Cinética de eliminación de lindano en grasa de leche de vacas tratadas con tres dosis de lindano
Elimination kinetics of lindane at three doses in a cow's milk fat
Luís Ocampo–Camberos1, Rene Rosiles–Martínez2, Graciela Tapia–Pérez3 y Héctor Sumano– López1,*
1 Departamento de Fisiología y Farmacología. *Autor responsable: (sumano@servidor.unam.mx).
2 Departamento de Nutrición Animal y Bioquímica.
]]> 3 Departamento de Genética y Bioestadística, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, México D.F. 04510, México.
Recibido: Noviembre, 2008.
Aprobado: Marzo, 2010.
RESUMEN
Existen evidencias de que el lindano se elimina por la leche y el riesgo de exposición por el consumo diario es mucho mayor que en otros tipos de alimentos, por lo que es básico conocer y respetar el tiempo de retiro de todo producto consumido por el hombre. El presente estudio se realizó con la finalidad de evaluar si la aplicación de lindano por aspersión a 75 y 300 μg kg–1 de peso corporal (dosis recomendada y sobredosis), generaba concentraciones de lindano en leche menores al límite máximo permisible (0.01 mg kg–1). Para ello se determinaron, mediante cromatografía de gases con detector de captura de electrones, las concentraciones de lindano en leche de vacas Holstein–Friesan en producción, después de un tratamiento tópico por aspersión a dosis de 75 (grupo A) y 300 μg kg–1 (grupo B) y sin lindano (grupo C). Las variables de eliminación en leche fueron: coeficiente de eliminación (Kel), vida media (T½β) y tiempo de retiro. Se usaron ocho vacas con un peso promedio de 525± 12.5 kg con producción de 19–23 L d–1. Eliminando el despunte, se obtuvieron muestras de 75 mL de leche de la ordeña de la mañana en cada cuarto, para hacer una sola muestra por ordeño por 14 d, y se congeló a –20 °C hasta su análisis. Con el método analítico se logró recuperar de 90.37±1.52 %, (R2=0.986). La cantidad mínima detectable fue 0.001 mg L–1 (y la cantidad mínima cuantificable 0.008 mg L–1). Para el grupo A se obtuvo una Kel de 0.382 h–1 y una T½β= 1.81 d y el tiempo requerido para llegar a la cantidad de residuos inferiores a los máximos permitidos (MRL) por la WHO/FAO de 0.01 mg kg–1 fue 13 d. Para el grupo B se obtuvo Kel = 0.243 h–1 y T½β= 2.84 d, y el tiempo requerido para llegar a la cantidad de residuos inferiores a los máximos permitidos (MRL) fue 29 d. El método implementado fue validado, la concentración de lindano en leche puede ser mayor al valor de MRL y parece mostrar una cinética de orden cero acumulativa y dependiente de la dosis, lo que puede impactar negativamente en la salud pública, sobre todo porque las concentraciones detectadas fueron superiores al máximo permitido por la OMS.
Palabras clave: cinética, cromatografía de gases, leche, lindano, vacas.
ABSTRACT
]]> There is evidence of lindane being eliminated through milk, and the risk of exposure by daily consumption is much greater than in other types of food; therefore, knowing and respecting the time of withdrawal of any product consumed by the human being is fundamental. The present study was carried out with the purpose to assess if lindane application using spray at 75 and 300 μg kg–1 body weight (recommended dose and overdose) generated lower lindane concentrations in milk than the permissible maximum limit (0.01 mg kg–1). Therefore, the lindane concentrations in milk of Holstein–Friesian cows were determined by gas chromatography with electron capture detector after a topical treatment by spraying a dose of 75 (group A) and 300 μg kg–1 (group B), and without lindane (group C). The elimination variables in milk were: elimination coefficient (Kel), mean lifetime (T½β) and withdrawal time. Eight cows with mean weight of 525±12.5 kg producing 19 –23 L d–1 were utilized. Skimming milk, samples of 75 mL per quarter of the morning milking were obtained in order to make one single sample per milking for 14 d, freezing it at – 20 °C until its analysis. Using the analytical method, a recovery of 90.37±1.52 % (R2=0.986) was achieved. The minimum detectable quantity was 0.001 mg L–1 (and the minimum quantifiable amount 0.008 mg L–1). For group A, 0.382 h–1 Kel and T½β = 1.81 d were obtained, and the time required to reach from the quantity of the least residues to the maximum residue limit (MRL) by WHO/FAO of 0.01 mg kg–1, was 13 d. For group B, Kel = 0.243 h–1 and T½β = 2.84 d were obtained, and the time the quantity of lowest residues needed to reach the maximum residue limit (MRL) was 29 d. The implemented method was validated; lindane concentrations in milk may be higher than the MRL value and seem to show accumulative kinetics of the zero order and dependent on the dose, which may negatively impact public health, especially because the detected concentrations were higher than the maximum permissible ones by OMS.Key words: kinetics, gas chromatography, milk, lindane, cows.
INTRODUCCIÓN
El lindano (γ HCH) es un plaguicida organo–clorado lipofílico relacionado con problemas inmunológicos en el hombre (Vandana et al., 2005) de toxicidad diversa (Alavanja et al., 2003), asociado con cáncer de mama (Perocco et al., 1995) y puede producir carcinogenicidad y genotoxicidad (Miller y Sharpe, 1998). Se le clasifica como clase 2B (posible carcinogénico) (Goldsmith, 2000). Está prohibido en Costa Rica, Colombia, Dinamarca, Finlandia, Gambia, Honduras, Hungría, Indonesia, Kuwait, Nueva Zelanda, Holanda, Santa Lucia, Eslovenia, Sudáfrica, Corea del sur, Suecia y Turquía. En Canadá y EE.UU. su uso está restringido desde 1994 y en México desde 2004. Sin embargo, en México y otros países en desarrollo se usa para la conservación de semillas en agricultura, como ectoparasiticida en ganadería y en lociones o jabones para tratamiento de sarnas y piojos en humanos; este último uso también se acepta en Canadá, EE.UU. y algunos países de Latinoamérica. En zonas tropicales se ha llegado a utilizar como ixodicida (Baker, 1979).
Por su liposolubilidad persiste en el medio y en productos agrícolas. Se le puede encontrar como residuo en leche, queso, crema, carne y huevo, en pescado y productos alimenticios. Aunque hay otros metabolitos, el lindano mismo es el principal (Burke et al., 2005). Se ha detectado tanto gHCH como otros isómeros en muestras diversas e incluso en el aire, en aguas superficiales y profundas, en sedimento, suelo y mantos acuíferos, por lo que se genera contaminación potencial para humanos y animales acuáticos y terrestres (Concha et al., 2006). Si además de la contaminación ambiental hay lindano en la cadena alimenticia vía leche, su acumulación puede tener repercusiones importantes para la salud humana (Burke et al., 2005).
Moore et al. (1952) analizaron residuos del lindano en productos de origen animal después de su aplicación oral. Sin embargo, en la revisión realizada no se encontraron estudios de la cinética de eliminación de lindano en leche de vacas expuestas a aplicación dérmica, que es la más usada. Esto ha motivado su uso tópico y la creencia de que no logra absorberse en cantidades suficientes como para llegar a la leche. Por tanto, el principal objetivo de este trabajo, el cual fue cuantificar la presencia de lindano en leche para el consumo humano y definir su cinética de eliminación en leche de vacas, cuando se aplica como aspersión tópica para control de ectoparásitos, en dos dosis, una recomendada por los fabricantes y otra por Bluethgen et al. (1977).
MATERIALES Y MÉTODOS
Los materiales estándares y reactivos fueron: lindano técnico al 99 % (Sigma–Aldrich Co.USA4), H2SO4 96 % (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), Na2SO4 (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), y hexano (ACS, Baker. Mallinckrodt Baker S.A de C.V. México). El material de laboratorio se lavó con agua caliente, se enjuagó con agua bidestilada y se secó a 100 °C en estufa; después se enjuagó con hexano y se volvió a secar con aire caliente.
]]> El diseño experimental fue completamente aleatorizado con ocho repeticiones. Se usaron 24 vacas Holstein–Friesan en lactación con un peso medio 525 ±12.5 kg y con producción de 19 a 23 L d–1, de una granja familiar de 58 vacas en el municipio de Santa Rosa, estado de Querétaro, México; en producción y sin uso de lindano en los últimos 10 años. Se recolectaron muestras de leche antes del tratamiento con lindano, para conocer los posibles valores basales de lindano. Sólo se incluyeron vacas en producción cuyo nivel de lindano en la leche fuese inferior al límite de detección de la técnica analítica usada (0.008 mg L–1 leche). Se formaron tres grupos con ocho vacas cada uno, elegidas aleatoriamente. Los tratamientos fueron: 1) Grupo A, se aplicó por aspersión una dosis de 75 μg kg–1 peso por vaca, representativo de una dosis terapéutica del ectoparasiticida comercial (Lindano Agromundo S.A. de C.V.) diluido a 1 L 1000 L–1 de agua y aplicando 250 mL por vaca; 2) Grupo B, se aplicó cuatro veces la dosis anterior por aspersión (300 μg kg–1), representativa de una dosis alta del ectoparasiticida (10 L 1000 L–1 de agua), en 250 mL vaca–1; en el campo se pueden usar estas dosis por mal manejo de los encargados; 3) Grupo C testigo no tratado y monitor de otras fuentes potenciales u horizontales de acumulación de lindano en la granja. Toda la leche fue eliminada como no apta para consumo humano hasta lograr concentraciones menores que el nivel de detección ya señalado.Después de aplicar el lindano se ordeñaron las vacas diariamente por 14 d. Se recuperaron 75 mL de cada cuarto en frascos de vidrio estériles después de eliminar una misma cantidad como despunte, en la ordeña de la mañana. Las muestras de los cuatro cuartos, mezcladas en un solo volumen de 250 mL, se mantuvieron congeladas a –20 °C hasta su análisis.
Se implementó y validó el método analítico para lindano por cromatografía de gases descrito por Armendáriz et al. (2004). Para la extracción se desecó por ebullición y se secaron las muestras a 50 °C por 3 d en una estufa turbo–dryer vap II Zymark Model ZW 8006. El polvo obtenido se transfirió a una columna de vidrio empacada con fluorisil para eluir el lindano con 50 mL de hexano dos veces; se concentró el eluato a 1 mL evaporándolo a 50 °C con corriente de N, se restituyó el volumen a 10 mL con los líquidos de los lavados y alícuotas de hexano y se agitó hasta homogenizar. Se restituyó nuevamente a 10 mL y se tomaron 2 mL para determinar el porcentaje de grasa. Para purificar el extracto se agregó 3 mL de ácido sulfúrico concentrado a 8 mL de muestra y se agitó en Vortex–Genie (Daigger & Company, Inc. Lakeview Parkway. Vernon Hills, U.S.A.) enérgicamente por 1 min. Se dejó reposar 24 h para permitir la separación de las capas orgánica y acuosa y se transfirió 5 mL de la capa orgánica a un matraz con 1 g de cama de Na2SO4. El residuo se lavó con dos alícuotas de 5 mL de hexano, se evaporó a <50 °C con corriente de N; se recolectó el residuo con 1 mL de hexano y se inyectó 1 fL al cromatógrafo de gases.
Se usó un cromatógrafo de gases Perkin Elmer XL con detector de captura de electrones a una temperatura de inyección de 280 °C. El gas acarreador fue N a 20 psi y con un rango de flujo de 1 mL min–1. La temperatura inicial del horno fue 50 °C por 3 min, con un gradiente de 30 °C min–1 hasta 180 °C, estabilizando por 1 min y aumentando 4 °C min–1 hasta 220 °C en aproximadamente 10 min. Luego se elevó la temperatura a razón de 6 °C min–1 hasta 250 °C en 5 min, con la temperatura del detector de captura de electrones a 300 °C.
Para validar dicho método se usaron muestras de leche comercial fortificada y se logró una recuperación de 89.6 a 92.3 % (90.37± 1.52 DE), con una variación intraensayo menor a 4 % y un R2 = 0.986. El límite de detección fue 0.001 mg L–1 y el límite de cuantificación fue 0.008 mg L–1.
Los valores obtenidos se integraron, para conocer parte de la cinética de eliminación, a la fórmula del logaritmo neperiano:
Cr = Cieat
donde, Cr=concentración residual; Ci=concentración inicial; e = logaritmo neperiano base 2; ª = coeficiente de eliminación del lindano en la leche; t = tiempo(h).
La concentración inicial (Ci) se considera el primer punto de comparación con el segundo punto (Cr) del área bajo la curva del compuesto en su fase de eliminación del organismo. El área bajo la curva de concentración–tiempo de 1 a 9 d se calculó usando el método trapezoidal lineal mediante el programa PKAnalyst (Micromath Scientific Software; Salt Lake City, Utah, USA, 1985.) y la mejor correlación se obtuvo con el modelo 13.
Análisis estadístico
]]> El diseño estadístico fue completamente al azar de un solo factor con tres niveles y ocho repeticiones (unidad experimental: una vaca). Los valores obtenidos se analizaron con modelo polinomial de medidas repetidas con el programa IBM SPSS Statistics, versión 16 (SPSS Ibérica, IBM Company, Madrid, España) (Camacho, 2002). Se hizo el análisis polinomial de mediciones repetidas, el factor intra–sujeto fue la concentración (3 niveles) y el factor inter–sujetos fue el día de muestreo (14 niveles) y con la prueba de esfericidad de Mauchy se probaron los efectos intra–sujetos para concentración y día de muestreo lineal y cuadrático. Se usó la prueba de Games–Howell para diferencia entre medias con varianzas desiguales.Se estableció el tiempo de retiro para esta vía y a las dosis señaladas cuando las concentraciones de lindano en leche fueron menores al valor aceptado de 0.01 mg L–1 (FAO–WHO, 2010) o por extrapolación de residuos máximos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La metodología utilizada permitió tasas de recuperación superiores al 90 % y un límite de cuantificación inferior al valor de MRL aceptado por la FAO–WHO (2010), de 0.010 mg L–1 de lindano en leche entera. Los resultados y sus comparaciones estadísticas se presentan en el Cuadro 1 y en la Figura 1 las relaciones de concentración en leche de lindano vs. tiempo. Mediante la prueba estadística de mediciones repetidas se corroboró una aparente linealidad en el aumento en la concentración máxima al día 1 entre los dos grupos. Tanto el efecto lineal como el cuadrático resultaron significativos (p=0.000) en las pruebas dentro de sujetos para el efecto de concentración del lindano y su interacción con el día de muestreo. En el análisis inter–sujetos el día resultó significativo (p=0.000) La prueba de esfericidad resultó significativa (p=0.000) por lo que se ajustaron los grados de libertad con epsilon de Greenhouse–Geisser y se usó la prueba de Games–Howell para diferencia entre medias con varianzas desiguales.
La concentración de lindano se reduce con un patrón relativamente lento ya que en el grupo A día 1 se observaron 0.025 mg L–1 de lindano, superior a los límites máximos de residuos (MRL) recomendados por la FAO–WHO (2010) que son 0.010 mg L–1 en leche entera con 0.12 mg kg–1 base de contenidos de grasa; en el día 14 fue 0.003 mg L–1 En el grupo B la concentración inicial promedio fue 0.218 mg L–1 y al día 14 bajó a 0.015 mg L–1 (Figura 1). No se detectaron concentraciones de lindano en el grupo C.
El análisis de los resultados sugiere que la mayor parte del lindano se detectó en la grasa de la leche, lo cual resulta predecible dado su elevado coeficiente de liposolubilidad. Es factible suponer que estas concentraciones se elevan en queso y disminuyen en leche procesada baja en grasa. En el presente estudio no se determinaron las concentraciones de isómeros a y βHCH dado que se eliminan en menores cantidades que el propio lindano y por ende muy por abajo de los MRL. Es decir, es seguro usar al γHCH como metabolito indicador de residualidad.
Se destaca la velocidad de paso del sitio de aplicación en la piel a su detección en la grasa de leche en 24 h. Las cantidades de lindano encontradas en la leche parecen ser directamente proporcionales a la dosis dérmica aplicada (Figura 1). El grupo tratado con 75 μg kg–1 requirió 7 d para que la concentración fuera menor a 0.010 mg L–1, mientras que el grupo B tratado con 300 μg kg–1 no alcanzó dicho nivel durante el estudio, y por extrapolación sucede aproximadamente el día 23 (Cuadro 1). La diferencia en los ángulos de eliminación para las dos dosis (β 0.02 mg L–1 h–1 para el grupo A y β=0.004 mg L–1 h–1 para el grupo B) se redujo significativamente (p<0.05); consecuentemente la T½β también fue estadísticamente distinta (grupo A = 1.81 d; grupo B = 2.84 d) (p<0.05). En contraste, Moore et al. (1952) mencionan una T½β en leche de 10 d y aunque estos autores no lo indican, usar esta vida media como valor predictivo resultaría en un periodo de retiro de ordeña cercano a tres meses. La diferencia en resultados entre el presente ensayo con el de Moore et al. (1952) es notable y se debería, al menos en parte, a que dichos autores administraron lindano vía oral y no por aspersión, usaron dosis de 70 μg kg–1 a 6.22 mg kg–1 d–1 y durante 70 a 110 d.
]]> Las diferencias obtenidas en el valor de β (ángulo de eliminación) en este estudio indican una reducción inversamente proporcional y en aparente linea–lidad con la dosis de 75 μg kg–1 (0.02 ng h–1) y la mitad de dicho valor para la de 300 μg kg–1 (Cuadro 1). Con ello aumenta su tiempo de eliminación como lo indica el incremento en la T½β. Tomados estos datos en conjunto es factible postular que el lindano tiene una cinética de orden cero. Por tal razón y congruente con la tendencia acumulativa de este tipo de cinética, la persistencia de residuos será más prolongada al aumentar la dosis y cuando se persiste en la redosificación.En otro estudio (Bluetghen et al., 1977) se administró lindano en polvo vía oral, a dosis de 40 a 50 mg vaca–1 (aproximadamente 80–100 μg kg–1) y se obtuvieron concentraciones del fármaco superiores al MRL durante cinco semanas y de sus isómeros β y βHCH por nueve semanas. La comparación de estos resultados con los del presente estudio revela un patrón similar de eliminación de cinética de orden cero, pero en una escala de sobredosificación en el estudio de Bluetghen et al. (1977). En un estudio epidemiológico en carne, pescado y leche (Fontcuberta et al., 2008) se encontraron concentraciones inferiores a los MRL y sólo en una muestra de lácteos resultó positiva, lo cual refleja las regulaciones actuales en España. Asimismo, en Ghana no se detectaron niveles de lindano en ninguna de las muestras analizadas con productos derivados de leche (Darko y Acquaah, 2008).
El análisis de los resultados del presente estudio sugiere que aun con las dosis bajas de lindano aplicado tópicamente por aspersión, es económicamente inviable justificar los tiempos de retiro encontrados y, por tanto, no se recomienda su uso para el control de ectoparásitos en vacas productoras de leche. Además, dada su capacidad de penetración a través de la piel (Kasareli, 2002), deberá tenerse cuidado extremo y evitar su uso en paredes y cercas porque puede generar una bioacumalación del principio activo en los usuarios y consumidores finales.
Finalmente, la ausencia de lindano en las muestras de leche del grupo testigo (no tratados) indica que, si no hay ningún otro ingreso de lindano a las vacas a través de productos agrícolas o de otra índole, la transmisión de residuos en forma horizontal es poco probable con los esquemas de dosificación usados en el presente ensayo. De cualquier manera es poco lógico pensar en tratamientos selectivos con lindano para el control de ectoparásitos.
CONCLUSIONES
Las cantidades de lindano encontradas en las muestras de leche de vacas son directamente proporcionales a las dosis administradas por aspersión. El grupo tratado con 75 μg kg–1 requirió 7 d para mostrar una concentración menor a 0.010 mg L–1, mientras que en el grupo tratado con 300 μg kg–1, requirió 23 d. Se concluye que el lindano tiene una cinética de eliminación en leche de orden cero dependiente de la dosis y acumulativa, como lo indica la reducción en el valor del ángulo de eliminación β en la dosis mayor. De cualquier manera, resulta económicamente inviable el justificar los tiempos de retiro aquí señalados como para usar lindano en vacas productoras de leche.
LITERATURA CITADA
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