Alírica I. Suárez^a*, Katiuska Chavez^a, Zuleyma Blanco^a, Reinaldo S. Compagnone^b, Stephen Tillett^a, Fátima Torrico^a

^a Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela

^b Escuela de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.

*Autor de correspondencia:
Dra. Alírica I. Suárez , Tlf: 58-212-6052755, ]]> Fax: 58-212-6052706,
E-mail:alirica.suarez@ciens.ucv.ve

Recibido Julio 2013.
Aceptado Octubre 2013.

RESUMEN

Croton gossypiifolius Vahl es una especie del género Croton (Euphorbiaceae), que se encuentra entre las conocidas como sangre de drago, debido a la savia roja y viscosa que exuda su corteza, ampliamente utilizada en la medicina tradicional de Latinoamérica. Del estudio fitoquímico de los extractos orgánicos obtenidos de la corteza, fueron aislados tres diterpenos de tipo ent-kaurano: ácido ent-kaurenoico (1), ácido grandiflorénico (2), ácido ent-15β-E-cinamoil-kaurenoico (3), un 3,4-seco-ent-kaureno conocido como 7-desoxo-geayina (4), el flavonoide quercitrina (5) y ácidos grasos donde el palmítico resultó ser el mayoritario. Estos compuestos se identificaron por RMN en 1D y 2D y por espectrometría de masas, y son reportados por primera vez en esta especie.

Palabras clave: Euphorbiaceae, Croton gossypiifolius, ent-kauranos, quercitrina, RMN, EM.

Croton gossypiifolius Vahl is a species of the Croton genus (Euphorbiaceae), which is among those known as dragon's blood due to the viscous red sap derived from its bark, widely used in traditional medicine in Latin America. As a result of a phyto-chemical study of the organic extracts obtained from the bark, three diterpenes with ent-kaurene structure were isolated: ent-kaurenoic acid (1), grandiflorenic acid (2), ent-15p-β-cinnamoiloxy-kaurenoic acid (3), one 3,4-seco-ent-kaurene diterpene known as 7-deoxo-geayine (4), the flavonoid quercitrine (5) and a series of fatty acids where palmitic proved to be the major one. These compounds were identified based on spectroscopic analysis of 1D and 2D NMR and mass spectrometry. All of them are reported for the first time in this species.

Key words: Euphorbiaceae, Croton gossypiifolius, ent-kauranes, quercitrine, NMR, MS.

INTRODUCCIÓN

Croton es el género más grande de la subfamilia Crotonoideae (Euphorbiaceae) (Webster et al., 1999). Se reportan unas 1,300 especies dentro del género (Berry et al., 2005). En Venezuela, existen unas 80 especies endémicas (Berry, 1999). Muchas plantas de Croton son utilizadas en América, África y Asia con diferentes propiedades terapéuticas: antiinflamatoria (Perazzo et al., 2007), antinociceptiva (Campos et al., 2002; Nardi et al., 2006), antineoplásica (Motta et al., 2011), hipo-glicemiante (Okokon et al., 2006) y para el tratamiento de problemas gastrointestinales (Hiruma-Lima et al., 2000). Sus aceites esenciales son también de uso común para tratar trastornos de salud (Salatino et al., 2007).

La química y la farmacología de especies venezolanas pertenecientes al género han sido reportadas (Suárez et al., 2003, 2006, 2009), demostrando que muchas de ellas tienen las propiedades que la población les atribuye: la corteza de C. malambo se utiliza para tratar enfermedades tales como: diabetes, diarrea, reumatismo, úlceras gástricas, así como antiinflamatoria y analgésica. Un extracto acuoso de su corteza mostró actividad antinociceptiva en ratas (Suárez et al., 2003). De C. cuneatus, utilizada para problemas gastrointestinales e inflamación, se comprobaron sus propiedades antiinflamatorias (Suárez et al., 2006) y antidiabéticas (Torrico et al, 2007) en animales de experimentación. Igualmente, la respuesta antiinflamatoria de alcaloides glutarimídi-cos extraídos de ella ha sido confirmada en estudios in vitro (Mijares et al., 2012). De la especie C. micans se aislaron 3,4-seco-ent-kauranos, los cuales mostraron una muy buena citotoxicidad sobre nueve tipos diferentes de células tumorales humanas (Suárez et al., 2009, 2010; Mateu et al., 2012) y un extracto acuoso de sus hojas mostró actividad antihistamínica (Suárez et al., 2012).

La savia de color rojo y consistencia viscosa que exudan muchas especies de Croton es conocida como sangre de drago (Dragon's blood), y es utilizada ampliamente en la medicina tradicional de Sudamérica para el tratamiento de heridas, inflamación, infecciones, diarreas y cáncer (Gupta et al., 2008). La savia de la especie C. palanostigma contiene un alcaloide llamado taspina, responsable de las propiedades antiinflamatorias, así como de sanar heridas y de su actividad biológica como agente antitu-moral (Sandoval et al., 2002).

La química del género Croton ha sido bastante explorada; se ha informado del aislamiento de esteroides, alcaloides, flavonoides, cumarinas y una gran variedad de diterpenos con esqueleto de labdano, kaurano, cleistantano, crotofalano y clerodano.

Croton gossypiifolius Vahl se encuentra dentro de esas especies conocidas como sangre de drago, debido al color rojo de su látex. Es utilizada en la medicina tradicional de Venezuela para curar heridas y como antiinflamatoria. De especies de esta planta, colectadas en otras latitudes, se han aislado péptidos cíclicos (Quintyne-Walcott et al., 2007), alcaloides, lignanos y flavonoides (Rodríguez, 1946). Como parte de nuestra investigación en la búsqueda de metabolitos bioactivos de plantas pertenecientes al género Croton, recientemente hemos reportado la composición de los aceites esenciales de C. gossypiifolius colectada en nuestro país (Suárez et al., 2011), y en este artículo presentamos el aislamiento y la caracterización de los metabolitos secundarios mayoritarios presentes en la corteza de esta planta.

MATERIALES Y MÉTODOS

Procedimiento General

Los puntos de fusión fueron determinados utilizando un instrumento Kofler hot-stage y se reportan sin corregir. Los espectros de IR fueron tomados en un espectrómetro Perkin-Elmer 1320. Los espectros de ¹H y ¹³C NMR se tomaron en CDCl₃ en un equipo JEOL 270 MHz y las resonancias están referenciadas con respecto a la señal residual del disolvente utilizado (δ_H 7.24 y 8_C 77.0). Los espectros de masa se tomaron en un equipo Varian modelo Saturno 2000. Los procedimientos de aislamiento por cromatografía de columna se evaluaron empleando cromatografía de capa fina sobre placas de aluminio cubiertas con gel de sílice (Merck, Kieselgel 60 F₂₅₄). En el proceso de revelado se utilizó una lámpara de UV y como reactivo revelador una disolución de p-anisaldehído en MeOH.

Material Botánico

La corteza de C. gossypiifolius fue colectada en La Cortada del Guayabo, estado Miranda, Venezuela, e identificada por el Dr. Stephen Tillett. Un ejemplar de la muestra, representativo de la colección e identificado con el código MYF 26723, ha sido depositado en el Herbario "Dr. Víctor Manuel Ovalles" de la Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela.

Extracción y aislamiento de los compuestos presentes en los extractos orgánicos

El material vegetal, secado a temperatura ambiente, fue sometido a maceración utilizando metanol por 72 h, el disolvente fue evaporado a presión reducida y el material resultante re-disuelto en una mezcla MeOH/H₂O (50:50) y sometido a partición sucesivamente con hexano, diclorometano y acetato de etilo; la mezcla hidro-metanólica fue liofilizada previa evaporación del metanol. El extracto y las diferentes fracciones se evaluaron por cromatografía en capa fina y sus componentes fueron separados por cromatografía preparativa y de columna en fase normal o reversa, utilizando las mejores condiciones de separación obtenidas por CCF. Utilizando estos procedimientos se realizó una cromatografía de columna en fase normal a la fracción de CH₂Cl₂ (500 mg). Se utilizó gel de sílice como soporte y se eluyó con una mezcla AcOEt/Hx de polaridad creciente (2:8 - 7:3). De esta columna se colectaron 50 eluatos, los cuales al ser unidos de acuerdo a criterios de Rf que señalaban similar composición, permitieron obtener diez fracciones. De los compuestos 1, 2 y 3 se obtuvo lo siguiente: 1 (35 mg), 2 (23 mg), y 3 (52 mg). Del extracto de AcOEt se obtuvo los metabolitos 4 (125 mg), y 5 (42 mg). Todos los compuestos luego de su aislamiento fueron posteriormente purificados por cristalización en disolventes apropiados o por cromatografía de columna.

La evaporación de la subfracción 25 de la cromatografía realizada a la fracción de diclorometano, ofreció un residuo aceitoso que fue recromatografiado en columna de gel de sílice, usando como disolvente acetato de etilo, las fracciones que se visualizaron por CCF con un solo compuesto fueron unidas y evaporadas para ofrecer un sólido blanco de punto de fusión 176-178 ^oC, que resultó ser el compuesto 1.

La subfracción 32 (53 mg) de la columna previamente mencionada, se sometió a una nueva cromatografía en columna de gel de sílice, usando una mezcla eluyente cloroformo-hexano (9:1); los eluatos se analizaron por cromatografía en capa fina y se reunieron de acuerdo a criterios de similitud en Rf. De la reunión de las fracciones mayoritarias se obtuvo un sólido blanco que posteriormente se recristalizó en eta-nol, para ofrecer 23 mg del compuesto 2.

El extracto de acetato de etilo fue sometido a cromatografía utilizando gel de sílice y elución con polaridad creciente de acetato de etilo hasta acetato:metanol (9:1); de las primeras 6 subfracciones eluídas con acetato se obtuvo, luego de su evaporación, el compuesto 4, como un aceite viscoso de color amarillo.

En las últimas fracciones eluídas con acetato:metanol, de la cromatografía previamente mencionada, cristalizó espontáneamente un sólido amarillo que fue recristalizado en metanol:agua, ofreciendo 25 mg del compuesto 5.

La caracterización estructural de los compuestos puros fue obtenida utilizando técnicas espectroscópicas como resonancia magnética nuclear, infrarrojo y espectrometría de masas. Los datos obtenidos se compararon con los informados previamente en la literatura. El extracto de hexano fue analizado por cromatografía de gases-masas y mostró principalmente la presencia de ácidos grasos, donde el palmítico mostró ser el mayoritario.

Características físicas y espectroscópicas de los compuestos caracterizados.

Ácido ent-kaurenoico (1): Sólido cristalino; p.f. 176-178 ^oC; EM m/z: 302 (M⁺), 287, 257, 214; IR (KBr) v_máx cm^-1: 3400, 1700, 1685, 1665; RMN ¹H (CDCl₃, 270 MHz), δ: 0.98 (1H, dt, J = 13.2, 4.4 Hz, H-3a), 0.99 (3H, s, H-20), 1.02-1.05 (2H, m, H-5, H-9), 1.07 (1H, dd, J = 11.2, 4.8 Hz, H-14a), 1.23 (3H, s, H-18), 1.48-1.57 (7H, m, H-2, H-7, H-11a, H-12), 1.80-1.84 (4H, m, H-1b, H-6, H-11b), 1.89 (1H, d, J =10.0 Hz, H-14b), 1.99-2.03 (2H, m, H-15), 2.67 (1H,sa, H-13), 4.72 (1H, s, H-17a), 4.78 (1H, s, H-17b); RMN ¹³C (CDCl₃, 67 MHz), δ: 184.4 (C-19), 156.0 (C-16), 103.1 (C-17), 57.1 (C-5), 55.1 (C-9), 49.0 (C-15), 44.3 (C-8), 43.9 (C-13), 43.8 (C-4), 41.3 (C-7), 40.8 (C-1), 39.7 (C-14), 39.3 (C-10), 37.9 (C-3), 33.2 (C-12), 29.0 (C-18), 21.9 (C-6), 19.2 (C-2), 18.5 (C-11), 15.7 (C-20).

Ácido grandiflorénico (2): Sólido blanco; p.f. 156-158 °C; EM m/z: 300 (M⁺), 285, 240; IR (KBr) v_máx cm^-1: 3500 (OH), 1695 (COOH), 1655 (C=C); RMN ¹H (CDCl₃, 270 MHz), δ: 0.98 (3H, s, H-20), 1.05 (1H, m, H-3a), 1.22 (3H, s, H-18), 1.31 (1H, m, H-1a), 1.49 (1H, m, H-7a), 1.55 (1H, m, H-14a), 1.67 (1H, m, H-7b), 1.90 (2H, m, H-2), 2.02 (1H, m, H-5), 2.04 (1H, m, H-1b), 2.15 (1H, m, H-7b), 2.91(1H, m, H--15a), 2.36 (1H, m, H-3, H-3b), 2.38 (2H, m, H-12), 2.43 (2H, m, H-6), 2.58 (1H, m, H-15b), 2.75 (1H, sa, H-13), 4.83 (1H, s, H-17a), 4.89 (1H, s, H-17b), 5.22 (1H, t, J = 3.2, H-11); RMN ¹³C (CDCl₃, 67 MHz), δ: 183.9 (C-19), 158.7 (C-16), 156.0 (C-9), 114.9 (C-11), 105.6 (C-17), 50.4 (C-15), 46.6 (C-5), 45.0 (C-14), 44.8 (C-4), 42.3 (C-8), 41.3 (C-13), 40.8 (C-1), 38.9 (C-10), 38.3 (C-3), 38.0 (C-12), 29.7 (C-7), 28.3 (C-18), 23.7 (C-20), 20.2 (C-2), 18.5 (C-6).

Ácido ent-15β-.E-cinamoil-16-kauren-19-oico (3): Sólido amorfo; p.f. 103-104 ^oC; EM m/z: 420 (M⁺); IR (KBr) v_máx cm^-1: 3500 (OH), 1730 (COOR), 1635 (C=C); RMN ¹H (CDCl₃, 270 MHz), δ: 0.82 (1H, m, H-1a), 0.95 (3H, s, H-20), 1.06 (1H, sa, H-5), 1.20 (3H, s, H-18), 1.24 (1H, s, H-9), 1.28 (1H, sa, H-7a), 1.52 (1H, d, J = 5.8 Hz, H-11a), 1.53 (1H, m, H-12a), 1.61 (1H, m, H-2a), 1.70 (1H, m, H-12b), 1.77 (1H, m, H-7b), 1.82 (1H, m, H-2b), 1.86 (1H, m, H-1b), 1.88 (2H, sa, H-6), 1.89 (1H, m, H-11b), 2.02 (1H, d, J=12.6 Hz, H-3a), 2.12 (2H, m, H-14), 2.15 (1H, d, J = 12.6 Hz, H-3b), 2.86 (1H, sa, H-13), 5.09 (1H, s, H-17a), 5.11 (1H, s, 17b), 5.39 (1H, s, H-15), 6.48 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-2'), 7.37 (3H, m, H-6', H-7', H-8'), 7.52 (2H, m, H-5', H-9'), 7.64 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-3'); RMN ¹³C (CDCl₃, 67 MHz), δ: 184.4 (C-19), 167.1 (C-1'), 155.5 (C-16), 144.9 (C-3'), 134.5 (C-4'), 130.4 (C-7'), 128.9 (C-5', C-9'), 128.2 (C-6', C-8'), 118.5 (C-2'), 110.3 (C-17), 83.1 (C-15), 56.7 (C-5), 52.9 (C-9), 47.8 (C-8), 43.7 (C-4), 42.6 (C-13), 40.6 (C-1), 39.9 (C-10), 37.7 (c-3), 37.4 (C-14), 34.9 (C-7), 32.7 (C-12), 28.9 (C-18), 20.8 (C-6), 19.1 (C-11), 18.5 (C-2), 15.1 (C-20).

7-Desoxo-geayina (4): Aceite amarillo; [α]_D -32.5 (CHCl₃, c = 2.0); EM m/z: 302, 287, 229, 159; IR (KBr) v_máx cm^-1: 3500 cm^-1 (OH), 1695 (COOR); ¹H (CDCl3, 270 MHz), δ: 0.97 (3H, s, H-20), 1.22 (1H, m, H-2a), 1.27 (1H, m, H-9), 1.46 (1H, m, H-6a), 1.48 (2H, m, H-15), 1.52 (2H, m, H-11), 1.56 (2H, m, H-12), 1.62 (1H, m, H-14a), 1.67 (1H, m, H-1a), 1.62 (1H, m, H-6b), 1.72 (3H, s, H-18), 1.93 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-14b), 1.95 (1H, m, H-5), 2.03 (2H, m, H-7), 2.22 (1H, m, H-1b), 2.26 (1H, m, H-2b), 2.63 (1H, m, H-13), 4.56 (1H, s, H-17a), 4.72 (1H, s, H-17b), 4.77 (1H, s, H-19a), 4.84 (1H, s, H-19b). ¹³C NMR (CDCl₃, 67 MHz) δ: 179.9 (C-3), 155.5 (C-16), 147.5 (C-4), 113.7 (C-19), 103.3 (C-17), 50.5 (C-5), 49.1 (C-7), 46.2 (C-9), 43.9 (C-8), 43.8 (C-13), 40.9 (C-10), 39.6 (C-15), 39.5 (C-14), 33.7 (C-1), 32.9 (C-12), 28.5 (C-2), 26.3 (C-6), 23.4 (C-18), 21.8 (C-20), 18.3 (C-11).

Quercitrina (5). Sólido amarillo; p.f 178-181^oC; EM m/z: 448; IR (KBr) v_máx cm^-1: 3500 (OH), 1710 (C=O), 1615 (C-H aromático); ¹H NMR (CDCl₃, 270 MHz) δ: 0.94 (3H, d, J = 6.1 Hz, CH₃ -Ram), 3.30-3.34 (2H, m, H-4'', H-5''), 3.74 (1H, dd, J = 9.0, 3.35 Hz, H-3''), 4.21 (1H, m, H-2''), 5.33 (1H, m, H-1'') 6.19 (1H, d, J = 22.1 Hz, H-6), 6.35 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 6.91(1H, d, J = 8.3 Hz, H-5'), 7.29 (1H, dd, J = 2.2, 8.3 Hz, H-6'), 7.30 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-2');¹³C NMR (CDCl₃, 67 MHz) δ: 179.6 (C-4), 165.8 (C-7), 163.2 (C-5), 159.3 (C-9), 158.5 (C-2), 149.8 (C-4'), 146.4 (C-3'), 136.2 (C-3), 122.9 (C-6', C-1'), 116.9 (C-2'), 116.3 (C-5'), 105.8 (C-10), 103.5 (C-1''), 99.7 (C-6), 94.7 (C-8), 73.2 (C-2''), 72.1 (C-3''), 72.0 (C-4''), 71.9 (C-5''), 17.7 (C-6'').

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Luego de sucesivas cromatografías realizadas a las fracciones obtenidas del extracto de CH₂Cl_2, se obtuvo el ácido kaurenoico (1 ), ácido grandiflorénico (2), ácido ent-15β-E-cinamoil-16-kauren-19-oico (3), 7-desoxo-geayina (4) y el flavonoide quercitrina (5).

El compuesto 1 fue obtenido como agujas blancas, de p.f. 176-178 ^oC, las cuales se cristalizaron en una mezcla EtOH/H₂O. Su espectro de IR mostró una intensa banda de absorción a 1700 cm^-1 identificando a un grupo carbonilo, y una banda ancha a 3400 cm^-1 de -OH, ambas asociadas a grupo -COOH. Una banda a 1665 cm^-1 perteneciente a la absorción de una olefina terminal se consideró entre las más importantes. El espectro de masas obtenido por impacto electrónico (EI) dio una relación m/z 302 (ión molecular), con este dato se consideró una fórmula molecular de C₂₀H₃₀O₂, la cual sugiere seis insaturaciones en la estructura. Otros picos importantes observados en el espectro de masas fueron los siguientes: m/z: 287 [M+ - CH₃], 257 [M+ - COOH], 214 [M+ - C₄H₈O₂]. El análisis de RMN de ¹H en CDCl₃ claramente mostró señales para dos metilos a 8 0.99 (3H, s, H-20) y 1.23 (3H, s, H-18), dos protones olefínicos a δ 4.72 (1H, s, H-17a), y δ 4.78 (1H, s, H-17b), además de una serie de multipletes entre δ 0.93 y 2.03; se observó igualmente un singulete ancho que integraba para un protón a δ 2.67 (H-13); todas estas señales sugirieron una estructura terpenoide. El espectro de RMN de ¹³C y un experimento DEPT 135 conjuntamente con un HMQC, revelaron que la estructura contenía 20 átomos de carbono discriminados como: dos metilos a δ 29.0 (C-18) y 15.7 (C-20), 10 metilenos, incluyendo uno de naturaleza olefínica a δ 103.1 (C-17), tres metinos y cinco carbonos cuaternarios, de los cuales uno corresponde a una olefina de tipo terminal a δ 156.0 (C-16) y otro a un grupo carboxilo δ 184.4 (C-19), corroborando con ello la presencia de un diterpeno. La similitud con compuestos previamente aislados en nuestro grupo de trabajo nos sugirió una estructura de tipo ent-kaurano. Con la ayuda de los espectros de HMQC y HMBC todas las señales fueron asignadas y con la comparación con datos de la literatura (Guillopé et al., 2011) se corroboró que el compuesto 1 era el ent-kaur-16-en-19-oico ( 1 ), conocido como ácido kaurenoico.

El compuesto 2 fue aislado de la fracción de diclorometano que tenía una apariencia de "miel", la cual se purificó a través de cromatografía en columna utilizando gel de sílice y una mezcla de CHCl₃/n-hexano, 9:1, obteniéndose como un sólido blanco de p.f. 156-158 °C; el revelado con p-anisaldehído mostró una mancha de color azul. La muestra fue sometida a un análisis de CG/EM, el cual presentó un M⁺ de 300 m/z; otros picos importantes en el espectro de masas se observaron a m/z: 285 (M+ - CH₃), 240 (M+ - CH₃ - COOH). El espectro de RMN de ¹³C exhibió un total de 20 señales, las cuales fueron discriminadas con ayuda de un experimento DEPT 135 en: dos carbonos metílicos a δ 28.3 (C-18) y 23.7 (C-20), nueve metilenos entre los cuales uno correspondía a una olefina a δ 105.6 (C-17), dos metinos a δ 41.3 (C-13), 46.6 (C-5) y seis carbonos cuaternarios, entre los cuales destacaban los dos pertenecientes a las dos olefinas presentes en el compuesto a δ 156.0 (C-9) y 158.7 (C-16) y el que señalaba al ácido carboxílico a δ 183.9 (C-19). Estos datos junto con los de espectrometría de masas permitieron establecer una fórmula molecular de C₂₀H₂₈O_2, que corresponde a un número total de siete insaturaciones en la molécula. El espectro de RMN ¹H corroboró la presencia de dos grupos metilos singuletes a δ 0.98 (3H, s, H-20) y 1.22 (3H, s, H-18). A través de un experimento HMQC se establecieron las correlaciones entre los carbonos y los protones directamente unidos a ellos; el experimento en dos dimensiones HMBC permitió establecer las correlaciones a tres enlaces (Fig. 2). La comparación de los datos obtenidos para nuestra estructura con datos reportados en la literatura (Batista et al., 2005), indicaron que el compuesto 2 era el ent-kaureno conocido como ácido grandiflorénico (2), producto natural que se reporta por primera vez de la especie C. gossypiifolius.

El compuesto 3 se obtuvo como un sólido blanco amorfo, de p.f. 103-104 ^oC. La fórmula molecular C₂₉H₃₆O₄ se estableció tomando en consideración su espectro de masas, el cual presentó un ion molecular de m/z 420 (M⁺). El espectro de RMN ¹H se presentaba muy similar al observado en los dos compuestos anteriores, por lo que se consideró nuevamente la presencia de un diterpeno de estructura kaurenoide. Fue importante reconocer en la estructura la presencia de un éster E-cinámico, el cual se distingue por un sistema de tipo AB presentando dos dobletes con una J = 15.8 Hz a desplazamientos de δ 6.48 (H-2') y 7.64 (H-3'). De igual forma, se evidenció la presencia del metileno exocíclico con dos singuletes a δ 5.09 (H-17a) y 5.11 (H-17b) y el ácido carboxilico que se había identificado igualmente en 1 y 2. El análisis detallado de los espectros de ¹³C y DEPT 135 conjuntamente con los experimentos HMQC y HMBC, permitieron ubicar el grupo cinamato en la posición C-15 de la estructura del ácido kaurenoico. La comparación con datos de la literatura corroboró la presencia del ácido ent-15β-E-cinnamoil-16-kauren-19-oico (3), de especial importancia fue la comparación del desplazamiento químico de H-15 a δ 5.39 para determinar la estereoquímica de C-9 y de C-15 (dos Nacimento et al., 2001). Este ent-kaurano (3) se reporta por primera vez como metabolito secundario presente en C. gossypiifolius.

El compuesto identificado como 4 se observó con las características físicas de un semi-sólido de color miel, presentando una rotación óptica de [α]_D -32.5 (CHCl₃, c = 2.0). Su espectro de masas mostró un ión molecular de M⁺ 302 m/z; otros picos importantes observados en el espectro de masas se observaron a m/z: 287, 229 y 159. El dato referente al ion molecular en conjunto con el análisis del espectro de RMN de ¹³C, permitió establecer una fórmula molecular de C₂₀H₃₀O₂, sugiriendo nuevamente la existencia de una estructura diterpénica en la cual están presentes seis insaturaciones. El espectro de RMN de ¹³C, analizado conjuntamente con un experimento DEPT 135, señaló la presencia de dos grupos metilos singuletes δ 23.4 (C-18) y 21.8 (C-20), 10 metilenos, dos de los cuales correspondían a metilenos olefínicos a δ 113.7 (C-19) y 155.5 (C-16), tres grupos metinos a δ 50.5 (C-5), 46.2 (C-9) y 43.8 (C-13). Cinco carbonos cuaternarios de los cuales uno es de naturaleza acílica a δ 179.9 (C-3) fueron también identificados en la estructura. El espectro de RMN de ¹H conirmó los dos grupos metilos ya descritos y la presencia de dos oleinas terminales. Todas las señales fueron asignadas con la ayuda de los experimentos HMQC, HMBC y COSY y, todo ello, condujo a establecer que la estructura correspondía a un diterpeno tricíclico. La similitud de su espectro con el ácido de caracasina, un 3,4-seco-ent-kaurano aislado por nuestro grupo de la especie C. micans (Suárez et al., 2009), mostró, como la diferencia más importante entre ellos, la ausencia en este compuesto 4 de la cetona α,β-insaturada presente en el ácido de caracasina. Un compuesto de nombre 7-desoxo-geayina, con la estructura propuesta en el análisis espectroscópico, fue reportada por primera vez aislada de C. geayi (Palazzino et al., 1997), y en esta oportunidad se reporta de la especie C. gossypiifolius.

El compuesto 5 resultó ser un sólido amarillo amorfo, de p.f 178-181 ^oC. El espectro de masas ofreció un ión molecular M⁺ 448 m/z. Los espectros de RMN de ¹H y ¹³C mostraron señales típicas de estructuras flavonoides con glucósidos, un protón anomérico a δ 5.33 (H-1"), señaló la posible presencia de una ramnosa, conirmada por el grupo metilo que fue observado a δ 0.94 (C-6"). El grupo de señales a campo bajo permitió identificar la presencia de dos sistemas de acoplamiento; un anillo B trisustituido señalado por el sistema ABX a δ 6.91 (d, J = 8.3 Hz, H-5'), 7.29 (dd, J = 2.2, 8.3 Hz, H-6'), 7.30 (d, J = 2.2 Hz, H-2'); dos señales que integraban cada una para un protón acopladas entre sí con J = 2.1 Hz resonaron a δ 6.19 (H-6) y 6.35 (H-8), el resto de las resonancias en el espectro de RMN ¹H muestran la parte glicosídica de la molécula, identificándose claramente a δ 3.42 (H-1") y 3.76 (H-5"). La completa asignación de las señales de RMN se realizó a través de la interpretación de los espectros de HMQC y HMBC y luego de la comparación con datos de la literatura se concluyó que el compuesto 5 corresponde a 3-0-ramnopiranosil-5,7,3',4'-tetrahidroxiflavona, conocida con el nombre común de quercitrina, aislada de muchas especiales vegetales y particularmente dentro del género de algunas especies como C. campestris (dos Santos et al., 2005).

La Figura 1 muestra las estructuras de los compuestos caracterizados.

CONCLUSIONES

La evaluación fitoquímica de la corteza de C. gossypifolius colectada en Venezuela mostró que la especie contiene compuestos comunes a otras especies del género, especialmente diterpenos de tipo ent-kaurano, algunos de los cuales han demostrado importante actividad biológica. Se hace necesario evaluar por separado cada uno de los compuestos en las acciones biológicas señaladas para esta especie con el objeto de identificar aquellos responsables de esas actividades farmacológicas.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo financiero brindado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CDCH) de la Universidad Central de Venezuela PG-06-7342-2008.

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