Caracterización del lirio azteca mediante marcadores morfológicos y moleculares

Characterization of aztec lily through morphological and molecular markers

M. Deneb Bautista-Puga¹, L. Miguel Vázquez-García¹, Helena Leszczynska-Borys², Michal W. Borysy², Amaury M. Arzate-Fernández^{1 *}

¹ Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad Autónoma del Estado de México. Campus Universitario "El Cerrillo", Carretera Toluca-Ixtlahuaca Km 11.5 entronque al Cerrillo. 50200. Toluca, México. * Autor responsable (amauryl963@yahoo.com.mx).

²Universidad Popular Autónoma del Estado de Puebla, Centro de Investigación en Plantas Nativas. 21 Sur 1103, Colonia Santiago, 72160. Puebla, Puebla.

Recibido: Julio, 2010.
Aprobado: Mayo, 2011.

Resumen

El lirio azteca [Sprekelia formosissima (L.) Herbert] es una especie endémica de México. Su color rojo escarlata y la forma de su flor le confieren un gran potencial pata usarse como planta ornamental y como flor de corte, flor en maceta y paisajismo. Por tanto, cuatro variedades botánicas de S. formosissima fueron evaluadas mediante 29 descriptotes varietales y cinco iniciadores anclados (ASSR), con el propósito de conocer la eficiencia de cada uno de los marcadores en la diferenciación de variedades de S. formosissima y, además, determinar la posible relación entre la variabilidad genética y la altitud geográfica de recolecta de las cuatro variedades de S. formosissima. Los iniciadores ASSR generaron 57 a 100 % de polimorfismo. Con tres de los cinco iniciadores fue posible distinguir cada una de las variedades entre sí, generando un perfil molecular para su identificación inequívoca. Los ASSR fueron más eficientes al detectar una mayor variabilidad genética (D_G=0.5) con respecto a los morfológicos (D_G=0.3). La correlación basada entre la distancia genética y la altitud para el análisis morfológico no fue significativa; además, el análisis molecular no mostró una correlación entre ambos factores.

Palabras clave: Sprekelia formosissima, ASSR, marcadores morfológicos, variabilidad genética.

Abstract

Aztec lily [Sprekelia formosissima (L.) Herbert] is a species native to México. The scarlet color and shape of its flowers gives it great potential for use as an ornamental plant and as cut flower, potted flower and landscaping. Therefore, we evaluated four botanical varieties of S. formosissima using 29 varietal descriptors and five anchored primers (ASSR), in order to learn about the efficiency of each of the markers in the differentiation of varieties of S. formosissima, and also determine the possible relationship between the genetic variability and geographical altitude of collection of such varieties. The ASSR primers generated 57 to 100 % polymorphism. With three of the five primers we could distinguish each one of the varieties, generating a molecular profile for unambiguous identification. The ASSR were more efficient when detecting a greater genetic variability (D_G=0.5) with respect to the morphological ones (D_G=0.3). The correlation between genetic distance and altitude for morphological analysis showed to be not significant; likewise, the molecular analysis did not show a correlation between both factors.

Introducción

El lirio azteca [Sprekelia formosissima (L.) Herbert] forma parte del grupo de plantas bulbosas ornamentales más hermosas de México, la cual tuvo una gran importancia como planta medicinal (Leszczynska-Borys et al, 1995). Es una planta silvestre de consistencia herbácea que pertenece a la familia Amaryllidaceae y es endémica de México. Su color rojo escarlata y la forma de su flor le confiere un gran potencial para usarse como planta ornamental y como flor de corte, flor en maceta y paisajismo (Leszczynska-Borys y Borys, 2001). Esto puede favorecer la proliferación de nuevos cultivares, para los cuales no se cuenta con un mecanismo eficiente de caracterización que permita evitar posibles confusiones en su nomenclatura.

Debido a la importancia de S. formosissima, Borys et al. (2005) realizaron una descripción taxonómica de la especie, pero puede contener información imprecisa porque está basado en características morfológicas altamente influenciadas por el ambiente (Vidal-Barahona et al, 2006). Así, una correcta identificación de la especie vegetal es la base para determinar su uso y conservación; por tanto, la caracterización morfológica puede ser complementada con una caracterización molecular para reforzar la información de los estudios taxonómicos.

Mediante biología molecular se han desarrollado métodos para la identificación y caracterización de cultivares mediante marcadores de ADN para los análisis genéticos, así como para los programas de mejoramiento, debido a su simplicidad y facilidad de manejo (Tapia et al., 2005a). Este tipo de marcadores se pueden evaluar desde los primeros estados de desarrollo de las plántulas, aplicables a cualquier tipo de material vegetal, sin necesidad de evaluar muchos caracteres y además libres de los efectos epistáticos (Azofeifa-Delgado, 2006). Varios marcadores moleculares como RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA; Tapia et al, 2005a), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism; Martínez et al, 2003), SSR (Simple Sequence Repeats; Valdenice et al, 2006), e ISSR (Inter-simple Sequence Repeats; Tapia et al, 2005a) se usan para detectar diversidad genética en nivel intra o inter-específico en plantas domesticadas y silvestres (Valadez-Moctezuma et al., 2001). La técnica ISSR amplifica regiones genómicas entre dos microsatélites con iniciadores de tipo ASSR (Anchored Simple Sequence Repeat) (Yamagishi et al, 2002). Además, esta técnica es superior respecto a los otros tipos de marcadores debido a su rapidez, alta reproducibilidad y mayor eficiencia para detectar polimorfismos (Pradeep et al, 2002).

La variabilidad genética es la carga genética expresada o no de los individuos de una especie, donde su función es mantener un reservorio de condiciones de variación de respuesta al medio que permita la adaptación y supervivencia de la especie. Cuando la estructura genética está fuertemente influenciada por la distribución geográfica de la poblaciones, se espera que las poblaciones más cercanas presenten menor variabilidad que las más alejadas geográficamente (Wen y Hsiao, 2001). Borys et al. (2005) describieron morfológicamente el lirio azteca, pero no hay reportes sobre su caracterización molecular.

Por tanto, el objetivo del presente estudio fue caracterizar cuatro variedades botánicas de S. formosissima a través de marcadores morfológicos y moleculares (ISSR) y evaluar la eficiencia de cada uno de los marcadores en la diferenciación de las variedades de S. formosissima. Además determinar la posible relación entre la variabilidad genética y la altitud geográfica de recolecta de las cuatro variedades de S. formosissima.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se evaluaron cuatro variedades botánicas de S. formosissima recolectadas en tres localidades del Estado de México, con registro ante el Servicio Nacional de Inspección y Certificación de Semillas (SNICS). La variedad Oasis (SPK-001-240708) en Malinalco (1950 m), Andrea (SPK-002-240708) en Chapingo (2238 m), Terciopelo (Registro provisional número 1684-SPK-01-101204/C) en Villa Victoria (2600 m) y Julia (SPK-003-240708) en Valsequillo, Estado de Puebla (2160 m).

Análisis morfológico

Para el análisis morfológico se tomaron en cuenta los descriptores varietales aplicados a cada una de las variedades de 5 formosissima, donde se evaluaron 29 características morfológicas con 81 variantes (Cuadro 1), según la Guía Técnica para la Descripción Varietal del lirio azteca [Sprekelia formosissima (L.) Herbert] (SNICS, 2003).

Análisis molecular

Se extrajo ADN genómico de aproximadamente 100 mg de tejido fresco de hoja mediante el método de bromuro hexadeciltrimetilamonio (CTAB) (Zhou et al. 1999). El ADN fue resuspendido en 50 µL de amortiguador TE (Tris-HCl EDTA) y se almacenó a -20 °C hasta su uso. Las variedades se analizaron con los marcadores de ISSR y cinco iniciadores anclados 3'-ASSR (Cuadro 2). La amplificación del ADN mediante PC se realizó en un ter-mociclador de gradiente Mastercycler (EPPENDORF^®) modelo Hamburg 22331. La PCR se efectuó en un volumen final de 10 µL de solución que contenía 1 µL de amortiguador 10X PCR con amonio (15 mM), 0.5 µL de MgCl2 (25 mM), 1 µL de dNTPs (10 mM mezcla) (APPLIED BIOSYSTEMS^®), 0.1 µL de Taq ADN polimerasa (MERCURY REAGENTS™), 0.1 µL de iniciador (20 fiM) (INVITROGEN™) y 1 µL de ADN genómico (10 ng µL^-1). La amplificación consistió de un ciclo inicial de 7 min a 94 °C, seguido por 45 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 48 °C, 1 min a 72 °C, más un ciclo final de 5 min a 72 °C. Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa Tipo II (SIGMA^®) al 1 % en amortiguador TAE IX con 3 µL de bromuro de etidio (SIGMA^®). Las bandas amplificadas se observaron y fotografiaron en un Transiluminador (UVP™) modelo MP20.

Análisis estadístico

Con los datos derivados del análisis morfológico y molecular de cada variedad se formó una matriz binaria, en la cual la presencia de la banda/carácter se registró como 1 y la ausencia como 0 (Nei, 1972). Con el programa POPGENE 32 (Yeh y Boyle, 1999) se estimó la distancia genética, derivándose los dendrogramas. Con el fin de determinar la posible relación entre la variabilidad genética y la altitud geográfica de cada variedad se correlacionaron los valores obtenidos de la distancia genética tanto del análisis morfológico y molecular, mediante un análisis de correlación con el programa STATGRAPHICS Plus 4.1.

RESULTADOS y DISCUSIÓN

Análisis morfológico

De la matriz de distancias genéticas (D_G) obtenida del análisis morfológico se derivó el dendrograma (Figura 1A), que muestra la formación de dos grupos. En el grupo I se ubicaron las variedades Oasis y Terciopelo, y en el grupo II las variedades Andrea y Julia. La matriz de D_G mostró que las variedades con mayor similitud genética fueron: Andrea y Julia (D_G=0.19), ambas comparten el número mayor de caracteres comunes 23/29 (79 %), lo cual probablemente pueda explicar su cercanía genética. En contraste, las variedades menos emparentadas fueron Oasis y Julia (D_G=0.42), las cuales compartieron menos rasgos morfológicos 16/29 (55 %) y aparecen más distantes en el dendrograma.

Análisis molecular

Con los productos de PCR se generaron los estados de carácter presencia (1) y ausencia (0) y se produjo un dendrograma (Figura IB) donde se observa la formación de dos grupos. En el grupo I se ubicó sólo la variedad Oasis, mientras que en el grupo II están Terciopelo, Julia y Andrea. De la matriz de D_Q (datos no mostrados) las variedades menos emparentadas (D_G=0.66) fueron Oasis y Terciopelo, pero las más emparentadas genéticamente (D_G=0.35) fueron Terciopelo y Julia. Se detectaron 37 bandas, de las cuales 28 (73-4 %) fueron polimórficas (Cuadro 2), amplificadas en un intervalo de 300 a 1500 pb (Cuadro 3). El iniciador con 100 % de polimorfismo fue 3'-ASSR15- Cabe señalar que los cinco iniciadores generaron 11 bandas específicas en todas las variedades, las cuales permitieron describir un perfil molecular; así se logró una identificación clara de las cuatro variedades evaluadas. Todas las variedades presentaron diferentes bandas específicas: Oasis con 5, Terciopelo con 3, Julia con 2 y Andrea con 1 (Cuadro 3). Los iniciadores ASSR son efectivos para generar información segura y distinguir individuos genéticamente relacionados, en especies domesticadas y ornamentales. Por ejemplo, en Solanum tuberosum (Prevost y Wilkinson, 1999), en Nierembergia lana-riaefolia (Escandón et al, 2005), en Lilium spp. (Yamagishi et al, 2002; Arzate-Fernández et al, 2005), y en Ananas spp. (Tapia et al, 2005a).

Pradeep et al (2002) y Hu et al (2003) señalan que la efectividad de los iniciadores ASSR es posiblemente la secuencia motivo y la de su ancla, donde una secuencia CT presenta un mayor polimorfismo con respecto a los que tienen una AT y son los más abundantes y altamente polimórficos en el genoma de las plantas, pero dificultan la amplificación de bandas específicas. Ello sugiere que se debe a la semi-complementariedad del iniciador en la etapa de alineación de la PCR (Fang y Roose, 1997).

La secuencia del ancla consiste de uno, dos o tres nucleótidos, los cuales se anclan al final del extremo 3' o 5' de un microsatélite (SSR), asegurando el reconocimiento del iniciador con el ADN genómico, con la finalidad de incrementar la distinción de fragmentos polimórficos (Yamagishi et al, 2002; Pradeep et al, 2002). En el presente estudio, el nivel de distinción entre las cuatro variedades pudo haber dependido de la secuencia del ancla del iniciador. Así, con el iniciador 3'-ASSR15, cuya secuencia es ATG, fue posible obtener 100 % de polimorfismo (Cuadro 2). Esto sugiere que la técnica ISSR puede ser un sistema altamente informativo, rápido y confiable para la identificación de cultivares, como lo señalan Tapia et al (2005a).

Con los marcadores ISSR se obtuvo una D =0.5 en promedio, superior a la de los morfológicos (D_G=0.3), lo cual sugiere que fueron más eficientes para detectar mayor variabilidad genética entre las cuatro variedades y permite observar mejor las diferencias. Tapia et al. (2005a) y Vidal-Barahona et al. (2006) reportan también mayor eficiencia de los marcadores ISSR, respecto a los morfológicos, para discriminar genotipos de pina {Ananas spp.) y fríjol (Phaseolus vulgaris).

Relación entre la variabilidad genética y la altitud de recolecta

Tanto en el dendrograma morfológico como en el molecular (Figura 1A y IB), las variedades se agruparon de acuerdo con su D_G. Las cuatro variedades comprendieron una altitud de recolección entre 1950 y 2600 m, pero en los dendrogramas no se observó una tendencia a agruparlas en relación con la altitud. No obstante, en el análisis morfológico se encontró que entre las variedades Julia (2160 m) y Andrea (2238 m) hay una separación de 78 m; y fueron las más emparentadas (D_G=0.19). Del mismo modo, entre Oasis (1950 m) y Julia (2160 m) hay una diferencia altitudinal de 210 m y estas variedades fueron las menos emparentadas (D_G=0.42). En contraste, para el análisis molecular, las variedades Oasis (1950 m) y Terciopelo (2600 m) con diferencia de altitud de 650 m fueron las más distantes genéticamente (D_G=0.66), y ambas presentaron el mayor número de bandas específicas 5 y 3; además, en el análisis morfológico estas mismas variedades comparten menos rasgos morfológicos 8/29, por lo que aparecen más distantes en el dendrograma. Julia (2160 m) y Terciopelo (2600 m) tienen una diferencia de altitud de 440 m y fueron las menos emparentadas genéticamente (D_G=0.35).

Sin embargo, Andrea (2238 m) y Oasis (1950 m) muestran una D_G=0.61 y una diferencia de altitud de 288 m. No obstante, Andrea se ubicó en el mismo grupo con Julia y Tercipelo probablemente debido al número bajo de bandas específicas que muestra cada una de las variedades en comparación con Oasis (Cuadro 3), por lo que este pudiera ser un factor por el cual está más relacionada con Julia y Terciopelo. Del mismo modo, estas tres variedades en el análisis morfológico presentan en común 15 rasgos morfológicos, lo cual probablemente haya contribuido a que estuvieran estrechamente relacionadas. Así, es posible que la diferencia de altitud entre los lugares de recolección sea un factor que determina la separación genética entre variedades.

De acuerdo con Wen y Hsiao (2001), la diferenciación genética está correlacionada con la altitud; es decir, en una altitud menor hay un promedio significativamente más alto de similaridad genética entre poblaciones de Lilium, mientras que en una altitud mayor hay una variación más alta dentro de las poblaciones, ya que experimentan una variación diurna anual mayor. Esto coincide con lo reportado por Arzate-Fernández et al. (2005), quienes indican que plantas de Lilium recolectadas a 1000 m estuvieron sujetas a un estrés ambiental mayor (cambios de temperatura, vientos fuertes y la cobertura de nieve y hielo), reflejando así una mayor variación genética que aquellas recolectadas a 650 m.

No hubo una correlación significativa entre la distancia genética y la altitud de recolecta, para el análisis morfológico (R=-0.126; p>0.10). También para el análisis molecular hubo correlación baja y no significativa (R=0.111; p>0.10), entre la distancia genética y la altitud. Tapia et al. (2005b) reportan resultados similares de correlación baja entre marcadores AFLP's y marcadores morfológicos (R=0.30; p=1.0) en Citrus spp. Así mismo, Roldan-Ruiz et al. (2001, citados por Martínez et al., 2003) señalan correlación baja entre AFLP y morfología (r=—0.06) de Lolium Perenne L.

CONCLUSIONES

Los marcadores morfológicos y moleculares (ISSR), permitieron diferenciar las cuatro variedades de S. formosissima, pero los ISSR fueron más eficientes que los morfológicos al detectar la mayor variabilidad genética. Se describe un perfil molecular para una clara identificación de cada variedad. No hubo correlación significativa entre la distancia genética y la altitud de recolecta, para el análisis morfológico y para el análisis molecular.

LITERATURA CITADA

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