Cryopreservation of chrysanthemum shoot-tips (Dendranthema grandiflorum Kitam) by encapsulation-dehydration and vitrification
Antelmo Osorio Saenz1; José Oscar Mascorro Gallardo1¶; José Luis Rodríguez de la O1; Carlomagno Melchor López1; María Teresa González Arnao2
1 Departamento de Fitotecnia, Universidad Autónoma Chapingo, km 38.5 carretera México-Texcoco, Chapingo, Estado de México. C. P. 56230. MÉXICO. Correo-e: joscar@correo.chapingo.mx (¶Autor para correspondencia).
2 Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Veracruzana. Prol. Oriente 6, No. 1009. Orizaba, Veracruz, C.P. 94340. MÉXICO.
]]> Recibido: 15 de noviembre, 2010.
Resumen
El desarrollo de métodos biotecnológicos de crioconservación permite el almacenamiento de forma segura y a largo plazo del germoplasma de especies valiosas como el crisantemo, que es uno de los cultivos de mayor interés ornamental en México y en el mundo. En este trabajo se presentan los estudios realizados con crisantemo cv. Indianápolis White aplicando los métodos criogénicos de encapsulación-deshidratación y vitrificación para ápices aislados de plantas cultivadas in vitro. Los resultados obtenidos mostraron un comportamiento similar en la recuperación de los tejidos con ambos procedimientos. Los niveles máximos de sobrevivencia después de la crioconservación alcanzaron el 60 % con la encapsulación-deshidratación y el 74 % con la vitrificación. Sin embargo, las tasas de regeneración de nuevas plantas fueron bajas, del 12 y 10 %, respectivamente, transitando por una fase primaria de formación de callo. La optimización de las condiciones crioprotectoras permitirá mejorar la recuperación y hacer más efectivas ambas estrategias para la conservación de germoplasma de crisantemo.
Palabras clave: Biotecnología, cultivo de tejidos, germoplasma, Indianápolis White, nitrógeno líquido.
Abstract
The development of biotechnological methods of cryopreservation allows safe, long-term germplasm storage of valuable species such as chrysanthemum, which is one of the most important ornamental plants in Mexico and around the world. This study used the cryogenic methods of encapsulation-dehydration and vitrification to conserve chrysanthemum cv. Indianapolis White plants grown in vitro. Results showed similar behavior with both procedures during tissue recovery. The highest survival rates after cryopreservation were 60 % for encapsulation-dehydration and 74 % with vitrification. However, regeneration in both cases passed through a primary phase of callus formation and rates of obtention of new plants were low, 12 and 10 %, respectively. Therefore, further research is needed to improve cryoprotectective conditions in order to increase rate of recovery of chrysantemum plants.
Key words: Biotechnology, tissue culture, germplasm, Indianapolis White, liquid nitrogen.
]]>INTRODUCCIÓN
El crisantemo (Dendranthema grandiflorum Kitam) es una de las especies ornamentales más importantes en la industria de las flores a escala mundial. Las semillas de crisantemo son altamente heterocigóticas, y por esta razón la planta se propaga vegetativamente (Teixeira da Silva, 2004). El principal uso del crisantemo es como una flor de corte, aunque también es utilizado para decorar interiores, ya sea en maceta o en jardines. Recientemente, se han descubierto otros usos, como tener propiedades culinarias, medicinales y además, como un interesante etnofármaco (Teixeira da Silva, 2003). La demanda de esta planta ornamental es gracias a la gran diversidad de formas y colores que presenta. El mejoramiento genético de este cultivo ha llevado a la generación de muchas variedades, mismas que resulta difícil mantener en campo, por lo que se ha recurrido a la conservación in vitro para concentrar el mayor número de accesiones posibles a largo plazo en poco espacio y a bajo costo.
Existen dos estrategias para el almacenamiento de germoplasma vegetal in vitro: los métodos de crecimiento lento o reducido para la preservación por meses, y la crioconservación, que consiste en el almacenamiento en nitrógeno líquido (NL) a -196 °C (Fukai, 2003), lo cual garantiza el almacenamiento por años. Diversas técnicas criogénicas, tales como el método clásico de congelación programada, la encapsulación-deshidratación, la vitrificación y la gota-vitrificación se han aplicado a ápices de diferentes especies de crisantemo (Fukai, 1990; Fukai et al. 1991; Hitmi et al. 1997; Hitmi et al. 2000; Halmagyi et al. 2004; Martín y González-Benito, 2005), sin embargo, el cultivar Indianápolis White no ha sido sometido antes a la crioconservación bajo ningún tipo de protocolo.
El objetivo de este trabajo fue comparar la aplicación de las técnicas criogénicas de encapsulación-deshidratación y vitrificación, para almacenar en nitrógeno líquido ápices de crisantemo aislados de plantas in vitro del cultivar Indianápolis White.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se creó un lote de plantas madre de crisantemo (Dendranthema grandiflorum Kitam cv. Indianápolis White in vitro a partir de esquejes [6a8cm de longitud] de plantas crecidas en invernadero y que se multiplicaron in vitro en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) semisólido suplementado con AIA 1 mg·L-1, BA 3 mg·L-1 y sacarosa 30 g·L-1, solidificado con agar 7 g·L-1, a un pH de 5.7, para los procesos de Encapsulación-Deshidratación y Vitrificación. El medio MS contenido en frasco Gerber® se esterilizó en autoclave a 120 °C a una presión de 1.5 kgcm-2. Los cultivos fueron incubados a 25±1 °C bajo un fotoperiodo de 16/8 h (día/noche) con una intensidad lumínica de 68 µmol·m-2·s-1, provista por lámparas fluorescentes de luz blanca.
Crioconservación
Se usaron plántulas de crisantemo in vitro de cuatro semanas de edad, a partir de las cuales se extrajeron, con ayuda del microscopio estereoscópico, los ápices (0.5 a 1 cm de longitud) consistentes del domo meristemático y dos a tres primordios foliares. Los tejidos aislados se transfirieron a frascos con medio MS semisólido para su cultivo y se mantuvieron incubados bajo las mismas condiciones descritas para las plantas madre.
]]> Encapsulación-Deshidratación (E-D)La técnica de E-D se llevó a cabo según el procedimiento de González-Arnao et al. (1993), probando diferentes tratamientos en las etapas preparativas a, c y d, antes de la inmersión en nitrógeno líquido: a) precultivo de los ápices en medio MS semisólido con sacarosa a 0.1 M o 0.3 M por 24 o 48 horas; b) encapsulación de los ápices precultivados en 3 % de alginato de sodio (SIGMA-ALDRICH®), polimerizado con cloruro de calcio (CaCl2) a 0.1 M, para formar cápsulas de alginato de calcio de aproximadamente 5 mm de diámetro; c) pretratamiento de los ápices encapsulados en medio MS líquido suplementado con sacarosa a 0.5 M o 0.75 M por 24 o 48 h, o pretratamiento progresivo aumentando la concentración de 0.5 a 0.75 M por 24 h en cada condición. Todos los pre-tratamientos en medio líquido se realizaron colocando las muestras a 25 °C en un agitador orbital a 90 rpm; d) deshidratación de las cápsulas en contenedores de vidrio sellados herméticamente con 250 g de gel de sílice y colocando 10 cápsulas con tejido por contenedor a 25 °C por 2.5, 4 o 7 h equivalentes a contenidos de humedad en la cápsula de 30, 26 y 22 %, respectivamente; e) transferencia de las muestras deshidratadas a crioviales para su congelamiento en NL; f) almacenamiento por una hora en NL y extracción de las muestras de los crioviales para su descongelamiento mediante la exposición a la temperatura ambiente en la campana de flujo laminar (1 a 3 min); g) cultivo de los ápices encapsulados y descongelados en el medio MS durante una semana en la oscuridad y posteriormente transferidos a las condiciones de iluminación descritas para las plantas madre por al menos otros 30 días.
Vitrificación (V)
El método de vitrificación utilizado y los tratamientos probados en la etapa c (Cuadro 4) (1-2-3) se describen a continuación: a) precultivo de ápices en medio MS semisólido con sacarosa a 0.3 M por 48 h, incubados bajo las mismas condiciones descritas anteriormente para la planta madre; b) tratamiento de carga de los ápices mediante su exposición a la solución compuesta por glicerol a 2 M + sacarosa a 0.4 M por 20 min a 25 °C; c) deshidratación osmótica de los ápices con las soluciones de vitrificación PVS2 (glicerol 30 % + etilen glicol 15 % + dimetil sulfóxido 15 % + sacarosa 0.4 M) (Sakai et al., 1990) o PVS3 (glicerol 50 % + sacarosa 50 %) (Nishizawa et al., 1993), en 0.7 ml de cada una contenida en crioviales y realizando el tratamiento a 4 ó 25 °C por 0, 30 o 60 min de exposición; d) inmersión de los ápices al NL en los crioviales con solución fresca de las respectivas PVS utilizadas para la deshidratación osmótica y almacenamiento por una hora en NL; e) extracción de las muestras de los crioviales para su descongelamiento en un baño de agua a 40 °C, removiendo las soluciones PVS con dos lavados por 15 min en medio MS líquido con sacarosa 1.2 M (pH 5.7) a 25 °C, y f) cultivo de los ápices descongelados en medio MS para su recuperación, en oscuridad por una semana y transferidos posteriormente a las condiciones de iluminación en las que se mantuvieron las plantas madre por al menos otros 30 días.
Evaluación de la viabilidad
]]> La sobrevivencia y regeneración de nuevos brotes a partir de los ápices sometidos a ambos procedimientos criogénicos (E-D y V) se evaluaron a los 15 y 45 días respectivamente después de iniciado el recultivo de los ápices. Todos los resultados se expresaron en porcentajes y para el caso del protocolo de E-D se evaluaron ambos parámetros después de cada una de las etapas del proceso. Cuando se aplicó el método de V, la sobrevivencia y regeneración de los ápices se registraron solamente después de realizada la inmersión en NL de las muestras previamente sometidas a las condiciones de temperatura y tratamientos crioprotectores descritos para las dos soluciones PVS.Análisis estadístico
Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con 12 repeticiones por tratamiento probado en la técnica de E-D e igual en la de V. La unidad experimental consistió de una caja petri con 10 ápices. Los datos se analizaron mediante pruebas de comparación de dos proporciones binomiales por pares de tratamientos (Infante y Zárate, 1984) con P<0.05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Encapsulación-Deshidratación
La totalidad de los ápices precultivados en medio semisólido suplementado con 0.1 M de sacarosa, sobrevivió a los dos tiempos de tratamiento estudiados (Cuadro 1). Esto demuestra que a tan baja concentración no se produce un efecto de acumulación intracelular de este azúcar que afecte la viabilidad de los tejidos. En cambio, a la concentración de 0.3 M, la sobrevivencia se redujo a medida que aumentó la duración del precultivo, pero al no encontrarse diferencias estadísticas (P<0.05) entre 24 y 48 h, se determinó en lo sucesivo aplicar el precultivo en 0.3 M de sacarosa por 48 h, para garantizar una mayor asimilación de este azúcar en todos los tejidos, ya que esto puede ser favorable para soportar mejor las siguientes etapas de la crioconservación (González Arnao y Engelmann, 2006).
La sobrevivencia de los ápices pretratados en medio semisólido con 0.3 M de sacarosa por 48 h, encapsulados y sometidos al siguiente pretratamiento en medio líquido, disminuyó igualmente en proporción con el incremento de la concentración de sacarosa y de la duración del tratamiento (Cuadro 2).
Sin embargo, el pretratamiento progresivo a concentraciones crecientes de sacarosa (0.5 M + 0.75 M por 24 h c/u) produjo resultados a un nivel intermedio y sin diferencias significativas entre el tratamiento más prolongado a la menor concentración (0.5 M por 48 h) y el más corto (24 h) en 0.75 M. Esta respuesta indica que si las concentraciones de sacarosa se van incrementando paulatinamente, se puede inducir una mayor penetración de sacarosa a las células provocando un menor estrés. A pesar de que con este pretratamiento ocurre una disminución en las tasas de sobrevivencia, es importante considerar que una mayor asimilación de azúcar puede contribuir a generar una mayor tolerancia a condiciones más severas de deshidratación (González-Arnao y Engelmann, 2006). Por lo tanto, esta condición de pretratamiento se definió como la más adecuada, considerando que puede conferir mayor protección a los tejidos al secar las cápsulas y sobre todo durante la inmersión en NL.
Con el proceso de desecación realizado en presencia de gel de sílice, la viabilidad de los ápices de crisantemo se redujo aún más en comparación con el pre-tratamiento en medio líquido y, a su vez, en la medida en que el contenido de humedad de la matriz de alginato de calcio fue menor. Sin embargo, la sobrevivencia fue la misma antes y después de la inmersión en NL cuando la humedad en la cápsula fue del 26 %, siendo la única variante que permitió la regeneración de brotes a partir de los tejidos después de la crioconservación en NL (Cuadro 3).
]]> Cuando las cápsulas fueron deshidratadas hasta un 22 % de humedad, aparentemente ocurrió una sobredeshidratación de los tejidos, ya que se observa una pérdida drástica de la sobrevivencia tanto antes como después de congelar en NL, anulándose totalmente la regeneración de los ápices.La regeneración de los ápices de crisantemo crioconservados por E-D, pasó por una fase primaria y transitoria de callo (Figuras 1 y 2), originada aparentemente en la región asociada a la zona meristemática y basal de los primordios de hoja, tal y como se reporta en la regeneración de ápices de yuca (Mandal, 2000). González-Arnao y Engelmann (2006); aplicando el método de E-D en ápices de caña de azúcar lograron conservar la integridad estructural y funcional del meristemo apical, pudiendo regenerar plantas completas sin pasar por la fase de callo.
Las observaciones en la recuperación de los ápices, muestran claramente una fase de desorganización celular o formación de callo de los ápices antes de la formación de nuevos brotes, evidenciando que primero es necesaria la recuperación de las células antes de que el crecimiento y la diferenciación puedan reiniciar.
En la Figura 2 se presenta el protocolo de E-D que permitió obtener una sobreviviencia del 60 % y una regeneración a plantas completas del 12 % de los ápices crioconservados de crisantemo Indianápolis White, lo que puede ser un buen punto de partida para probar otros tratamientos en las etapas críticas del procedimiento (precultivo, pretratamiento y desecación de las cápsulas) que permitan elevar la eficiencia de recuperación después de la crioconservación (Martín y González Benito, 2005; González-Arnao y Engelmann, 2006).
Vitrificación
Con la técnica de V, comparando el efecto de dos soluciones PVS, a dos temperaturas de exposición, se obtuvieron los resultados que se muestran en el Cuadro 4.
La sobrevivencia de los ápices disminuyó en la medida en que aumentó el tiempo de exposición a las soluciones vitrificadoras, independientemente de la temperatura de aplicación. La transferencia inmediata al NL, cuando los tejidos fueron inmersos en la solución vitrificadora PVS3 a 25 °C, garantizó los mejores resultados y fue la única variante que permitió la regeneración del material después del congelamiento en NL.
Esto puede deberse a que a 25 °C, la mezcla PVS2, que contiene componentes muy penetrantes como es el caso del dimetil sulfóxido, resulte más citotóxica debido a que logra penetrar más rápidamente que la PVS3 a las células y los tejidos. En general, los tratamientos con las soluciones vitrificadoras a las dos temperaturas evaluadas, provocaron una disminución de la sobrevivencia inferior o igual al 50 %, cuando se aplicaron más allá de los 30 min, sin que se obtuviera tampoco regeneración de nuevos brotes después de congelar en ninguno de los casos.
Para la crioconservación de ápices de rosa (Halmagyi y Pinker, 2006) y ápices de crisantemo cv. Escort (Halmagyi et al., 2004), al extender la duración de la deshidratación con PVS2 a 25 min y aplicar un protocolo de 2 etapas (50 % de la concentración de la solución vitrificadora durante 10 min + 100 % de la concentración por 15 min), se mejoró la sobrevivencia y regeneración de los tejidos crioconservados. Esta evidencia corrobora que la crioprotección con la PVS2 puede ser muy eficiente, si se induce tolerancia en los tejidos susceptibles a través de la exposición progresiva a concentraciones crecientes de la solución vitrificadora PVS2, con lo cual se soporta mejor el estrés osmótico que impone el 100 % de la solución.
En general, las PVS no resultaron excesivamente tóxicas para los ápices de crisantemo cv. Indianápolis White cuando los tratamientos no sobrepasaron los 30 min de exposición. No obstante, el hecho de no obtenerse una buena regeneración a partir del material crioconservado, muestra que las condiciones de crioprotección deben ser mejoradas, así como las pertinentes a la fase de recuperación. Los valores obtenidos para Indianápolis White son aún bajos si se comparan con los reportados en la literatura para otros cultivares de crisantemo crioconservados.
]]> Al igual que cuando se aplicó la técnica de E-D, la producción de nuevos brotes registrada sólo en el tratamiento con PVS3 a 25 °C e inmersión inmediata en NL, pasó inicialmente por una fase primaria de formación de callo. Las células viables retuvieron un color verdoso, que posteriormente regeneraron a plantas completas (Figura 3), mientras que las células no viables mostraron un alto grado de células muertas (oscuro a blanco). El blanqueamiento aparente de las células son síntomas de crio-daño, plasmólisis y estrés oxidativo (Korn, 1980; Grout y Henshaw, 1980), que ya era distinguible después de un día de cultivo a partir del descongelamiento de las mismas.En la Figura 4 se presenta el protocolo de vitrificación indicando las fases del proceso para obtener regeneración a plantas completas a partir de ápices de crisantemo Indianápolis White, según se determinó en este trabajo.
Existen reportes en los cuales se ha demostrado que la sobrevivencia y regeneración dependen del genotipo tratado (Fukai et al., 1991; Bagniol y Engelmann, 1992; Halmagyi et al., 2004; Wang et al., 2005). Por lo tanto, este es otro factor que se debe valorar, ya que lo ideal es desarrollar un método de crioconservación que sea aplicable a la mayor cantidad de genotipos.
Al comparar las dos técnicas criogénicas de E-D y vitrificación, no se encontraron diferencias en la eficiencia de regeneración de los ápices después del congelamiento en NL (12 y 10 %, respectivamente). Esto sugiere que se puede utilizar cualquier estrategia para la crioconservación de los ápices de crisantemo cv. Indianápolis White. No obstante, debe considerarse que el protocolo de E-D es más tardado, pero facilita la manipulación de gran cantidad de tejido al mismo tiempo; en cambio, la metodología de vitrificación si bien consume menos tiempo para realizar el protocolo, resulta más complicada cuando se tienen que manipular muchos tejidos de pequeñas dimensiones.
La recomendación de acuerdo a los resultados obtenidos en este trabajo es explorar más condiciones durante el precultivo y los pretratamientos que propicien una mejor protección de los tejidos durante la inmersión en NL, para poder incrementar los índices de regeneración de nuevas plantas después de la crioconservación y evitar la formación de callo durante la etapa inicial de desarrollo.
CONCLUSIONES
Los ápices de crisantemo cv. Indianápolis White pueden ser crioconservados aplicando los procedimientos de encapsulación-deshidratación o vitrificación con un régimen de enfriamiento rápido. Con la técnica de encapsulación-deshidratación se obtuvo 60 % de sobrevivencia, con un 12 % de regeneración de plantas completas, en tanto que con la técnica de vitrificación la sobrevivencia fue del 74 % y una regeneración del 10 %. Es necesario explorar más tratamientos previos a la ultracongelación en ambos protocolos para incrementar la eficiencia de regeneración y evitar la formación primaria de callo en el material recuperado. También se recomienda probar estos procedimientos en otros cultivares de crisantemo.
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