Desarrollo embrionario en ovejas Pelibuey y Suffolk en condiciones de estrés calórico

Embryonic development in Pelibuey and Suffolk ewes under heat stress conditions

Abigail Tabarez–Rojas¹, Antonio Porras–Almeraya¹, Humberto Vaquera–Huerta², Javier Hernández–Ignacio¹, Javier Valencia¹, Susana Rojas–Maya¹, Joel Hernández–Cerón^1,*

¹ Departamento de Reproducción. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México. Ciudad Universitaria, México, D. F. *Autor responsable: (jhc@servidor.unam.mx).

² Estadística. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230, Montecillo, Estado de México.

Recibido: Abril, 2008.
Aprobado: Junio, 2009.

RESUMEN

El estrés calórico antes y después de la ovulación afecta el desarrollo embrionario en la oveja y se han observado diferencias genéticas en termotolerancia. En el presente trabajo se evaluó si el estrés calórico durante el periodo posovulatorio reduce la proporción de embriones transferibles y de blastocistos en ovejas, y si el efecto es menor en ovejas adaptadas a climas cálidos (Pelibuey) que en las no adaptadas (Suffolk). Se superovularon 32 ovejas. El día 2 del ciclo (estro=día 0), las ovejas se asignaron aleatoriamente a dos tratamientos: 1) estrés calórico (n=16; 8 Pelibuey y 8 Suffolk), del día 2 al 6 permanecieron 6 h al día en una cámara climática a 37±2.5 °C y 25 % de humedad relativa (HR); 2) testigo (n=16; 8 Pelibuey y 8 Suffolk), se alojaron a temperatura ambiente (18±3 °C y 50 % de HR). Se determinaron las concentraciones de progesterona diariamente del día 0 al 7. Los embriones se recolectaron el día 7. No se encontró diferencia (p>0.05) entre el grupo de estrés calórico y el testigo en la proporción de embriones transferibles (55 vs 69 %), ni en la proporción de blastocistos (34 vs 42 %). Tampoco hubo diferencias entre razas (p>0.05). Una mayor proporción (p<0.05) de las ovejas del grupo de estrés calórico (26.7 %) tuvo regresión lútea prematura, pero ninguna en el grupo testigo. Se concluye que la exposición de ovejas Pelibuey y Suffolk a estrés calórico por 6 h diarias del día 2 al 6 después del estro no afecta el porcentaje de embriones transferibles ni de embriones que llegaron a la etapa de blastocisto, y no se observaron diferencias entre razas. El estrés calórico aumentó la proporción de ovejas con regresión prematura del cuerpo lúteo.

Palabras clave: Cuerpo lúteo, embriones, estrés calórico, ovejas.

ABSTRACT

Heat stress before and after ovulation affects embryonic development in sheep, and genetic differences in heat tolerance have been observed. In the present study, it has been assessed whether heat stress during the postovulatory period may reduce the proportion of transferable embryos and blastocysts in ewes, and if the effect on sheep adapted to warm climates (Pelibuey) is lower than that on unadapted ones (Suffolk). Thirty–two ewes were superovulated. On day 2 of the cycle (estrus=day 0), the ewes were randomly assigned to two treatments: 1) heat stress (n= 16, 8 Pelibuey and 8 Suffolk), from day 2 to 6 they stayed in a climatic chamber 6 h a day, at 37±2.5 °C and 25 % relative humidity (HR); 2) control (n=16; 8 Pelibuey and 8 Suffolk sheep), kept at environmental temperature (18±3 °C and 50 % HR). Progesterone concentrations were determined daily from day 0 to 7. The embryos were collected on day 7. There was no difference (p>0.05) between the group exposed to heat stress and the control with respect to the proportion of transferable embryos (55 vs 69 %), nor to the blastocyst proportion (34 vs 42 %); between breeds there were no differences either (p>0.05). A larger proportion (p<0.05) of ewes having been under thermal stress (26.7 %) had premature lu teal regression, but none of the control group. It is concluded that Pelibuey and Suffolk ewes, exposed to heat stress for 6 h daily from day 2 to 6 after estrus, are not affected in their percentage of transferable embryos, nor of embryos having reached the blastocyst stage, and no difference between breeds was observed. Heat stress increased the proportion of ewes with premature luteal regression.

INTRODUCCIÓN

En la vaca, la exposición a estrés calórico provoca alta incidencia de mortalidad embrionaria (Hansen et al., 2001), reduce la expresión de la conducta estral (De Rensis y Scaramuzzi, 2003), afecta la esteroidogénesis en las células foliculares (Roth et al, 2001b; Bridges et al., 2005) y disminuye el potencial de los ovocitos para desarrollar un embrión viable (Al–Katanani et al., 2002; Roth y Hansen, 2004). Además hay diferencias raciales en la resistencia de los embriones al estrés calórico; así, los embriones de bovinos de razas adaptadas a los climas cálidos (Brahman y Romosinua–no) son más resistentes al estrés calórico que los embriones de las no adaptadas (Holstein y Angus) (Paula–Lopes et al, 2003; Hernández–Cerón et al, 2004).

En la oveja, los estudios del efecto del estrés calórico en la función reproductiva son limitados. La exposición a una temperatura ambiental mayor de 32 °C disminuye la fertilidad (Kleeman y Walter, 2005), y la exposición a estrés calórico por 6 h al día antes y después de la ovulación disminuye la proporción de embriones transferibles (Naqvi et al., 2004). En la oveja se han observado diferencias genéticas en la tolerancia al estrés calórico; las razas que evolucionaron en climas cálidos (Pelibuey) regulan mejor su temperatura corporal en condiciones de estrés calórico que las razas que lo hicieron en climas templados o fríos (Suffolk). Además, los linfocitos de ovejas Pelibuey producen mayores concentraciones de la proteína de choque térmico 70 (HSP–70) que los de ovejas Suffolk en condiciones de estrés calórico in vitro (Montero et al, 2006).

De acuerdo con lo anterior, es importante determinar si la exposición a temperaturas ambientales altas durante el periodo posovulatorio afecta el desarrollo embrionario en la oveja y conocer si hay diferencias genéticas en la susceptibilidad a dicho efecto. El objetivo del presente estudio fue evaluar si la exposición a estrés calórico durante el periodo posovulatorio reduce la proporción de embriones transferibles y de embriones que llegan a la etapa de blastocisto en la oveja y si este efecto es menor en las ovejas adaptadas al clima cálido (Pelibuey) que en las no adaptadas (Suffolk).

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo se realizó en una estación experimental de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México, localizada en la carretera federal México–Cuernavaca. El clima de la región es semifrío–semihúmedo, con lluvias de mayo a octubre (precipitación anual de 800 a 1200 mm) (García, 1981).

Animales experimentales y tratamientos

En las ovejas se insertó una esponja intravaginal con 40 mg de acetato de fluorogestona (FGA) (ChronoGest, Intervet), la cual permaneció in situ 10 d. Dos días antes de retirar la esponja inició el tratamiento superovulatorio, para lo cual se usó la hormona folículo estimulante (FSH) de origen porcino (Folltropin–V, Bio niche): 180 mg im para las ovejas Pelibuey y 200 mg para las Suffolk, cada 12 h durante 4 d en un esquema decreciente. Al momento de retirar la esponja se aplicaron 0.075 mg de Cloprostenol (Prosolvin C, Intervet) y 24 h después inició la detección de estros dos veces al día, usando un carnero provisto con un mandil. En las hembras que presentaron estro se hizo monta dirigida con un semental de la misma raza cada 8 h, mientras permanecieron receptivas. Se colocó una esponja intravaginal con FGA en todas las ovejas 8 h después de la última monta (Mejía et al, 2000).

El día 2 del ciclo estral (estro = día 0), las ovejas se asignaron aleatoriamente a dos tratamientos: 1) estrés calórico (n=16; 8 Pelibuey y 8 Suffolk), del día 2 al 6 del ciclo permanecieron 6 h al día en una cámara climática a 37±2.5 °C y 25 % de humedad relativa (HR) [índice temperatura humedad (THI)=82]; 2) testigo (n=16; 8 Pelibuey y 8 Suffolk), se alojaron a temperatura ambiente (18±3 °C y 50 % de HR; THI=63). Se registraron la temperatura rectal y la frecuencia respiratoria durante el periodo de exposición.

Toma de muestras y medición de progesterona

En las ovejas se tomó una muestra de sangre diariamente del día 0 al 7 después del estro. Las muestras se recolectaron mediante punción en la vena yugular en tubos al vacío con anticoagulante (heparina) y se centrifugaron 15 min a 1500 x g. El plasma fue separado y conservado a –20 °C hasta su análisis. Se determinaron las concentraciones de progesterona mediante radioinmunoanálisis en fase sólida (Coat–A–Count, DPC, USA), con una sensibilidad del ensayo de 0.1 ng mL^–1 y un coeficiente de variación intraensayo de 13.6 %.

Se consideró que ocurrió regresión prematura del cuerpo lúteo cuando las concentraciones de progesterona se elevaron más de 1 ng mL^–1 después del estro y regresaron a niveles básales el día 7 (Mejía et al, 2000). Al momento de la recolección embrionaria se evaluaron visualmente los cuerpos lúteos: <5 mm de diámetro y blanquecinos fueron clasificados como cuerpos lúteos en regresión, mientras que los cuerpos lúteos >5 mm de diámetro y rojizos se clasificaron como normales (Schiewe et al., 1991).

Recolección embrionaria

Los embriones se recolectaron mediante laparotomía media ventral 7 d después del estro. Las estructuras recuperadas fueron clasificadas con base en su morfología (Lindner y Wrigth, 1983). Después de la recolección, los embriones se procesaron para determinar el número de células, de acuerdo con la técnica descrita por Hernández–Cerón et al. (2004).

Análisis estadístico

El diseño estadístico fue completamente al azar. Se compararon la temperatura rectal y la frecuencia respiratoria entre tratamientos y entre razas mediante análisis de varianza para mediciones repetidas y el modelo de análisis mixto (Proc MIXED) usando SAS (2003). El porcentaje de ovejas con regresión prematura del cuerpo lúteo, de acuerdo con los niveles de progesterona plasmática, se comparó con una prueba de dos proporciones binomiales (Montgomery y Hiñes, 1993). Las proporciones de cuerpos lúteos con regresión prematura, de embriones transferi–bles y de blastocistos, se analizaron mediante una comparación de medias de dos poblaciones Poisson independientes, usando el paquete estadístico MINITAB (Minitab, 2006). El número de células embrionarias se comparó mediante análisis de varianza por el procedimiento GLM (SAS, 2003), previa transformación de los datos (raíz cuadrada) para satisfacer el supuesto de normalidad (Federer, 1955).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las proporciones de embriones transferibles y de embriones que llegaron a la etapa de blastocisto fueron similares entre tratamientos (p>0.05) y no hubo diferencias entre razas (p>0.05; Cuadro 1). Estos resultados son diferentes a los obtenidos por Naqvi et al. (2004), donde la exposición a estrés calórico durante el periodo pre y posovulatorio redujo la proporción de embriones transferibles en ovejas Merino. La diferencia de los resultados entre ambos estudios probablemente obedece al grado del estrés calórico y al periodo de exposición. En el presente trabajo las ovejas fueron sometidas a una temperatura de 37 °C y 25 % de HR por 6 h diarias del día 2 hasta el día 6 posestro, mientras que en el estudio de Naqvi et al. (2004) las ovejas fueron expuestas a 40 °C y 58 % de HR por 6 h al día durante 4 semanas (antes y después de la ovulación). Así, la combinación de mayor temperatura y humedad en el estudio de Naqvi et al. (2004) pudo provocar un grado mayor de estrés calórico en las ovejas que en el presente estudio. Además, la exposición antes de la ovulación pudo influir en la respuesta, ya que hay evidencia de que el estrés calórico afecta el desarrollo folicular y, en particular, a los ovocitos (Roth y Hansen, 2005). Según Roth et al. (2001a), la exposición de vacas lecheras a estrés calórico durante el verano afecta la fertilidad en el otoño. Asimismo, los ovocitos recolectados de vacas expuestas a estrés calórico tienen menor potencial para desarrollar embriones viables en condiciones in vitro (Al–Katanani et al, 2002). Los resultados del presente trabajo también difieren de los encontrados en estudios in vitro con embriones bovinos; Rivera y Hansen (2001) y Paula–Lopes y Hansen (2002) observaron que 6 h de estrés térmico en cualquiera de los días 2 a 4 posfertilización afecta negativamente el desarrollo embrionario.

En la oveja la fertilidad está negativamente correlacionada con el número de días de la semana durante el empadre en que la temperatura ambiental es mayor de 32 °C (Kleemann y Walker, 2005), lo cual concuerda con los resultados de Naqvi et al. (2004) donde la exposición a 40 °C durante el periodo pre y posovulatorio redujo la proporción de embriones transferibles. Los estudios citados y los resultados del presente trabajo, donde no se observó un efecto negativo del estrés calórico durante el periodo posovulatorio en el desarrollo embrionario, permiten proponer que en la oveja el estrés calórico afecta la fertilidad sólo después de un periodo largo de exposición que incluya los periodos pre y posovulatorio y que posiblemente se requiere mayor grado de estrés calórico para afectar el desarrollo temprano del embrión.

La ausencia de diferencias genéticas en la susceptibilidad de los embriones al estrés calórico contrasta con lo observado en estudios con bovinos, donde los embriones de vacas de razas adaptadas a climas cálidos (Brahman y Romosinuano) son más resistentes al estrés calórico que los embriones de vacas no adaptadas (Holstein y Angus) (Paula–Lopes et al., 2003; Hernández–Cerón et al, 2004).

El número de células embrionarias fue similar entre tratamientos y no se observó efecto de la raza, ni de la interacción tratamiento × raza (p>0.05; Cuadro 2). Estos resultados son diferentes a los obtenidos en otros trabajos, donde la exposición de embriones bovinos a estrés calórico reduce la proporción de embriones que llegan a la etapa de blastocisto y el número de células de estos embriones (Jousan y Hansen, 2004; Sakatani et al, 2004). Aunque en el presente estudio se evaluaron los efectos más evidentes del estrés calórico en los embriones, falta determinar si hay diferencia en la proporción de células en apoptosis, ya que esta condición indica el daño embrionario provocado por el estrés calórico (Paula–Lopes y Hansen, 2002; Jousan y Hansen, 2004).

El estrés calórico afectó la función del cuerpo lúteo, ya que 30.1 % de los cuerpos lúteos de las ovejas sometidas a estrés calórico tuvieron regresión prematura en contraste con 9–5 % en las del grupo testigo (p<0.01). Cabe señalar que la evaluación anterior se hizo visualmente, con base en el tamaño y color de los cuerpos lúteos (Schiewe et al., 1991), pero la regresión lútea fue corroborada con los niveles plasmáticos de progesterona; así, 26.7 % de las ovejas del grupo de estrés calórico mostraron regresión prematura, mientras que ninguna oveja del grupo testigo la presentó. Este hallazgo es interesante ya que en nuestro conocimiento no se había informado antes. El mecanismo por el cual el estrés calórico indujo la regresión lútea prematura se desconoce. Sin embargo, en los rumiantes domésticos es frecuente que se desarrollen cuerpos lúteos de vida corta, por la falta de exposición a progesterona de un ciclo estral previo, como ocurre en la primera ovulación de la pubertad, en el posparto o al inicio de la estación reproductiva (Garverick et al., 1992). También los cuerpos lúteos de vida corta pueden presentarse en cabras (Saharrea et al., 1998) y ovejas (Mejía et al, 2000) superovuladas. La regresión prematura del cuerpo lúteo ocurre por la secreción adelantada de la prostaglandina F2α (PGF2α), lo cual sucede cuando aparecen prematuramente receptores a oxitocina en el endometrio (Garverick et al, 1992).

Las ovejas que permanecieron en la cámara climática tuvieron un incremento (p<0.01) de la temperatura rectal y frecuencia respiratoria (Cuadro 3), lo cual es un indicador de estrés calórico (Finocchiaro et al., 2005). Además, el THI en la cámara climática fue superior (82) al THI en que las vacas (72) muestran baja fertilidad (Lozano et al., 2005). No obstante, la temperatura rectal de las ovejas mostró sólo un aumento de 0.4 °C, lo que contrasta con el aumento que tienen las vacas lecheras expuestas a estrés calórico, el cual puede ser hasta de 2.2 °C (Ealy et al, 1993). Esta diferencia en la temperatura rectal que experimentan las ovejas y las vacas en estrés calórico puede explicar la ausencia de un efecto en el desarrollo embrionario observado en el presente estudio. Las ovejas Pelibuey mostraron más tolerancia al estrés calórico, ya que durante el experimento su temperatura rectal y frecuencia respiratoria fueron siempre menores que las Suffolk, lo que coincide con otros estudios (Thimonier y Chemineau, 1988; Martínez et al, 2005). La mayor capacidad para regular la temperatura corporal de las ovejas Pelibuey estrés calórico puede obedecer fundamentalmente a los mecanismos de disipación del calor que desarrollaron estas ovejas durante su proceso de adaptación a los climas tropicales y subtropicales. Así, la presencia de pelo en lugar de lana y menores depósitos de grasa subcutánea en comparación con las ovejas Suffolk, contribuyen a que las ovejas Pelibuey pierdan calor y se termorregulen más eficazmente (Ross et al., 1985).

CONCLUSIONES

La exposición de ovejas Pelibuey y Suffolk a estrés calórico durante 6 h diarias del día 2 al 6 después del estro no afectó el porcentaje de embriones transferibles ni de embriones que llegaron a la etapa de blastocisto y no se observaron diferencias entre razas. El estrés calórico aumentó la proporción de ovejas con regresión prematura del cuerpo lúteo.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio fue financiado por el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) de la Universidad Nacional Autónoma de México, Proyecto IN222305.

LITERATURA CITADA

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