Biochemical responses in strawberry plants supplying phosphorus in the form of phosphite

Elías Estrada–Ortiz¹; Libia Iris Trejo–Téllez^1*; Fernando Carlos Gómez–Merino²; Roberto Núñez–Escobar¹; Manuel Sandoval–Villa¹

¹ Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo. km 36.5 Carretera México–Texcoco. C. P. 56230, Montecillo, Estado de México. Correo–e: tlibia@colpos.mx (*Autora para correspondencia)

² Colegio de Postgraduados, Campus Córdoba. km 348 Carretera Córdoba–Veracruz. C. P. 94946, Amatlán de los Reyes, Veracruz.

Resumen

En esta investigación se evaluó la concentración de azúcares solubles totales, clorofilas a, b y total en las fases de floración y fructificación, y de aminoácidos libres y proteínas solubles en la fase de fructificación, en hojas de fresa cv. Festival en respuesta a la adición de distintos porcentajes del P total suministrado en forma de fosfito (0, 20, 30, 40 y 50 %) a la solución nutritiva. Cuando 20 % del P total en la solución nutritiva fue adicionado como fosfito, la concentración de azúcares se incrementó significativamente sólo en la fase de floración. El contenido de clorofila a en la fase de floración no presentó diferencias significativas entre tratamientos conteniendo fosfito con respecto al testigo; por el contrario, durante la fructificación, el contenido mayor de clorofilas a, b y total se registró con la adición de 30 % de P como fosfito en la solución nutritiva. Los aminoácidos libres totales tuvieron una concentración que se relacionó de manera positiva con el porcentaje del P total como fosfito en la solución nutritiva en el intervalo de 0 a 30 %; cantidades porcentuales superiores de fosfito propiciaron un decremento en éstos. Una tendencia similar fue observada en la concentración de proteínas solubles totales; en esta variable la media más baja se registró en el testigo; siendo incluso diferente significativamente al tratamiento consistente en la adición del 50 % del P en forma de fosfito. Estos resultados permiten concluir que la adición del 30 % del P total a la solución nutritiva como fosfito, estimula la acumulación de biomoléculas en fresa en la etapa de fructificación.

Palabras clave: Fragaria x ananasa Duch.; azúcares solubles totales, clorofila, aminoácidos, proteínas solubles.

Abstract

In this study we evaluated the concentration of total soluble sugars, chlorophylls a, b and total during blooming stage and fructification stage, and free amino acids and soluble proteins during fructification stage, in strawberry leaves cv. Festival in response to the addition of P in the form of phosphite in different proportions (0, 20, 30, 40 and 50 %) in the nutrient solution. When 20 % of total P in the form of phosphite was added in the nutrient solution, the concentrations of sugars significantly increased only during the blooming stage. Content of chlorophyll a during blooming stage did not show significant differences among treatments containing phosphite with respect to the control treatment; on the contrary, during the fructification stage, the highest content of chlorophyll a, b, and total was recorded with the addition of 30 % of P as phosphite in the nutrient solution. Total free amino acids had a concentration positively related to the proportion of total P as phosphite in the nutrient solution in the range of 0 to 30 %; higher percentages of phosphite led to a decrease in free amino acids. A similar trend in the concentration of total soluble proteins was observed; variable in which the lowest mean in the control was registered; being significantly different to the treatment involving the addition of 50 % of P in the form of phosphite. These results led to the conclusion that the addition of 30 % of total P to the nutrient solution as phosphite stimulates the accumulation of biomolecules in strawberry plants during the fructification stage.

Key words: Fragaria x ananasa Duch.; total soluble sugars, chlorophyll, free amino acid; soluble proteins.

INTRODUCCIÓN

El fósforo (P) es un elemento esencial para el desarrollo y la reproducción de plantas superiores. Sus funciones no pueden ser realizadas por ningún otro nutrimento. Si no se le agrega la cantidad de fósforo suficiente a la planta, ésta no expresará su máximo potencial en rendimiento, puesto que este nutrimento es muy importante en el almacenamiento y transferencia de energía en las células vegetales (Fageria, 2008).

Este elemento es un componente estructural esencial de muchas biomoléculas y desempeña un papel fundamental en la conservación de la energía y la regulación del metabolismo. El ortofosfato inorgánico (Pi), la forma de fósforo asimilada, a menudo es un macronutrimento limitante tanto en los ecosistemas terrestres como en los acuáticos. Como consecuencia, la asimilación, almacenamiento y metabolismo del Pi están altamente regulados en los procesos que afectan directamente el crecimiento de las plantas (Raghothama, 1999).

Las plantas absorben el P en forma de fosfatos inorgánicos, principalmente como anión fosfato monobásico (H₂PO₄) y anión fosfato dibásico (HPO₄^2–). No obstante, la planta también puede, a través de sus enzimas, desprender grupos fosfatos de los compuestos orgánicos y posteriormente absorberlos. Este elemento, a diferencia del nitrógeno y azufre, no es reducido en la planta al ser asimilado por ella, sino que es incorporado a los compuestos orgánicos en su mismo estado de oxidación (Alcántar et al., 2007).

Por otra parte, el anión fosfito es una forma reducida del fosfato (Bozzo et al., 2004). Los iones fosfito, al presentar gran semejanza en estructura con los fosfatos, son absorbidos por la planta vía transportadores de fosfatos y su velocidad de absorción es muy similar (Varadarajan et al., 2002).

El fosfito se está comercializado ampliamente para uso agrícola, ya sea como supresor de enfermedades (Rebollar–Alviter et al., 2007) o como fuente de P para la nutrición de los cultivos en medios donde éste puede ser oxidado a fosfato (McDonald et al., 2001a). Está bien establecido que el fosfito aumenta la resistencia a las enfermedades a través de un mecanismo que se conoce como resistencia sistémica adquirida (Andreu et al., 2004). El fosfito se ha empleado recientemente como fertilizante, con resultados contradictorios. Varadarajan et al. (2002) reportan que el fosfito no participa en las rutas bioquímicas en plantas, es decir, no es metabolizado, y adicionalmente mostraron que no puede ser convertido a fosfatos dentro de la planta. Lo anterior se traduce en efectos negativos del fosfito sobre el metabolismo vegetal. Sin embargo, aplicado vía foliar incrementa el rendimiento y mejora la calidad en varios cultivos (Rickard, 2000).

En fresa, Moor et al. (2009) encontraron que la fertilización con fosfito no inhibe ni promueve el crecimiento de plantas de fresa; asimismo, la fertilización a base de fosfito no tiene ventajas sobre la fertilización con fosfatos en lo que al rendimiento respecta. No obstante, Moor et al. (2009) indicaron que la fertilización foliar con fosfito sí modificó el sabor de la fruta, incrementando su acidez y disminuyendo en consecuencia su concentración de azúcares.

El fosfito está siendo aplicado en cultivos de fresa en nuestro país como medida preventiva contra Phytopthora cactorum, sin que se haya evaluado el efecto que tiene sobre el cultivo. En el contexto anterior, esta investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto de diferentes porcentajes del P total en la solución nutritiva en forma de fosfito sobre la concentración de biomoléculas en hojas recientemente maduras (sitio predominante de fotosíntesis en plantas superiores, así como órganos de acumulación y suministro) de fresa cv. Festival. Las biomoléculas analizadas fueron azúcares solubles totales; clorofilas a, b y total, las cuales correlacionan de manera positiva con la tasa fotosintética de acuerdo a un gran número de reportes científicos; concentración de aminoácidos libres totales y proteínas solubles totales, al tener los aminoácidos libres una función esencial en el metabolismo vegetal y ser precursores de proteínas y ácidos nucleicos y asociarse su acumulación en respuesta a diversos tipos de estrés.

Condiciones experimentales

El presente trabajo se realizó en un invernadero tipo túnel localizado a 19° 29' latitud norte, 98° 53' longitud oeste y a una altitud de 2,250 m. La temperatura diurna tuvo un promedio de 24 ^oC, en tanto que la nocturna fue de 11 ^oC. La intensidad luminosa tuvo un promedio de 530 µmol·m^–2·s^–1. Se establecieron plantas de fresa (Fragaria x ananassa Duch.) cv. Festival en tezontle rojo previamente cribado para obtener un tamaño de partícula de 3 a 5 mm de diámetro, en bolsas negras de polietileno de 30 x 30 cm.

Tratamientos y diseño experimental

En este experimento se evaluaron cinco soluciones nutritivas con macro y micronutrimentos que se diferenciaron sólo en el porcentaje de fosfito (H₂PO₃^–). Estas soluciones nutritivas se formularon tomando como referencia la Solución Nutritiva Universal de Steiner (1984), cuya concentración al 50 % en molcm^–3 fue de 5.28 de NO₃^–, 0.72 de NH₄+, 0.5 de H₂PO₄^–, 3.5 de SO₄^2–, 3.5 de K+, 4.5 de Ca²+, y 2 de Mg²+. Las soluciones fueron complementadas con una mezcla de micronutrimentos, con las siguientes concentraciones (mg·L^–1): 1.6 de Mn, 0.11 de Cu, 0.865 de B, 0.023 de Zn, 0.048 de Mo, y 5 de Fe, en donde, el Mn, Cu y Zn se suministraron en forma de sulfatos; el B como H₃BO₃, Mo como H₂MoO₄ y el Fe como quelato (Fe–EDTA), de acuerdo al método descrito por Steiner y Van Winden (1970). Los reactivos utilizados para la preparación de las soluciones nutritivas fueron de la marca J. T. Baker, grado analítico.

Los porcentajes del P total en forma de fosfito en la solución nutritiva evaluados fueron 0, 20, 30, 40 y 50 %. El fosfito fue suministrado a partir de ácido fosfónico o ácido fosforoso (H₃PO₃, Sigma–Aldrich, 99 %); el pH de la solución se mantuvo ajustado entre 5.5 y 5.8 utilizando H₂SO₄ al 97 % o NaOH 1N, para garantizar que estuviera disponible el fosfito (Hanrahan et al., 2005). La adición de fosfito en la solución nutritiva de Steiner 50 % se hizo en la etapa de floración, y en la etapa de fructificación se usó una concentración del 75 %. El suministro de las soluciones nutritivas se realizó a través de un sistema de riego por goteo programado con un temporizador para suministrar ocho riegos de dos minutos cada uno. El gasto por gotero por día fue de 960 ml (120 ml por gotero).

Se utilizó un diseño en bloques al azar generalizado (BAG), teniendo cinco bloques, y en cada uno de ellos se ensayó cada tratamiento con tres repeticiones. La unidad experimental fue una bolsa negra de polietileno de 30 x 30 cm conteniendo una planta de fresa. Los resultados obtenidos se analizaron de manera independiente en cada una de las fases fenológicas.

Variables evaluadas

Se muestreó una hoja trifoliada recientemente madura y sin peciolo de diez de las quince plantas de cada uno de los tratamientos, las cuales se homogenizaron para las determinaciones que a continuación se describen.

Azúcares totales en hojas. Se determinaron en las etapas de floración y fructificación, por el método descrito por Southgate (1976) empleando antrona, ácido sulfúrico y etanol al 80 %. La absorbancia fue determinada a una longitud de onda de 620 nm en un espectrofotómetro (Spectronic 20, Bausch & Lomb, EEUU). Se utilizó glucosa como estándar para elaborar la curva de calibración.

Aminoácidos libres totales. Se realizó la extracción etanólica en hojas en la etapa de fructificación, siguiendo la metodología de Geiger et al. (1998) y se empleó el método de la ninhidrina (Moore y Stein, 1954). Se utilizó leucina para la elaboración de la curva estándar y se leyó a una longitud de onda de 570 nm en un espectrofotómetro (Thermo Fisher Scientific, Genesys 10 UV, Madison, WI 53711, USA).

Proteínas solubles totales. Se realizó la extracción de acuerdo a lo descrito por Hófner et al. (1989) en hojas en la etapa de fructificación. La cuantificación se hizo empleando negro de amido para la tinción y albúmina de suero bovino como proteína estándar. La absorbancia de las muestras fue leída en un espectrofotómetro (Thermo Fisher Scientific, Genesys 10 UV, Madison, WI 53711, EEUU) a una longitud de onda de 640 nm.

Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza de los datos obtenidos y las medias fueron comparadas usando la prueba de Tukey (P<0.05 %), para lo cual se utilizó el programa estadístico System Analytic Statistical (SAS Institute, 2003).

RESULTADOS

Concentración de azúcares totales en hojas

El análisis de varianza indicó que los azúcares totales en hojas de fresa, únicamente presentaron diferencias estadísticas significativas en la etapa de floración (Tukey, P<0.05); mientras que en la etapa de fructificación no se observaron diferencias estadísticas (Tukey, P>0.05). El análisis de comparación de medias muestra que el tratamiento con un porcentaje de 20 del P total como fosfito en la solución nutritiva en la etapa de floración, tuvo una mayor concentración de azúcares en hojas (Cuadro 1).

Concentración de clorofila

Las concentraciones de clorofila a en hojas tanto en floración como en fructificación no mostraron diferencias estadísticas entre tratamientos (Tukey, P<0.05) (Figuras 1 y 2). En la etapa de floración las plantas tratadas con 20 % de fosfito tuvieron menor concentración de clorofila a en sus hojas; por el contrario, las hojas de plantas tratadas con 50 % de fosfito presentaron mayor concentración de clorofila a (0.73 mg·g^–1) (Figura 1).

En la etapa de fructificación la comparación de medias indicó que el tratamiento con 30 % de fosfito mostró diferencias estadísticas significativas (Tukey, P<0.05) con el resto de los tratamientos, superándolos en más de 32 % (Figura 2).

El análisis de varianza mostró diferencias estadísticas significativas entre tratamientos en la concentración de clorofila b en hojas en la etapa de fructificación (Tukey, P<0.05); en floración la concentración de clorofila b no se vio influido significativamente por los tratamientos. En fructificación el tratamiento con mayor concentración de clorofila b (1.61 mg·g^–1) fue el de 30 % de fosfito, valor estadísticamente diferente al del resto de los tratamientos. Se observó que en fructificación la concentración de clorofilas a y b siguió la misma tendencia (Figura 2).

El análisis de varianza mostró que hubo diferencias estadísticas significativas en la concentración foliar de clorofila total sólo en la etapa de fructificación (Figura 2); en floración no hubo diferencia estadística significativa (Figura 1).

Aminoácidos libres totales

Los aminoácidos libres totales presentaron diferencias significativas entre tratamientos. Tales diferencias se observaron entre el tratamiento con 30 % de fosfito y el resto, registrándose en hojas de plantas tratadas con 30 % de fosfito la mayor concentración de aminoácidos en hojas de fresa (30.68 µM·g^–1) (Figura 3).

Los aminoácidos en las hojas se evaluaron en el periodo de fructificación y los resultados observados se relacionan de manera positiva con los niveles más elevados de clorofilas, ya que para el tratamiento con fosfito al 30 % en la solución nutritiva se observaron los valores más elevados de aminoácidos, igual que las concentraciones de proteínas.

Proteínas solubles totales

El tratamiento con la mayor concentración de proteínas totales fue el de 30 % del P total como fosfito (2.89 mg·g^–1), que fue diferente estadísticamente al resto de los tratamientos. El testigo fue el que presentó la menor cantidad de proteínas solubles totales (0.53 mg·g^–1); entre el tratamiento con 20 y 40 % de fosfito no hubo diferencias estadísticas significativas; mientras que el tratamiento de 50 % tuvo menor concentración de proteínas solubles totales que los tratamientos con 20, 30 y 40 % de fosfito, y superó únicamente al testigo (Figura 4).

DISCUSIÓN

El P tiene gran influencia sobre la fotosíntesis y el metabolismo del carbono. Bajo deficiencia de P, la acumulación de carbohidratos en raíces se incrementa significativamente (Li et al., 2001), registrándose correlaciones positivas entre la concentración de P en el medio, la concentración de P en la planta y la concentración de hexosas fosfato en las hojas (Silber et al., 2002), biomolécula precursora de almidón y sacarosa en cloroplastos y citosol, respectivamente. En la presente investigación, se observó un incremento significativo en la concentración de azúcares totales en la etapa de floración (Cuadro 1) con la adición de 20 % del P total en forma de fosfito, lo que representa un efecto positivo, dado que una alta concentración de éstos en la planta favorece producción precoz y aumenta rendimientos (Stapleton et al., 2001).

Por otra parte, el P es un nutrimento que tiene influencia sobre la estabilidad de la molécula de clorofila (Bojovic y Stojanovic, 2006). En Arabidopsis thaliana, Ticconi et al. (2001) reportaron que las hojas tratadas con altas concentraciones de fosfito tuvieron un color verde claro, lo que indica una posible alteración en la concentración de clorofila; en esta investigación, al añadir P total como fosfito a concentraciones de 40 y 50 % disminuyeron significativamente las concentraciones de clorofilas a, b y totales, sólo en fructificación, en comparación con el 30 %, que fue un porcentaje que elevó el contenido de estas biomoléculas (Figuras 1 y 2). En fresa, Blanque (2002) encontró que la concentración de clorofila total en hojas en la etapa de fructificación oscila entre 1.5 y 2 mg·g^–1 PMF, lo cual concuerda con lo obtenido en este experimento (contenido entre 1.8 y 2.2 mg·g^–1 PMF); excepto en el tratamiento con 30 % de fosfito en fructificación, en donde en particular se observó que la solución nutritiva con el 30 % del P total en forma de fosfito incrementó la concentración de este pigmento (2.68 mg·g^–1 PMF) en las hojas (Figura 2). El mismo autor señala que en hojas de fresa hay una mayor producción de clorofila a que de clorofila b, en una relación de 3–4:1, respectivamente; y por el contrario, en la presente investigación se observó que la concentración de clorofila b fue mayor a la de clorofila a para todos los tratamientos (Figuras 1 y 2).

A determinadas concentraciones, el fosfito puede causar estrés en las plantas y en cierto grado puede inhibir el crecimiento (Ticconi et al., 2001; Varadarajan et al., 2002). Una de las manifestaciones de este tipo de estrés es la producción de aminoácidos libres como asparagina, ácido aspártico y glutamina, situación que también se observó en este experimento al utilizar fosfito al 30 %, ya que supera al testigo que se encontraba bajo situación normal (Figura 3).

Los fosfitos inhiben la fosforilación de proteína cuando existe estrés por P. Bajo estas condiciones los fosfitos suprimieron la actividad de enzimas nucleolíticas y la expresión de la fosfatasa ácida y de genes transportadores de fosfato en A. thaliana (Ticconi et al., 2001). En particular en fresa, Gulen y Eris (2004) reportaron que al someter las plantas a estrés por calor, a medida que se incrementa la temperatura disminuye la concentración de proteínas en las hojas, pues hay una disminución en su síntesis, y quizás a temperaturas superiores a 40 °C una desnaturalización de éstas. En el presente experimento las plantas se sometieron a un estrés con fosfitos, y se observó que, a diferencia del estrés por temperatura, a ciertos porcentajes del P total como fosfito en la solución nutritiva, principalmente 30 %, se da un incremento significativo en la síntesis de proteínas en hojas de fresa (Figura 4). En Brassica nigra, bajo condiciones de deficiencia de fosfato y abastecimiento de fosfito en concentraciones de 1.5 a 10 mM, se observó la inducción de la actividad de las enzimas fosfoenolpiruvato fosfatasa y la fosfofructocinasa dependiente de la pirofosfatasa; mientras que la concentración de proteína y la actividad de las enzimas fosfofructocinasa dependiente de ATP y de la piruvato cinasa no fueron afectadas tanto en plantas deficientes en P como en aquellas suficientes en este elemento. Si bien el fosfito no es un sustrato en reacciones enzimáticas de transferencia de grupos fosforil, otras proteínas de unión a fosfato tales como los transportadores de fosfato, participan en la absorción de fosfatos o como componentes de la traducción de señales relacionados con la detección del estatus de fosfato en planta; aparentemente no discriminan entre fosfatos y fosfitos (McDonald et al., 2001b), o porque las plantas transforman los fosfitos en fosfatos.

El metabolismo de proteínas y aminoácidos puede estar asociado con la adaptación de las plantas a cambios en las condiciones ambientales y a estrés. Los aminoácidos y otros compuestos nitrogenados solubles tienen un papel determinante en el metabolismo vegetal, siendo los productos primarios de la asimilación inorgánica del nitrógeno y precursores de proteínas y ácidos nucleicos (Hsu y Kao, 2003).

CONCLUSIONES

AGRADECIMIENTOS

A la Línea Prioritaria de Investigación 5 Biotecnología Microbiana, Vegetal y Animal del Colegio de Postgraduados, por las facilidades brindadas.

LITERATURA CITADA

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