbitol y manitol fue 10 y 20 g L^-1 en medio MS. En papa (Solanum tuberosum L.) con 40 g L^-1 de sorbitol en medio MS al 50 % de su concentración afectó el número de brotes y la altura de las plantas (Iciobanu y Constantinovici, 2012). En ajo (Allium sativum L.) Hassan et al. (2007) reportan una reducción del crecimiento y mayor número de raíces en plantas tratadas con 36.5 y 72.8 g L^-1 de sorbitol. Según Sarwar y Siddiqui (2004), 10 g L^-1 de manitol mejora la sobrevivencia in vitro de la variedad Katha. Este comportamiento se puede explicar por los mecanismos de la caña de azúcar para metabolizar los azúcares alcoholes como el manitol y sorbitol, que a bajas concentraciones puede favorecer el desarrollo de las plantas (Lemos et al., 2002). Un aumento en las concentraciones de manitol in vitro afectan la supervivencia y la altura de las plantas de caña de azúcar variedad C87-51 (García et al., 2004). En este estudio no hubo diferencias (p>0.05) en el número de brotes utilizando diferentes concentraciones de manitol, pero hubo un efecto negativo sobre la altura de las plantas al aumentar a 30 g L^-1 las concentraciones de este osmoregulador.

Todos los tratamientos con PAC mostraron 100 % de supervivencia, aunque hubo diferencias significativas en número de brotes, longitud de los brotes, número de hojas y longitud de las raíces. Los brotes obtenidos en los tratamientos con PAC mostraron una coloración verde intenso y un aspecto vigoroso durante su cultivo (Figura 1C), debido probablemente a la relación entre el PAC y la acumulación de clorofila causado por la reducción de la elongación celular (Fletcher y Gilley, 2000).

Los tratamientos con 1, 2 y 3 mg L^-1 de ABA causaron 80, 73 y 53 % de supervivencia. Las variables longitud de los brotes, número de hojas, número y longitud de las raíces mostraron diferencias significativas, aunque la longitud de raíces no cambió significativamente (Figura 1D).

In vitro, PAC induce procesos de morfogénesis en el CTV. Lorenzo et al. (1998), al establecer un protocolo para la formación de brotes de caña de azúcar variedad C-1051-73 con un sistema de inmersión temporal, observaron que la adición de 1 mg L^-1 de PAC aumentó el número de brotes por explante. Moosikapala y Te-chato (2010) evaluaron in vitro la conservación de brotes de pasto vetiver (Vetiveria zizanioides Nash.) y encontraron que 3 mg PAC L^-1 causaron un mayor número de brotes a los 12 meses de cultivo.

Según Gopal et al. (2005), el crecimiento in vitro de papa se redujo al adicionar 2.11 mg ABA L^-1, mientras que Keatmetha et al. (2006) reportan que 1 mg ABA L^-1 redujo el crecimiento de mangostán (Garcinia mangostana) sin afectar la supervivencia y el número de brotes por explante in vitro. Barrueto y Carvalho (2008) observaron que 5 y 8 mg de ABA L^-1 in vitro reducía el número y la longitud de los brotes de la yuca (Manihot esculenta Grantz), lo que sugería que estas concentraciones son adecuadas para la inducción in vitro de la dormancia de brotes de esta especie. El ABA impacta varios procesos fisiológicos de las plantas y uno relevante es el cierre de estomas, el cual puede disminuir la capacidad fotosintética y reducir el crecimiento vegetal. Adicionalmente, un incremento en la concentración de ABA altera el balance hormonal, provocando efectos negativos en el crecimiento y diferenciación celular (Swamy y Smith, 2005; Rai et al., 2011). Una aplicación de ABA es la conservación in vitro, lo cual se debe a su efecto de retardar el crecimiento vegetal (Rai et al., 2011).

En el presente estudio, los agentes osmóticos evaluados y el ABA disminuyeron los porcentajes de supervivencia a medida que aumentaba su concentración en el medio de cultivo, pero este efecto no fue observado al utilizar PAC. Al respecto, Jaleel et al. (2007) señalan que, in vitro, las plantas tratadas con este compuesto presentan ventajas adaptativas a ciertas condiciones desfavorables como la tolerancia a temperaturas extremas, sequía, salinidad y ataque por patógenos. Por ello, triazoles como el PAC son considerados como agentes protectores a estrés abiótico (Fletcher y Gilley, 2000) y su uso, a diferencia del manitol, sorbitol y ABA, puede ser una alternativa nueva para la conservación in vitro de germoplasma de este importante cultivo porque en condiciones normales, en un medio MS sin osmorreguladores e inhibidores del crecimiento, esta especie debe ser transferida a medio fresco cada 45 d.

Los brotes sobrevivientes en todos los tratamientos produjeron raíces y mostraron 95 % de supervivencia durante la etapa de aclimatización. Las vitro-plantulas aclimatadas tuvieron un aspecto vigoroso (Figura 2A) y se desarrollaron normalmente cuando fueron transferidas al suelo (Figura 2B).

Las plantas de caña de azúcar variedad Mex 69290 fueron conservadas in vitro bajo condiciones de lento crecimiento causado por paclobutrazol, el cual retardó el crecimiento sin afectar la supervivencia. Por lo tanto, este sistema permite mantener colecciones de germoplasma viable con una mínima inversión de tiempo y recursos, manteniendo subcultivos cada 180 d.

Las plántulas conservadas in vitro pueden ser transferidas a medio de multiplicación para obtener una fuente ilimitada de material vegetal requerido para el establecimiento de un semillero básico, intercambio de germoplasma o programas de mejoramiento genético.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a la Biol. Estefani García-Rodríguez por su apoyo técnico en laboratorio. Al Colegio de Postgraduados Campus Campeche por el financiamiento otorgado a través de la Línea Prioritaria de Investigación 5 Biotecnología microbiana, vegetal y animal.

LITERATURA CITADA

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