QTLs asociados al contenido de carotenos en hojas de maíz (Zea mays L.)

QTLs associated to carotene content in maize leaves (Zea mays L.)

Viridiana Silva-Pérez¹, F. Carlos Gómez-Merino¹, J. Jesús García-Zavala¹, Juan Burgueño-Ferreira², Amalio Santacruz-Varela¹, Natalia Palacios-Rojas², Axel Tiessen^3*

¹ Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México.

³ Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. Unidad Irapuato. Libramiento Norte Carretera Irapuato-León km 9.6. 36821. Irapuato, Guanajuato, México. (atiessen@ira.cinvestav.mx). ^* Autor responsable.

Recibido: mayo, 2011.
Aprobado: abril, 2012.

Resumen

Los carotenos son pigmentos antioxidantes que captan fotones del espectro de luz visible y protegen a los tejidos de las plantas contra la foto-oxidación, lo cual está relacionado con la tasa fotosintética y rendimiento de los cultivos. La biosín-tesis de los carotenos ocurre dentro de los plástidos, donde se sintetizan a partir de la vía mevalónica independiente, con la participación de más de 10 enzimas y un número de factores aún no definidos. Con el objetivo de identificar regiones cromosómicas de maíz (Zea mays L.) asociadas al contenido de carotenos, se midió el contenido de estos compuestos en hojas de 200 líneas endogámicas recombinantes de maíz, provenientes de la cruza B73×Mo17, sembradas en Irapuato, México, en el ciclo primavera-verano 2009. Los QTLs localizados se asociaron a los siguientes compuestos: luteína, α-caroteno, β-caroteno, β-criptoxantina y zeaxantina. El caroteno presente en mayor cantidad en las hojas fue β-caroteno (80 % del total) y el menor β-criptoxantina (0.2 %). En los cromosomas 1, 2, 4, 5, 6 y 8, se detectaron 21 QTLs significativos. En el bin 1.07 se localizó un QTL altamente significativo (p≤0.001) con valor aditivo alto para luteína (-89.16 µg g^-1 PMS, r²≅0.07), α-caroteno (-25.41 µg g^-1 PMS, r²≅ 0.07) y β-caroteno (-674.98 µg g^-1 PMS, r²≅0.09). Un QTL de β-criptoxantina en el cromosoma 8 fue detectado mediante el marcador psy2 que es parálogo de la enzima fitoteno sintasa, y otro QTL coincidió con un QTL evaluado para ácido abscísico, relacionado al gen caroteno dioxigenasa. Se infere que en el genoma de maíz existen factores aún no identificados relacionados al contenido de carotenos en hojas verdes, y los QTLs identificados en este estudio podrían ayudar a encontrar nuevos genes o factores que determinan el contenido de carotenos en hojas de maíz.

Palabras clave: Zea mays, QTLs, caracteres cuantitativos, carotenoides en hojas.

Carotenoids are antioxidant pigments that capture photons from the visible spectrum and protect plant tissues against photo-oxidation, which is related to photosynthesis rate and crop yield. Biosynthesis of carotenoids occurs in plastids, where they are synthesized via the mevalonate-independent pathway, whit more than 10 enzymes and an unknown number of factors are involved. In order to identify chromosome regions of maize (Zea mays L.) associated with carotene content, carotenoids were measured in leaves from 200 maize recombinant inbred lines (RILs), developed from a B73×Mo17 cross and grown in Irapuato, México, during the 2009 spring/summer cycle. Quantitative trait loci (QTLs) found were associated with the following compounds: lutein, α-carotene, β-carotene, β-cryptoxanthin and zeaxanthin. β-carotene (80% of total) was the carotene present in the highest amount in the leaves and β-cryptoxanthin (0.2%) was the lowest. Twenty-one significant QTLs were located in chromosomes 1, 2, 4, 5, 6 and 8. A highly significant QTL (p≤0.001) was located in bin 1.07 with a high additive value for lutein (-89.16 µg g^-1 DW, r² ≅0.07 ), α-carotene (-25.41 µg g^-1 DW, r² ≅0.07 ) and β-carotene (-674.98 µg g^-1 DW, r² ≅0.09 ). A β-cryptoxanthin QTL was located in chromosome 8 using the psy2 marker which is a palarog gene to the phytoene synthase enzyme; another QTL coincided with an abscisic acid QTL related to the carotene dioxygenase gene. It is inferred that in the maize genome there are unknown factors related to carotene content in green leaves, and the QTLs located in this study could help to identify new genes or factors that determine the carotenoid content in maize leaves.

Key words: Zea mays, QTLs, quantitative traits, carotenoids in leaves.

INTRODUCCIÓN

Los carotenoides son pigmentos naturales de color amarillo a rojo producidos por los organismos autótrofos (Farré et al., 2010) y son relevantes en la nutrición humana y animal (HarvestPlus, 2006). Los carotenoides están involucrados en la fotosíntesis, ya sea como antenas accesorias durante la captarecepción de luz o como antioxidantes, y protegen las membranas contra la foto-oxidación (Demmig-Adams y Adams III, 1996). Estos compuestos afectan el rendimiento de las plantas, porque en parte determinan la tasa fotosintética y efciencia en la captura de energía solar (Parry et al., 2010). Además, son precursores de moléculas de señalización en la respuesta de estrés biótico y abiótico, como el ácido abscísico (ABA) (North et al., 2007).

En hojas verdes, la biosíntesis de carotenos ocurre en las membranas internas de los cloroplastos (Gallagher et al., 2004) y se sintetizan por la vía mevalónica independiente (Fraser y Bramley, 2004) (Figura 1). En maíz (Zea mays L.) se conocen varios mutantes de genes involucrados en la ruta de los carotenos en granos y en hojas. El mutante yellow 1 (y1) está asociado con la enzima fitoeno sintasa 1 (PSY) y presenta semillas blancas (Buckner et al., 1996). Los mutantes viviparous 2 (vp2) y viviparous 5 (vp5) presentan endospermo blanco, son deficientes en carotenos y ABA, lo que se refleja en una germinación prematura del grano, y están asociados a la fitoteno desaturasa (PDS) (Li et al., 1996; Hable et al., 1998). El mutante white seedling (w3) tiene endospermo blanco, algunas veces vivíparo, sus hojas son blancas y acumulan fitoteno (Li et al., 1996). El mutante viviparous 9 (vp9), con endospermo blanco, se asocia con la ξ-caroteno desaturasa (ZDS) (Matthews et al., 2003; Li et al., 2007). A pesar de que se conocen muchos mutantes de carotenos en maíz (Figura 1), aún no se han identificado todas las enzimas de la ruta, ni se han mapeado todos los genes relevantes, y sólo se conocen genes de algunas isoformas.

Una manera de localizar regiones en los cromosomas relacionadas con una característica fenotípica específica es mediante la identificación de loci de caracteres cuantitativos (QTL, por sus siglas en inglés). La técnica se basa en el desequilibrio de ligamiento y usa herramientas estadísticas al asociar marcadores moleculares con un fenotipo en particular. Los resultados permiten ubicar regiones cromosómicas que contienen uno o varios genes responsables de la característica cuantitativa de estudio (Collard et al., 2005). En la literatura revisada no se encontraron estudios sobre QTLs de carotenos en hojas de maíz ni en tejidos verdes de otra especie vegetal. Por tanto, el objetivo de esta investigación fue evaluar el contenido de luteína, β-caroteno, α-caroteno, β-criptoxantina, y zeaxantina, así como detectar posiciones de loci de caracteres cuantitativos relacionados con este tejido fotosintético.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se usaron líneas endogámicas recombinantes (RILs, por su siglas en inglés) de maíz derivadas de la población IBM, proveniente de la cruza entre las líneas B73 y Mo17 (Lee et al., 2002). La semilla original de las IBM-RILs se obtuvo del banco de germoplasma Maize Genetics Cooperation Stock Center, EE.UU. Las plantas crecieron en un sustrato de peat moss y vermiculita (proporción 1:1). Los genotipos se sembraron sistemáticamente con cuatro repeticiones cada uno en una maceta (25 cm diámetro, 25 cm altura), en un invernadero con luz solar natural y condiciones de temperatura y humedad semicontroladas, ubicado en Irapuato, México (20° 43' 06.19" N, 101° 19' 44.53" O; 1730 msnm). La población (5.7 plantas m^-2) se mantuvo sin estrés biótico y abiótico, se regó diario, se fertilizó con triple 17 y urea, y se combatió plagas y enfermedades oportunamente.

Muestreo y extracción de carotenos

A los 65 d después de la siembra (DDS) (10ª hoja desarrollada) se obtuvieron muestras de 200 líneas IBM-RILs. Para la cosecha se usaron sólo hojas verdes, saludables y homogéneas. Por cada RIL se mezcló la cuarta hoja de cuatro plantas diferentes. El tejido se colocó en nitrógeno líquido, se trituró y se tomaron dos submuestras que se liofilizaron por 36 h. El tejido seco se molió con un molino Retsch MM 301 (Haan, Alemania) por 30 s a una frecuencia de 1/30 Hz. La extracción de carotenos se realizó de 20 mg de tejido seco, con la técnica modificada de Kurilich y Juvik (1999). Después de agregar 500 µL de etanol más 3, 5-Ditert-4-butilhidroxitolueno (BHT) 1 % y mezclar con agitador tipo vortex, la muestra se colocó a 80 °C por 5 min, se agregaron 20 µL de KOH 80 % y se sometió a 80 °C por 20 min; después la muestra fue colocada en hielo y se añadieron 500 µL de agua destilada a 4 °C. En un primer lavado, se agregaron 500 µL de hexano y en el segundo se usaron 250 µL de hexano. El sobrenadante de 750 µL se separó, se desecó y se resuspendió con 200 µL de etanol absoluto.

Cuantificación de carotenos

Se inyectaron 20 µL de las muestras en un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Agilent Techologies serie 1200, Santa Clara, California, EE.UU.) acoplado a una columna YMC Carotenoid, 5 µm 4.6×150 mm de (Waters, Milford, MA, EE.UU.). Como fase móvil se usó una mezcla de metanol/acetonitrilo/diclorometano/BHT 55/40/5/1 (v/v/v/p) con una elución isocrática de los compuestos a una temperatura de columna de 40 °C. Un detector de arreglo de diodos se usó para registrar la absorbancia a tres longitudes de onda simultáneamente: 420, 450 y 473 nm. Los picos de los cromatogramas se integraron manualmente. Los valores de las áreas a las tres longitudes de onda se promediaron y se usaron para determinar el contenido de los carotenos. Los tiempos de retención se obtuvieron con los estándares puros para α-caroteno (05784), β-caroteno (C4582) y zeaxantina (14681) de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.) y para luteína (0133) y β-criptoxantina (0055) de CaroteNature (Lupsingen, Suiza). Los datos se analizaron con las funciones estadísticas de la hoja de cálculo Excel para obtener un resultado final en microgramos de carotenos por gramo de peso de la materia seca (µg carotenos g^-1 PMS). El contenido total de carotenos se calculó como la suma de luteína, zeaxantina, β-criptoxantina, β-caroteno y α-caroteno.

Análisis estadístico de QTLs

En el análisis de QTLs los valores fenotípicos correspondieron a los datos obtenidos de contenido de carotenos en cada una de las 200 RILs. Los datos genotípicos se basaron en 2039 marcadores moleculares correspondientes a la población IBM-RIL 302 contenidos en la base de datos de maize GDB (www.maizegdb.org). La distancia promedio entre marcadores fue 4.4 cM en los 10 cromosomas. Para localizar QTLs significativos se realizó una regresión lineal simple para cada marcador. Se probó la significancia de cada uno de los coeficientes de regresión asociados al efecto de los marcadores usando ANOVA. Todos aquellos marcadores cuyos p-valores fueron menores a 0.001 se consideraron asociados a QTLs. Los análisis fueron realizados en R-2.11.1 (31 05 2010).

Análisis bioinformático

El análisis bioinformático consistió en analizar la posible asociación de genes conocidos de la ruta de los carotenos con los QTLs obtenidos en este estudio. La localización de los genes y los mutantes se determinó con base en búsquedas en las bases de datos de Maizesequence (http://www.maizesequence.org/) y Maize GDB (http://www.maizeGDB.org/).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Contenido de β-caroteno en hojas

El contenido total de β-caroteno en hojas maduras de maíz fue similar al reportado en hojas maduras de tabaco (Nicotiana tabacum) (Cuadro 1); sin embargo, la concentración fue 10.7 veces mayor al reportado en hojas de plantas jóvenes de Arabidopsis thaliana (Carol et al., 1999) y 50 veces más que en las hojas de Nicotiana glauca (40-65 DDS) (Zhu et al., 2007). Lo anterior, indica que el contenido de carotenos en hojas puede variar considerablemente según la especie, y probablemente también sea afectado por la edad fisiológica de las hojas. Hubo una tendencia similar en el contenido de luteína y en la razón β-caroteno/luteína (Cuadro 1).

La razón β-caroteno/luteína indica la repartición metabólica en las dos ramas de la ruta, y refleja los niveles de actividad y afinidad por el sustrato de las enzimas LYC-E y LYC-B en estos tejidos (Figura 1). Las hojas de maíz tienen una relación mayor de β-caroteno/luteína que contrasta con los valores menores a 1 en hojas de otras especies (Cuadro 1). Esto es interesante, porque para producir el arroz dorado transgénico con alto contenido de carotenos se usó una enzima PSY heteróloga de maíz (Paine et al., 2005) y no una de bacterias o de Arabidopsis thaliana como en otros estudios, lo cual implica que el genoma de maíz puede ser una fuente valiosa de genes para entender la función de los carotenos en otras especies vegetales.

Perfil de carotenos en hojas de maíz de la población IBM-RILs

Después de confirmar que hay fuertes variaciones genéticas en el contenido de β-caroteno y luteína, se analizó el perfil completo de compuestos carotenoides en hojas de las 200 IBM-RILs. El resultado (Figura 2) se muestra como una gráfica boxplot que analiza las medias, las amplitudes intercuartiles y la desviación estándar del contenido de carotenos en las muestras evaluadas.

En relación al contenido total de carotenos medido en las hojas de los IBM-RILs, el β-caroteno fue el metabolito que presentó mayor concentración con base en el peso de la materia seca (80 %), seguido de luteína (17.1 %), zeaxantina (1.4 %), α-caroteno (1.4 %) y β-criptoxantina (0.2 %). Este perfil de compuestos carotenoides contrasta con el típico de granos de maíz, en los cuales la zeaxantina y la luteína son los compuestos dominantes, y el β-caroteno está presente en concentraciones menores (Berardo et al., 2004; Ortiz-Monasterio et al., 2007).

La razón para la dominancia del β-caroteno en las hojas de maíz aún se desconoce; quizá se debe a sus propiedades químicas fuertemente hidrofóbica porque es ubicuo en todos los organismos fototrópicos oxigénicos (Britton, 2009), y por estar íntimamente asociado con los centros de reacción fotosintéticos de las cloroflas, específicamente en el fotosistema II (PS II) de los cloroplastos y la fotoprotección (Trebst y Depka, 1997). La luteína es un compuesto menos hidrofóbico y está asociada con la recepción de luz y su capacidad antioxidante (Telfer et al., 2008; Ruban y Johnson, 2010); también forma parte del PSII y está involucrada en la transferencia de energía de las cloroflas b y a (Polivka y Frank, 2010). La zeaxantina, igualmente menos hidrofóbica que el β-caroteno, está involucrada en la disipación del exceso de energía lumínica capturada durante la fotosíntesis (Ruban y Johnson, 2010), e interviene en la transferencia de energía a la clorofila a (Connelly et al., 1997). La β-criptoxantina y el β-caroteno son hidrofóbicos (Telfer et al., 2008), pero no se les conocen funciones fotosintéticas, razón por la cual posiblemente se encuentran en bajas concentraciones en hojas y presentan una menor actividad antioxidante.

Análisis de QTLs de carotenos

Los marcadores con mayor efecto aditivo para luteína fueron umc2239 en el cromosoma 1 y asg73 en el cromosoma 5. Para los otros compuestos, el mayor valor aditivo (aditividad genética) se encontró para los marcadores umc2239 (β-caroteno y β-caroteno), cdo507b (β-criptoxantina) y mmp169 (zeaxantina). Sobresale el marcador umc2239 ubicado en el bin 1.07, ya que fue altamente significativo (p≤0.0001) y tuvo un valor aditivo alto para α-caroteno, luteína y β-caroteno. En esta región se ubicaron 11 genes que aún no se encuentran disponibles en la base de datos de Maizesequence, los cuales a su vez podrían ser genes regulatorios de algunas de las enzimas de la ruta de los carotenos.

Correspondencia con QTLs previamente reportados para otras características

Algunas características fenotípicas y metabólicas pueden estar relacionadas con el contenido de carotenos, por lo cual se revisó la co-localización de los QTLs con otros reportados. El QTL de zeaxantina (marcador mmp43) se encuentra cerca del rango de marcadores (77 a 115 cM del bin 5.01) de un QTL previamente descrito para Contenido de ABA que presenta un gen candidato de caroteno dioxigenasa (CCD-EST) (Capelle et al., 2010), el cual está involucrado en la ruptura oxidativa de carotenos que permite formar fragancias (β-inonoa, geraniol, β-damascenona). CCD-EST conlleva a la síntesis de fitohormonas (ABA) y estimula el crecimiento de micorrizas, antifungicidas y feromonas (Matthews y Wurtzel, 2007). El marcador asg73 está dentro del intervalo 83 a 122 en el bin 5.02 del QTL Desecación, DW 60_4 que contiene el gen candidato de la dehidrina Rab28, una proteína LEA (Late Embryogenesis Abundant) involucrada en procesos de resistencia a la desecación (Capelle et al., 2010). Los dos ejemplos anteriores sugieren que algunos de los genes ubicados en los marcadores significativos para los IBM-RILs pueden estar involucrados en vías alternas de protección a estrés biótico y abiótico.

Correspondencia con QTLs previamente reportados para granos

El QTL de zeaxantina (mmp43) identificado en este estudio (Cuadro 2) está a una proximidad de 6 a 12 cM de cuatro QTLs de grano (dos de carotenos totales, uno de β-caroteno y otro de luteína) localizados en las RILs de maíz de la cruza By804 × B73 (Chander et al., 2008).

Los QTLs encontrados en hoja no coincidieron con los QTLs descritos en la cruza W64a × A632 para carotenos en grano, donde se identificaron QTLs en el cromosoma 6 (14 a 25 cM), cromosoma 7 (80 a 85 cM) y cromosoma 8 (54 a 88 cM) (Wong et al., 2004). Una posible razón es que la cruza B73 × Mo17 usada en este estudio puede generar QTLs diferentes a los reportados en otras cruzas como la W64a × A632 (Wong et al., 2004), o que las rutas biosintéticas de hoja y de grano se regulen de forma diferente en la planta y existan conjuntos separados de genes y factores que determinen el contenido de carotenos en cada tejido. Un ejemplo es el mutante y1 (PSY) que carece de carotenos en el grano, pero presenta hojas normales, lo cual indica la existencia de diversos parálogos e isoformas para cada paso enzimático expresados diferencialmente en los diversos tejidos. Este fue el caso de la enzima fitoteno sintasa 2 (psy2), para la cual el QTL de β-criptoxantina tuvo una significancia de p=0.0076 (Cuadro 2), probablemente porque en tejidos fotosintéticos sus funciones predominantes son la captación de luz y la foto-protección (Delgado-Vargas et al., 2000). En cambio, en el grano los carotenos son precursores del ABA como se muestra en los mutantes vivíparous 2 y 5 de maíz (Li et al., 1996; Hable et al., 1998). Esta fitohormona, además de asegurar la latencia en semillas, es mediador de la muerte celular programada en el grano de maíz (Young y Gallie, 2000).

Correspondencia de QTLs con enzimas conocidas de la ruta

Se realizó una búsqueda bioinformática en las bases de datos http://www.maizesequence.org y http://www.maizegdb.org (Andorf et al., 2010) para determinar la eventual correspondencia entre los QTLs identificados y las enzimas conocidas de la ruta de los carotenos (Cuadro 3). De los 21 QTLs identificados (Cuadro 2) sólo el QTL correspondiente al marcador psy2 (p=0.007) coincide con la región del gen de fitoeno sintasa 2 (GRMZM2G149317), uno de los 18 genes anotados de la ruta de los carotenos (Cuadro 3). Los demás genes se encuentran a una distancia de más de 800 kb de los picos significativos de los QTLs, lo cual indica la posible existencia de enzimas aún no identificadas que determinan el contenido de carotenos en hojas de maíz, y sus genes codificantes podrían localizarse en los QTLs identificados en este estudio.

El compuesto carotenoide mayoritario en las hojas verdes de maíz es el β-caroteno, mientras que la β-criptoxantina y la luteína se encuentran en menores cantidades, en comparación con los granos de maíz. El análisis estadístico permitió identificar 17 QTLs localizados en los cromosomas 1, 2, 4, 5, 6 y 8; de estos QTLs, cinco correspondieron a α-caroteno, tres a luteína, dos a β-caroteno, seis a β-criptoxantina y dos a zeaxantina. Se encontraron dos QTLs en el cromosoma 1 y 2 de β-caroteno y α-caroteno. En el cromosoma asociado al marcador umc2239 se observó un QTL de luteína, el cual fue el más significativo y presentó el mayor valor aditivo en luteína, α-caroteno y β-caroteno.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo y la facilidad brindada por las Líneas Prioritarias de Investigación 5 y 6 del Colegio de Post-graduados y al Fideicomiso Institucional. De la misma manera, se agradece el apoyo económico previo del fondo sectorial SAGARPA-COFUPRO y CONACYT. Este proyecto fue posible gracias a una colaboración interinstitucional entre investigadores del CINVESTAV y el Colegio de Posgraduados.

LITERATURA CITADA

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