Producción de biodiésel a partir de microalgas y una cianobacteria cultivadas en diferentes calidades de agua

Biodiesel production from microalgae and a cyanobacteria grown in different qualities of water

Manuel Sacristan-de Alva¹, Víctor M. Luna-Pabello^1* , Erasmo Cadena-Martínez¹, Alejandro F. Alva-Martínez²

¹ Laboratorio de Microbiología Experimental, Departamento de Biología, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México. 04510. Coyoacán, Ciudad de México, México. * Autor responsable. (lpvictor@unam.mx)

Recibido: octubre, 2013.
Aprobado: marzo, 2014.

Resumen

La producción de biodiésel, a partir de microorganismos fotosintéticos, es un tema de creciente investigación. No obstante, las implicaciones de la remoción de nutrientes y capacidad de acumulación de lípidos se desconocen cuando los microorganismos se cultivan en aguas residuales municipales respecto de su cultivo en un medio enriquecido. En el presente estudio se evaluó el potencial de dos especies de microalgas, Chlorella vulgaris y Scenedesmus acutus, y de una cianobacteria, Arthrospira maxima, para remover nutrientes y acumular lípidos, útiles para producir biodiésel, al cultivarse en dos calidades de agua residual, cruda (ARC) y tratada (ART), comparadas con un medio enriquecido (AE) con fertilizante comercial. Los cultivos se realizaron en volúmenes de 1 L, con fotoperiodos de luz:oscuridad de 12 h:12 h. Con los resultados se realizó un ANDEVA y las medias de los tratamientos se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05). Los cultivos en ARC mostraron: 1) la productividad mayor de biomasa (p≤0.05) con 5. acutus (1.28 g L ) y C. vulgaris (p<0.05) with 5. acutus (1.28 g L ) and C. vulgaris (1.15 g L ¹), para A. maxima los valores fueron similares en (1.15 g L ¹), for A. maxima values were similar to RWW ARC (0.93 g L ¹) y AE (0.96 g L ¹) (p>0.05), la mayor tasa de incremento de biomasa correspondió a C. vulgaris (0.200.27 d ¹) para los tres medios de cultivo (p<0.001), y para S. acutus y A. máxima fue entre 0.06 y 0.14 d ¹; 2) la eficiencia mayor de remoción de nutrientes, superior a 60 % de fósforo y 90 % de nitrógeno orgánico (p ≤ 0.05) para todos los microorganismos; 3) la acumulación mayor de lípidos (p ≤ 0.05) en S. acutus 28.3 %, C. vulagris 22.4 % y A. máxima 13.8 %; 4) la más alta producción de biodiésel (entre 109.4 y 244.6 mg L ¹) para los tres microorganismos.

Palabras clave: aguas residuales, Arthrospira maxima, biodié-sel, Chlorella vulgaris, remoción de nutrientes, Scenedesmus acutus.

The biodiesel production from photosynthetic microorganisms, is a topic of increasing research. However, the implications of nutrient removal and lipid accumulation capacity are unknown, when microorganisms are grown in municipal wastewater with respect to be grown in a rich medium. In the present study the potential of two species of microalgae Chlorella vulgaris and Scenedesmus acutus and a cyanobacterium, Arthrospira maxima, were evaluated to remove nutrients and accumulate lipids, useful for producing biodiesel, when growing into two wastewater qualities, raw (RWW) and treated (TWW), compared with an enriched medium (EM) with commercial fertilizer. The cultures were performed in volumes of 1 L, with photoperiods of light:dark of 12 h:12 h. With the results an ANOVA was carried out and treatment means were compared with Tukey's test (p≤0.05). The cultures in RWW showed: 1) the higher biomass productivity (0.93 g L ¹) and EM (0.96 g L ¹) (p>0.05), the highest rate of biomass increase corresponded to C. vulgaris (0.20 to 0.27 d" ^X) for the three culture media (p≤0.001), and for S. acutus and A. maxima was between 0.06 and 0.14 d ¹; 2) the higher efficiency of nutrient removal, over 60 % of phosphorus and 90 % of organic nitrogen (p≤0.05) for all microorganisms; 3) higher lipid accumulation (p≤0.05) for S. acutus, 28.3 %, C. vulgaris 22.4 % and A. maximum 13.8 %; 4) the higher production of biodiesel (between 109.4 and 244.6 mg L ¹) for the three microorganisms.

Key words: wastewater, Arthrospira maxima, biodiesel, Chlorella vulgaris, nutrient removal, Scenedesmus acutus.

INTRODUCCIÓN

El agotamiento de los combustible fósiles lleva a las industrias y los científicos a investigar el desarrollo de tecnologías para obtener fuentes energéticas renovables (Zah et al., 2007). En México, el objetivo del Programa Especial para el Aprovechamiento de Energías Renovables es fomentar dichas fuentes energéticas y la producción de biocombustibles con un enfoque técnico, económico, ambiental y socialmente viable. El programa plantea aumentar el porcentaje de la capacidad instalada en el país de estas alternativas de energía limpia en 29 % de la capacidad de generación prevista para el 2018 (SENER, 2013). Un ejemplo de estas tecnologías es la utilización de biomasa procedente de cultivos agrícolas para la producción de bioetanol o biodiésel (Antoni et al., 2007). Este sistema presenta un impacto significativo en el potencial del cambio climático, además interviene en otras problemáticas ambientales, como la eutrofización, el agotamiento de recursos naturales y la ecotoxicidad. Pero compite con otros cultivos alimenticios por el uso de la tierra cultivable, aspecto que disminuye su potencial como tecnología (Crutzen et al., 2008).

Una alternativa es usar microalgas como materia prima, ya que pueden aplicarse en zonas no aptas para los cultivos tradicionales y alcanzan tasas de crecimiento altas (0.5 a 1.2 d ~ ¹) (Chisti, 2007; Flynn et al., 2010). Sin embargo, muchas tecnologías de cultivo de microalgas involucran el uso de agua no contaminada, fertilizantes e inyección de CO2 para su crecimiento, lo cual eleva el costo de la producción de biomasa algal y reduce su atractivo como tecnología (Chen et al., 2011). Para minimizar estos inconvenientes, una alternativa de cultivo es usar aguas residuales municipales, de la agricultura y la ganadería, donde las microalgas pueden desarrollarse aprovechando los nutrientes en este tipo de descargas. Esta integración permite: 1) tratar las aguas residuales; 2) obtener un efluente de alta calidad; 3) generar biomasa algal útil para producir biodiésel o biogás (Sydney et al., 2011).

Hay estudios relacionados con sistemas basados en análisis desarrollados sobre el cultivo de microal-gas de una sola especie y usando un medio enriquecido, a escala de laboratorio y piloto (Rawat et al., 2011). Pero la evaluación comparativa del cultivo de microalgas en aguas residuales con cultivos en un medio enriquecido desde una perspectiva de la productividad de biomasa, la acumulación de lípidos para producir biodiésel, así como la mejora de la calidad del agua (mediante la remoción de nutrientes), no se ha analizado simultáneamente. Para cianobacterias hay investigaciones sobre cultivos enriquecidos y resulta técnicamente viable para la obtención de biocombustible (Al-Thani y Potts, 2012). La hipótesis para este estudio fue que no hay diferencias significativas en la remoción de nutrientes ni en la capacidad de acumular lípidos entre microalgas y cianobacterias. Por tanto, el objetivo del estudio fue evaluar comparativamente el potencial de dos especies de microalgas, Chlorella vulgaris y Scenedesmus acutus, y de una cianobacteria, Arthrospira maxima, así como determinar su eficiencia de remoción de nutrientes y su capacidad para acumular lípidos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para el crecimiento por separado de los tres microorganismos se emplearon tres medios de cultivo: 1) una descarga de agua residual cruda después de un tratamiento de cribado y sedimentación (ARC), 2) agua residual tratada en un sistema de lodos activados convencional (ART), y 3) agua enriquecida (AE) con nutrientes (fertilizante, NPK 20-20-20). ARC y ART fueron recolectadas de una planta de tratamiento de aguas residuales municipales convencional del tipo lodos activados, ubicada en la Ciudad Universitaria, UNAM (Ciudad de México). El AE fue preparada usando agua destilada a la cual se le agregó el fertilizante comercial hidrosoluble marca Peters® NPK 20-20-20 (Scotts-Sierra) en una concentración de 1.5 g L^-1, equivalente a 300 mg L ^-1 de nitrógeno (4 % de nitrógeno amoniacal, 6 % de nitratos y 10 % de urea), 131 mg L^-1 de fosfatos (P₂O₅), 250 mg L^-1 de potasio (K2O) y trazas de magnesio, boro, cobre, hierro, manganeso, molibdeno y zinc (Trainor y Wilmes, 1994).

Microorganismos de prueba

En este estudio se cultivaron dos especies de microalgas (Chlorella vulgaris y Scenedesmus acutus) y una cianobacteria (Arthrospira máxima). La cepa de C. vulgaris usada se aisló del Lago de Cuitzeo, estado de Michoacán, S. acutus fue obtenida de los canales de Xochimilco, Ciudad de México, y A. máxima fue aislada del Lago Nabor Carrillo, Estado de México.

Cultivo de los microorganismos y diseño experimental

Los cultivos se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 2 L, en los cuales se adicionó 1 L de ARC, o ART o AE y se inoculó con 100 mL (700 mg L^-1, correspondiente a 3.5 x 10⁶ células mL ¹) de cada una de las tres cepas por separado, generando nueve tratamientos (cada uno por triplicado). Los cultivos se mantuvieron con aireación constante a una temperatura de 25 ± 5 °C y bajo fotoperiodos de luz:oscuridad de 12 h:12 h. Para la iluminación se usaron lámparas fluorescentes T8 marca Phillips de 32 W, con una iluminancia de 37 klx.

El crecimiento se realizó hasta que los cultivos alcanzaron la fase estacionaria en ARC y ART (a los 16 d), debido a que en esta fase los microorganismos realizan la mayor acumulación de lípidos (Mansour et al., 2005).

of each of the three strains separately, generating nine treatments (each in triplicate). Cultures were maintained with constant aeration at a temperature of 25 ± 5 °C and under photoperiods of light: dark 12 h:12 h. For lighting, Philips T8 32W fluorescent lamps were used, with an illuminance of 37 klx.

The growth was performed until the cultures reached stationary phase in RWW and TWW (at 16 d), because in this phase the microorganisms do most of the lipid accumulation (Mansour et al, 2005).

Eficiencia de remoción de nutrientes

Determinación del crecimiento de los microorganismos

El crecimiento de la biomasa se determinó cada dos días por gravimetría. Las muestras fueron homogeneizadas por medio de un agitador magnético (Thermolyne, modelo Cimarec® 2). Después se tomó una muestra de 10 mL, se filtró (filtro Millipore, de 0.045 µm) para separar la biomasa del medio de cultivo y fueron secadas (en una estufa a 60 °C) para determinar el peso seco.

La tasa de aumento de biomasa por día (r), basada en la biomasa en peso seco (en todos los experimentos), fue calculada con la ecuación exponencial de Krebs (1985):

donde, ln es el logaritmo natural, N₀ corresponde a la densidad de la población inicial y N_t equivale a la densidad después del tiempo t (días). Para cada réplica se consideraron los primeros sietes días de cultivo, correspondientes a la fase exponencial de crecimiento (Dumont et al., 1995).

Separación de la biomasa del medio de cultivo

La separación de la biomasa se realizó mediante un método de coagulación—floculación usando quitosano (Sigma-Aldrich®) en una concentración de 20 mg L^-1 (Divakaran y Pillai, 2002).

Extracción de los lípidos de la biomasa

Los lípidos fueron extraídos de la biomasa seca usando una mezcla de cloroformo:metanol (2:1) (J.T. Baker) y un sonicador Fisher Scientific 60 Sonic Dismembrator a 25 W (Pittsburgh, Pensilvania, USA) durante 1 min. Después se filtró la muestra con un filtro GF/F Whatman de 0.7 µm y en el filtrado se agregó una disolución de NaCl (J.T. Baker) al 0.9 % y se recolectó la fase orgánica. Esta fase orgánica se evaporó usando un rotavapor marca Büchi R-124 (Flawil, Suiza) con un baño de agua caliente Büchi waterbath B-480 (Flawil, Suiza) (Moazami et al, 2011; Zhou et al., 2012). Los remanentes luego de la evaporación del disolvente fueron nuevamente extraídos con hexano (J.T. Baker) y filtrados usando un filtro GF/F Whatman de 0.7 µm. El contenido de lípidos se determinó por gravimetría.

La producción del biodiésel fue calculada teóricamente con base en la eficiencia de la reacción de transesterificación (transformación de los lípidos en biodiésel) equivalente a 87.7 %, multiplicada por la concentración de lípidos extraida de la biomasa de cada microorganismo (Sacristán et al., 2013).

Análisis estadístico

Con los resultados obtenidos se realizó un ANDEVA y las medias de los tratamientos se compararon con la prueba de Tukey (p<0.05), usando el programa JMP v.10 (SAS Institute, Inc.). Todas las determinaciones se realizaron por triplicado y los resultados se presentan como valores medios con su desviación estándar.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Crecimiento y productividad de la biomasa

En el cultivo de C. vulgaris (Figura 1A) con ARC se obtuvo una productividad de biomasa seca (69.8 mg L^-1 d^-1) mayor que en el medio enriquecido (AE) (53.8 mg L^-1 d ^-1) y en ART (50.5 mg L^-1 d ^-1) y en esta última se produjo la cantidad menor de biomasa. En estudios realizados en laboratorio en condiciones controladas, la productividad de biomasa de C. vulgaris varió de 170 a 200 mg L^-1 d ^-1 en cultivos usando un medio enriquecido (Rodolfi et al., 2009). Dicha productividad es 2.7 veces mayor que la encontrada en los cultivos en ARC.

La productividad mayor de biomasa de S. acutus (Figura 1B) se obtuvo en ARC (61.5 mg L^-1 d ^-1), superior a las otras dos calidades de agua. Esto puede deberse a que en el agua residual la microalga crece de forma heterótrofa y mixótrofa (Park et al., 2011), pero en AE creció sólo de manera autótrofa (debido a que la única fuente de carbono fue CO2). La productividad máxima de S. acutus en el presente estudio fue 74 % menor que la reportada por Rodolfi et al. (2009), de 210 a 260 mg L^-1 d ^-1, y Scenedesmus sp. fue cultivada en un medio enriquecido. Sin embargo, Kim et al. (2007) reportan una productividad de 6 mg L ¹ d ¹ para la misma especie cultivada en orina fermentada de cerdos.

La productividad de biomasa en los cultivos con A. maxima en ARC y AE (Figura 1C) fueron muy similares, 64.6 y 62.6 mg L^-1 d ^-1, respectivamente, mientras que, como en los casos anteriores, el cultivo en ART presentó el crecimiento menor. Dichos valores fueron inferiores comparados con productividades de biomasa de 210 mg L^-1 d ^-1 (Gouveia y Oli-veira, 2009) y 250 mg L^-1 d ^-1 (Griffiths y Harrison, 2009), ambas con cultivos en laboratorio y usando un medio enriquecido.

Las tasas de incremento de biomasa para C. vulgaris en ARC y ART coinciden con los intervalos (0.25-0.3 d^-1) encontrados por Lau et al. (1995) y He et al. (2013). En cambio, para S. acutus la diferencia entre este estudio y el de Shama-la et al. (1982) (0.74 d^-1 en agua tratada) y Doria et al. (2012) (0.31 d^-1 en agua enriquecida y 0.21 d^-1 en agua residual) fue 60 % mayor. La cia-nobacteria A. maxima presentó una diferencia 50 % mayor respecto del estudio realizado por Vonshak (2003) (0.4 d^-1 en agua residual). Pero las tasas de incremento de biomasa son aparentemente simples de medir, tienen la desventaja de que pueden generar incertidumbre respecto a la diferencias de bio-masa inicial, el número de células o el peso total. De acuerdo con Flynn (2006) y Flynn et al. (2010), las tasas de incremento representan la dinámica de los cultivos de las microalgas, siempre que sean estables.

Eficiencia de remoción de nutrientes

En todos los casos los cultivos en AE presentaron porcentajes de remoción inferiores al 50 % para fosfato, nitratos y nitrógeno orgánico y amoniacal (Cuadro 2). Esto se debió principalmente a que los cultivos se interrumpieron cuando los microorganismos llegaron a su fase estacionaria en el agua residual (ARC y ART) pero AE seguía en fase logarítmica.

La remoción mayor del fósforo se alcanzó en ARC (más del 60 % en todos los casos). Lo mismo ocurrió con la degradación de los nitratos y el nitrógeno orgánico y amoniacal, aunque la reducción en ARC fue muy similar a la alcanzada en ART (más de 90 % en C. vulgaris y cercano a 70 % en A. maxima) (Cuadro 2).

En los cultivos con ARC hubo una alta remoción de compuestos químicamente oxidables medidos como DQO (77 %), lo que indica un crecimiento bajo condiciones heterótrofas (Park et al., 2011). El medio enriquecido no contenía carbono orgánico, por lo cual el valor de DQO obtenido para este cultivo se debió a otros tipo de compuestos oxidables, como los nitrogenados. La disminución del valor de DQO en AE fue ligeramente superior al alcanzado en ART para C. vulgaris y A. maxima (Cuadro 2).

Acumulación de lípidos

La acumulación de lípidos siguió el mismo patrón en todos los casos y los cultivos en ARC mostraron los porcentajes mayores de acumulación y los de ART tuvieron los resultados más desfavorables (Cuadro 3). De acuerdo con esos resultados, la prueba con S. acutus y ARC alcanzó el mayor porcentaje de acumulación de lípidos y fue significativamente diferente (p≤0.05).

En experimentos con C. vulgaris el contenido de lípidos varía de 18.4 a 19.2 % con una productividad de biomasa de 0.17 a 0.20 g L^-1 d^-1 (Rodolfi et al., 2009) o un contenido de lípidos de 42 % con 0.69 g L^-1 de biomasa (Feng et al., 2011). En ambos casos el cultivo se realizó en reactores de laboratorio bajo condiciones controladas (en el primero usando un medio de cultivo enriquecido y en el segundo agua residual artificial). En el primer experimento, el contenido de lípidos fue menor al obtenido en el presente estudio usando ARC (22.4 %), pero la productividad de biomasa fue mayor a la alcanzada en esta prueba (0.09 g L^-1 d^-1). En el segundo experimento, el contenido de lípidos fue más alto que en el presente estudio, pero el contenido de biomasa fue menor (1.15 g L^-1), con lo cual la acumulación de lípidos muy similar en ambos casos (0.27 g L^-1) (Cuadro 3).

El contenido de lípidos en Scenedesmus sp. varía de 20 a 21 % (Gong y Jiang, 2011) y de 19.6 a 21.1 % (Rodolfi et al., 2009), en cultivos en laboratorio y condiciones controladas. Estos resultados fueron similares a los de cultivos de S. acutus utilizando AE, pero menores a los obtenidos en ARC. Rawat et al. (2011) usaron microalgas cultivadas en agua residual artificial y el contenido de lípidos fue 12.8 %, similar al del presente estudio para ART, pero bastante menor que lo encontrado para ARC (Cuadro 3). Para los cultivos de C. vulgaris en ARC y de S. acutus en AE, los porcentajes de lípidos fueron similares entre si (p≤0.05).

Los contenidos de lípidos de A. maxima empleando AE y ARC fueron superiores a los reportados por Gouveia y Oliveira (2009) y Verma et al. (2010) donde los valores fluctuaron entre 4 a 9 % y 6 a 7 %, respectivamente, para cultivos desarrollados en laboratorio y bajo condiciones controladas. Sin embargo, en los cultivos de A. maxima en ART se obtuvo el menor porcentaje de lípidos (7.5 %), y fue estadísticamente diferente a los demás (Cuadro 3).

Cálculo teórico de la producción de biodiésel

Con la cantidad de biomasa y el contenido de lípidos obtenidos, con cada microalga y la ciano-bacteria en los diferentes medios de cultivo (Cuadro 4), se puede calcular la concentración de biodiésel teórica. Bajo este supuesto, se observa que para los tres microorganismos se obtendría una mayor cantidad de biodiésel al realizar los cultivos en ARC, donde existe un crecimiento hete-rótrofo que conlleva a la acumulación de lípidos (Cuadro 4). Para AE, la cantidad de biodiésel sería 34 % menor que en ARC, debido a que el crecimiento de los microorganismos es autótrofo (sin estrés), por lo que la acumulación de lípidos es menor (Zhou et al., 2012). La cantidad más baja de biodiésel se obtendría con los cultivos en ART (bajo contenido de carbono), siendo este el medio con la menor concentración de nutrientes (Cuadro 2). Con los cultivos de S. acutus en ARC se alcanzaría la mejor producción de biodiésel (244.57 mg L ¹), mostrando ser una materia prima adecuada para este fin (Cuadro 4).

CONCLUSIONES

La tasa de crecimiento, la remoción de nutrientes y la capacidad de acumular lípidos entre las microalgas y la cianobacteria estudiadas fueron diferentes. En un mismo lapso de tiempo, los cultivos de C. vulgaris, S. acutus y A. maxima en agua residual cruda (ARC) mostraron mejores resultados en el incremento de biomasa y remoción de nutrientes que en el agua enriquecida, por lo cual el uso de ARC como medio para cultivar estas especies es más viable económicamente. Asimismo, la microalga S. acutus presentó una mayor acumulación de lípidos al ser cultivada en ARC, lo cual fue superior al de las especies C. vulgaris y A. maxima. El incremento de biomasa está directamente relacionado con la concentración de nutrimentos, pero no con la concentración de los lípidos en los microorganismos analizados.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo recibido a través de los proyectos: PAPIIT IT103312, PAIP 4194-14 y FQ-10-008, para la realización de este trabajo, así como por la beca recibida por uno de ellos (MSA) para realizar sus estudios de Maestría en Ingeniería Ambiental en el Posgrado de Ingeniería de la UNAM. Asimismo, se hace patente el apoyo proporcionado por el Dr. Eberto Novelo del Laboratorio de Algas Continentales, Ecología y Taxonomía de la Facultad de Ciencias de la UNAM, por la donación de la cepa de la cianobacteria utilizada en este trabajo. Finalmente, se agradece al Dr. Javier Cruz y al M.C. Luciano Hernández de la Facultad de Química de la UNAM, por su valiosa asistencia técnica.

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