Contenido de fenoles solubles e insolubles en las estructuras del grano de maíz y su relación con propiedades físicas

Content of soluble and insoluble phenols in the structures of corn grain and their relationship with physical properties

M. Luisa Cabrera–Soto¹, Yolanda Salinas–Moreno^2*, Gustavo A. Velázquez–Cardelas², Edgar Espinosa Trujillo²

¹ Ingeniería Agroindustrial. Universidad Autónoma Chapingo. 56230. Chapingo, Estado de México.

² Programa de Maíz. Instituto Nacional de Investigaciones forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). 56230. Chapingo, Estado de México. *Autor responsable: (yolysamx@yahoo.com).

Recibido: Julio, 2008.
Aprobado: Mayo, 2009.

RESUMEN

El estudio de los compuestos fenólicos es importante por las funciones de algunos de ellos en los mecanismos de defensa de la planta contra el ataque de patógenos, así como por sus propiedades antioxidantes, antimutagénicas y anticancerígenas. Los objetivos de este trabajo fueron determinar el contenido de fenoles solubles (FS) e insolubles (FI) en el pericarpio, endospermo y germen del grano de maíz (Zea mays) y su correlación con las propiedades físicas del grano. Se trabajó con dos genotipos experimentales (HE y H–161) cultivados en diferentes localidades y tres maíces comerciales (Oso, Sable y Leopardo). Se analizaron los FS (libres, glucosilados y esterificados) y FI mediante el método de Folin–Ciocalteu. Las variables físicas del grano fueron: peso hectolítrico (PH), índice de flotación (IF), color de grano (CG) y peso de 100 granos (PCG). El contenido de FS fue más elevado en el germen, seguido del pericarpio y endospermo. Dentro de este tipo de fenoles, en las tres estructuras dominaron los fenoles libres. El mayor contenido de FI se presentó en el pericarpio, seguido del germen y endospermo. Existió diferencia estadística (p<0.01) para el contenido de FS y FI, entre los maíces estudiados. El contenido de fenoles libres y esterificados del endospermo presentó correlación significativa (p<0.01) con las variables relacionadas con la dureza del grano (PH e IF), en tanto que los FL del pericarpio mostraron una correlación positiva con el grado de cremosidad del grano. El PCG estuvo correlacionado positivamente (p<0.05) con los FI del pericarpio y de manera negativa con los fenoles glucosilados del endospermo. Existe una concentración diferencial de fenoles entre las estructuras del grano y algunos de ellos como los fenoles esterificados están asociados con su dureza.

Palabras clave: Zea mays, color, compuestos fenólicos, dureza, grano.

ABSTRACT

The study of phenolic compounds is important for the functions of some of them in plant defense mechanisms plant against pathogen attack and by its antioxidant, antimutagenic and anticarcinogenic properties. The objectives of this study were to determine soluble phenol content (FS) and insoluble (FI) in the pericarp, endosperm and germ of the corn grain (Zea mays) and its correlation with the physical properties of the grain. This work was done with two experimental genotypes (H and H–161) grown in different locations and three commercial maizes (Oso, Sable and Leopardo). The FS were analyzed (free, glycosylated and esterified) as well as FI using the method of Folin–Ciocalteu. The physical variables of the grain were: hectolitric weight (PH), flotation index (FI), grain color (CG) and weight of 100 grains (PCG). The content of FS was higher in the germ, followed by the pericarp and endosperm. Within this type of phenols, free phenols prevailed in the three structures. The highest content of FI was found in the pericarp, followed by the germ and endosperm. There was statistical difference (p<0.01) for the content of FS and FI among the maize types studied. The free and esterified phenol content of the endosperm showed a significant correlation (p<0.01) with the variables related to the grain hardness (PH and IF), while the pericarp FL showed a positive correlation with the degree of creaminess of the grain. The PCG was positively correlated (p<0.05) with the pericarp FI and negatively with the endosperm glycosylated phenols. There is a differential concentration of phenols among the grain structures, and some of them, like the esterified phenols are associated with their hardness.

INTRODUCCIÓN

Los fenoles son compuestos químicos ampliamente distribuidos en las plantas como producto de su metabolismo secundario, algunos de los cuales son indispensables para su funcionamiento y otros son útiles en los mecanismos de defensa bajo situaciones de tensión (Kim et al, 2003) y contra el ataque de organismos patógenos (Bakan et al., 2003). También se vincula el consumo de estos fitoquímicos con beneficios a la salud, debido a sus propiedades antioxidantes (Gallardo et al., 2006) y anticancerígenas (Zhaohui y Moghadasian, 2008).

En cereales los fenoles se agrupan en solubles e insolubles o ligados. En el primer grupo están los fenoles libres, glucosilados y esterificados que se ubican en mayor cantidad en las capas periféricas de los granos (pericarpio, testa y células de aleurona), mientras que su concentración es menor en el endospermo (Yu et al., 2001). El maíz (Zea mays) contiene más fenoles totales y mayor poder antioxidante que cereales como trigo, arroz y avena (Adorn y Liu, 2002). El principal fenol es el ácido ferúlico, que representa alrededor de 85 % de los fenoles totales y se concentra en el pericarpio del grano en forma libre o esterificado a las heteroxilanas que constituyen la hemicelulosa de la pared celular (De la Parra et al, 2007).

Aunque hay trabajos sobre el contenido de fenoles en el grano entero de maíz (Sosulski et al., 1982; Del Pozo–Insfran et al, 2006; De la Parra et al, 2007), pocos cuantifican estos compuestos en las estructuras del grano, a pesar de que su presencia tiene relevancia con propiedades particulares: el contenido de fenoles en el germen del grano de maíz está asociado con la tolerancia a Fusarium spp (Bakan et al, 2003); los fenoles del endospermo participan en el desarrollo del color grisáceo en masa y tortilla (Salinas et al, 2007) y los del pericarpio se relacionan con la tolerancia a plagas de almacén (Arnason et al, 1992; Sen et al, 1994). Trabajos recientes relacionan la dureza del grano de maíz con el contenido de fenoles (Bily et al, 2004; Del Pozo–Insfran et al, 2006), pero se desconoce si otras propiedades físicas del grano están asociadas con el contenido de estos compuestos.

Por tanto, el propósito de la presente investigación fue determinar el contenido de fenoles solubles e insolubles en el pericarpio, endospermo y germen, y su correlación con las propiedades físicas del grano de maíz.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material genético

Características físicas

El análisis de las características físicas del grano se realizó cuando las muestras tenían un 11 a 12 % de humedad: 1) peso hectolítrico (kg hL^–1) usando una balanza específica (Ohaus); 2) peso de 100 granos (g): se contaron manualmente cien semillas y se determinó su peso en un balanza semianalitica; 3) índice de flotación (%): se colocaron 100 granos sanos en una solución de nitrato de sodio ajustada a una densidad de 1.2500 luego los granos se agitaron ligeramente y se contó el número que ascendió a la superficie, el cual se consideró como el índice de flotación o porcentaje de granos flotantes (Salinas et al, 1992); 4) color de grano (% R) a 546 nm: se usó el colorímetro Agtron y un tamaño de muestra de 30 g. Además se determinaron los porcentajes de pedicelo, pericarpio, germen y endospermo. Los métodos usados fueron los descritos por Salinas y Vázquez (2006). Cada análisis se hizo por duplicado o triplicado.

Cuantificación de los compuestos fenólicos del grano

Además se pesaron 150 g de grano crudo de maíz en una balanza semianalítica (Sartorius, modelo BL610); se colocaron en un vaso de precipitados de 500 mL que contenía agua caliente (85 °C) y se dejaron reposar 15 min para facilitar la separación de las estructuras del grano. Con un bisturí se separaron el pericarpio, endospermo y germen; el pedicelo del grano se descartó. Las fracciones se molieron en un molino (IKA WERKE, Modelo MF 10 Basic) con una malla de 0.5 mm. El germen se desengrasó antes de su molienda usando un equipo Soxhlet y éter de petróleo como disolvente (12 h de extracción a 67 °C) para evitar la posible interferencia de la Vitamina E del germen en la cuantificación de fenoles por el método de Folin–Ciocalteu (F–C) (Makkar, 2002). Las harinas se deshidrataron 12 h a 50 °C en una estufa (Blue M) y se almacenaron en un desecador hasta su análisis.

La extracción de fenoles solubles (glucosilados, esterificados y libres) se realizó según lo descrito por Bakan et al. (2003) y para los fenoles insolubles se usó la metodología de Assabgui et al. (1993); la cuantificación en todos los casos se hizo mediante el método de F–C. Para los fenoles solubles la extracción se hizo con 1.5 g de harina y 30 mL de metanol al 80 % por 60 min de agitación a temperatura ambiente. La mezcla se centrifugó a 1345 g por 10 min en una centrífuga (Hettich, modelo Universal 32). El sobrenadante se separó del sedimento y a este último se agregó metanol al 80 % para una segunda extracción. El sedimento de esta segunda extracción se guardó para analizar fenoles insolubles.

Los sobrenadantes se mezclaron y filtraron con papel Whatman No. 4. El filtrado se concentró en un rotavapor (Heidolph modelo Laborata 4010) a 40 °C, hasta un volumen de 15 mL, para después aforar con agua destilada a un volumen final de 20 mL. La solución se ajustó a pH 2 con HC1 2N y un potenciómetro (Beckman 45 pH meter). Se realizó una extracción líquido–líquido con acetato de etilo dos veces, juntando las fases orgánicas de cada caso, donde se encontraban los fenoles libres.

La fase acuosa se ajustó a un volumen de 20 mL con agua destilada y se dividió en dos volúmenes iguales. A uno de ellos se agregaron 10 mL de HC1 2N para extraer los fenoles glucosilados y al otro 10 mL de NaOH 2N para obtener los esterificados. La solución con HC1 se conservó lh a 4 °C, mientras que la de NaOH se mantuvo 3 h en oscuridad a temperatura ambiente. Luego ambos extractos se ajustaron a pH 2 y se hicieron dos extracciones líquido–líquido con acetato de etilo para separar los fenoles en la fase orgánica, la cual se concentró a sequedad y el residuo se resuspendió en agua destilada aforando a 10 mL en un matraz volumétrico para su cuantificación mediante el método de F–C. El contenido de fenoles se expresó en función del ácido gálico (Sigma, MN, USA), con el cual se preparó una curva patrón.

El sedimento sin los fenoles solubles se hidrolizó con 30 mL de NaOH 2N por 3 h a 60 °C. Se ajustó el volumen a 100 mL con agua destilada y se dejó reposar 12 h a temperatura ambiente y en oscuridad. Se ajustó el pH a 2, seguido de extracciones líquido–líquido con acetato de etilo, juntando los extractos que se concentraron a sequedad en un rotavapor. El residuo se resuspendió en 10 mL de agua destilada para su cuantificación por F–C. Todos los análisis se realizaron por duplicado o triplicado.

Análisis estadístico de los datos

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Contenido de fenoles en las estructuras del grano Fenoles solubles

Los fenoles solubles del grano de maíz están conformados por los fenoles libres (FL), los fenoles glucosilados (FG) y los fenoles esterificados (FE) dentro de este grupo están a los ácidos fenólicos, flavonoides y amidas fenólicas (Sen et al, 1994). En el pericarpio los FL variaron entre 107–3 y 181.7 μg g^–1 MS, los FG de 14.9 a 28.7 μg g^–1 de MS, y los FE de 86.6 a 137–1 μg g^–1 MS. Se observó diferencia estadística en el contenido de los fenoles solubles del pericarpio entre los maíces analizados. En los maíces experimentales se observó una tendencia hacia un mayor contenido de FL que en los comerciales (Cuadro 1).

La importancia de los fenoles del pericarpio en la tolerancia a plagas de almacén ha sido señalada por Sen et al. (1994), Bily et al. (2003) y García–Lara et al. (2004). La concentración de ácidos fenólicos libres (trans–ferúlico y p–cumárico) y diferulatos en esta estructura se ha relacionado con la tolerancia al ataque de Sitophilus zeamais (Motsch.) (García–Lara et al., 2004), lo mismo que las amidas fenólicas que se encuentran predominantemente en el pericarpio y de las cuales se han identificado: feruloilputrescina, p–cumaroilputrescina, diferuloilputrescina y di p–cumaroilputrescina (Sen et al., 1994).

La fracción de fenoles esterificados (FE) del grano de maíz está conformada principalmente por ácidos fenólicos que se encuentran unidos a moléculas de carbohidratos o amidas mediante enlaces éster (Arnason et al., 1992).

El endospermo del grano de las muestras analizadas tuvo un menor contenido de los tres tipos de fenoles solubles, con relación a lo observado para el pericarpio. La variación de estos compuestos fue: para FL, de 45–3 a 94.2 μg g^–1 MS; FG, de 12.0 a 20.7 μg g^–1 MS; FE, de 49.0 a 80.6 μg g^–1 MS. En el endospermo los fenoles se concentran en la capa de aleurona, con una menor presencia hacia el centro de esta estructura (Sen et al, 1994; Yu et al., 2001).

De las estructuras del grano, el germen presentó el mayor contenido de fenoles solubles: los FL fueron los más elevados, de 375.0 a 480.7 μg g^–1 MS; luego los FE, de 105.1 a 202.2 μg g^–1 MS; y los FG, de 17.9 a 45.0 μg g^–1 MS. Los valores de FL en el germen de las muestras estudiadas fueron mayores a lo informado por Bakan et al. (2003), quienes indican un contenido de 13.49 μg g^–1 de MS. Estas diferencias se deben al método de cuantificación usado en cada caso y a su especificidad, ya que los autores mencionados utilizaron HPLC para cuantificar sólo una fracción de los FL, que fueron los ácidos fenólicos. En cambio en el presente trabajo se cuantificaron todos los fenoles del extracto por el método de F–C, lo que lleva a valores elevados, como lo muestran De la Parra et al. (2007) quienes encontraron un intervalo de 347 a 500 μg g^–1 MS en grano entero de cinco genotipos, usando F–C. Los maíces con pigmentos tipo antociano (grano azul o negro) presentan valores aún más elevados, por la presencia de las antocianinas (Lopez–Martinez et al, 2009).

El método de F–C se usa ampliamente para medir fenoles en tejidos de plantas, sin embargo, puede haber reacciones con sustancias reductoras diferentes a los compuestos fenólicos, como azúcares o acido ascórbico (Robbins, 2003; Ainsworth y Gillespie, 2007). En las muestras analizadas en el presente trabajo, por la polaridad del disolvente usado para extraer los FL (acetato de etilo), es difícil que algunos azúcares, muy polares estuviesen en el extracto, pero sí otros fenoles diferentes a ácidos fenólicos y que redujeron el reactivo de F–C. Asi, será necesario determinar los compuestos fenólicos presentes en el extracto de FL de las estructuras del grano de maíz, además de las amidas fenólicas determinadas por Sen et al. (1994) y los ácidos fenólicos cuantificados por Bakan et al. (2003). El desengrasado realizado en el germen de las muestras previo a su análisis, favoreció la concentración de los demás constituyentes, entre ellos los fenoles, debido a que esta estructura contiene aproximadamente 35 % de aceite (Watson, 2003).

La variabilidad entre genotipos del contenido de los diferentes tipos de fenoles solubles en las estructuras del grano fue baja, no obstante que se observaron diferencias significativas. Los maíces usados en el estudio provienen del Instituto Público de Investigación (INIFAP) y privada (Monsanto) que produce semillas en México. Los maíces de INIFAP son genotipos desarrollados para las zonas de los Valles Altos del centro del país y que comparten germoplasma común, lo que podría explicar la poca variabilidad del contenido de fenoles en cada estructura del grano. Los maíces de Monsanto podrían estar en la misma situación, ya que son materiales desarrollados para condiciones de altura.

Cuando se analizan muestras contrastantes en color de grano y zonas de producción la variabilidad es mucho más elevada. Así, Lopez–Martinez et al. (2009) indican un intervalo de 330 a 6800 μg g^–1 de MS para FL en muestras de grano blanco, amarillo, rojo, morado y negro. Sin embargo, esta variabilidad se redujo entre muestras de un mismo color de grano, ya que para las rojas (n=6) el intervalo fue de 500 a 1230 μg g^–1 de MS.

Sumando los FL, FG y FE para cada estructura del grano se obtuvieron los valores de fenoles solubles que se muestran en el Cuadro 2. El mayor contenido se presentó en el germen, seguido del pericarpio y endospermo. Resultados similares fueron informados por Bakan et al. (2003), quienes atribuyeron a la elevada concentración de FS del germen la nula producción de tricotecenos (micotoxinas) por razas de F. graminearum inoculadas en muestras esterilizadas y molidas de esta estructura del grano.

Fenoles insolubles

El contenido de fenoles insolubles (FI) en las tres estructuras del grano fue mayor que cualquiera de los fenoles solubles, o bien la suma de ellos. Lo anterior coincide con lo observado por Adom y Liu (2002) y De la Parra et al, 2007, quienes señalaron que este tipo de fenoles domina en los cereales (Adom y Liu, 2002;).

Los FI en el pericarpio tuvieron un intervalo de 872.2 a 1037.8 μg g^–1 MS en el endospermo fue 445.0 a 662.2 μg g^–1 MS, y en el germen fue de 766.4 a 1092.7 μg g^–1 MS (Figura 1). En promedio, el mayor contenido de FI se presentó en el pericarpio y el menor en el endospermo, resultado que coincide con el reportado por Arnason et al. (1992), Sen et al. (1994) y Bily et al. (2003).

Los FI de las estructuras del grano de maíz se encuentran ligados a los componentes de la pared celular. El ácido ferúlico, que es el fenol más abundante en esta fracción, forma conexiones entre los fragmentos de lignina a través de enlaces éter, y con las arabinoxilanas por medio de enlaces éster. Este ácido también forma puentes diferúlico entre las heteroxilanas que constituyen la hemicelulosa de la pared celular, lo cual contribuiría a dar mayor resistencia a las paredes celulares del pericarpio y favorecía la tolerancia del grano a plagas de almacén (Bily et al, 2003) y a algunos hongos como Fusarium spp.

Con la hidrólisis alcalina aplicada al residuo, los ácidos fenólicos esterificados a los polisacáridos de la pared celular del tejido y los diferulatos unidos a las heteroxilanas son liberados, y pueden por tanto reducir el reactivo de F–C. Del total de FI del germen y la fracción desgerminada del grano de maíz, un 74.5 % son ácidos fenólicos, principalmente ferúlico; el resto son diferulatos (Bakan et al. 2003). Para el germen, los valores obtenidos en las muestras por F–C son similares al valor informado por (Bakan etal., 2003) para una muestra de maíz amarillo (941.2 μg g^–1 MS).

Los datos del contenido de los diferentes tipos de fenoles en las estructuras del grano de los maíces analizados y los del porcentaje relativo de cada estructura en el grano, se usaron para calcular el contenido de los fenoles en el grano, pero sin considerar la aportación del pedicelo, ya que esta estructura no se analizó. Por motivos de espacio, sólo se muestran los valores para una muestra de cada grupo de maíces (INIFAP y Monsanto). Expresados de esta manera, el contenido de FT para el maíz HE–TCM fue 905.24 μg g^–1 MS, en tanto que en el hibrido Leopardo fue 922.5 μg g^–1 MS (Figura 2). El valor informado por Bakan et al (2003) es de 1088 μg g^–1 de MS , en tanto que De la Parra et al. (2007) señalan un valor de 2858 μg g^–1 de MS.

La mayor proporción de los fenoles del grano de maíz se encuentra en forma insoluble o ligada (más del 70 %). Dentro de los fenoles solubles, los FG representan una fracción muy pequeña (< 3 %) por lo que en algunos trabajos (Adorn y Liu, 2002; De la Parra et al. 2007) sólo se cuantifican los FL y los FE o conjugados.

Correlación entre contenido de fenoles y propiedades físicas del grano

Los resultados de las características físicas del grano en las muestras analizadas se muestran en el Cuadro 3: peso hectolítrico, 72.8 a 82.8 kg hL^–1; el índice de flotación, 7 a 59 %; peso de cien semillas, 31.8 a 36.8 g; reflectancia para el color del grano, 54.5 a 65.5 %. El peso hectolítrico presentó el mayor número de correlaciones con los diferentes tipos de fenoles: una correlación positiva y altamente significativa (p<0.01) entre esta variable y los FE del pericarpio; significativa (p<0.05) con los FL; altamente significativa con los FE del endospermo; significativa con los FE del germen; la única correlación negativa fue con los FI del germen (Cuadro 4). El peso hectolítrico representa la densidad aparente del grano de maíz y está directamente relacionado con su dureza (Salinas et al., 1992). La correlación positiva observada entre los FE de las tres estructuras del grano y el peso hectolítrico sugiere que este tipo de compuestos afecta la dureza del grano, es decir a mayor dureza hay mayor contenido. En la Figura 3 se presenta la regresión entre los FE del pericarpio (FEP) y endospermo (FEE) con el peso hectolítrico del grano.

El IF es una medida indirecta de la dureza del grano y a mayor valor hay menor dureza (Salinas et al., 1992). Esta variable mostró una correlación negativa y significativa con los FE y FL del pericarpio y con los FE del endospermo y germen. De acuerdo con estos resultados, los FE y FL de las estructuras del grano están relacionados con su dureza y son consistentes con lo reportado previamente por Bily et al. (2003) y García–Lara et al. (2004). Así mismo, Del Pozo–Insfran et al. (2006) reportan un mayor contenido de FL y FE en el grano de maíz blanco de textura dura, en relación con maíces de grano azul de textura harinosa.

La correlación entre los FL del pericarpio y el color del grano indica que mientras más cremoso sea éste, tendrá un mayor contenido de FL. El color del grano de maíz está dado por los pigmentos del pericarpio y de la capa de aleurona (Watson, 2003).

Los maíces blancos o cremosos son básicamente ácidos fenólicos y una fracción pequeña de flavonoides del tipo flavonoles, particularmente derivados de quercetina, que son incoloros o presentan tonalidades amarillo pálido (Adom y Liu, 2002; Pedreschi y Cisneros–Zevallos, 2007). Como no se encontró correlación con los fenoles del endospermo (la aleurona forma parte de esta estructura) en los maíces analizados, el color cremoso se puede atribuir a los fenoles del pericarpio.

Los maíces de grano cremoso no necesariamente producirán tortillas menos blancas que los de grano blanco, pues el color de la tortilla está relacionado más bien con los fenoles del endospermo (capa de aleurona) y su oxidación favorecida por el álcali de la nixtamalización (Salinas et al., 2007). Además, la correlación positiva del color del grano entre los FE y los FI del germen indica que los maíces más blancos (mayores valores de reflectancia) tendrán en su germen un mayor contenido de este tipo de fenoles. El tamaño del grano, expresado como peso de 100 granos (PCG), presentó correlación positiva con los FI del pericarpio, y una correlación negativa significativa con los FG del endospermo.

CONCLUSIONES

El contenido de fenoles solubles e insolubles fue estadísticamente diferente entre las estructuras del grano; los FL, fueron los fenoles solubles en mayor cantidad y el germen fue la estructura con el mayor contenido. El pericarpio tuvo el mayor valor de fenoles insolubles, seguido del germen y del endospermo. Se presentó diferencia estadística en el contenido de fenoles entre los maíces analizados.

Los fenoles esterificados del pericarpio y endospermo presentaron correlación positiva y altamente significativa con el peso hectolítrico, en tanto que fue negativa y significativa con el índice de flotación; ambas variables están relacionadas con la dureza del grano. El grado de cremosidad del grano estuvo correlacionado negativamente con los fenoles libres del pericarpio.

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