Caracterización de los tipos capsulares de Pasteurella multocida en exudado faríngeo de bovinos productores de carne clínicamente sanos en el estado de Querétaro

Characterization of capsular types of Pasteurella multocida isolated from clinically healthy beef cattle pharyngeal exudate in the state of Querétaro

Ana Lilia Villegas Vázquez‡, Víctor Manuel Campuzano-Ocampo*, Rigoberto Hernández-Castro**, Francisco Suárez-Güemes***, Francisco José Trigo Tavera†, Carlos Julio Jaramillo-Arango‡

* Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F.

*** Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D.F.

† Departamento de Patología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D.F.

‡ Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Animal en Altiplano CEIEPAA, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México. Km. 8.5 Carretera Tequisquiapan, Ezequiel Montes, Tequisquiapan, Querétaro.

Autor de correspondencia:
Carlos Julio Jaramillo Arango,
Tel. 014142918100
Correo electrónico: jaramillo50@yahoo.com.mx

Recibido el19de junio de 2013
Aceptado el 4 de septiembre de 2013.

Resumen

El objetivo del presente estudio fue identificar y caracterizar los tipos capsulares de P. multocida en exudado faríngeo en bovinos destinados a la producción de carne en el estado de Querétaro. Se obtuvieron, mediante hisopo, 227 muestras de exudado faríngeo de animales clínicamente sanos en una planta de sacrificio ubicada en el municipio de Ezequiel Montes, Querétaro. Las muestras se sembraron en agar sangre y se incubaron a 37°C por 24 h en aerobiosis. Las cepas aisladas fueron identificadas mediante características morfológicas, pruebas bioquímicas convencionales y el microsistema comercial API 20NE. La tipificación de los grupos capsulares A y D se realizó por medio de una PCR múltiple para la amplificación de los genes hyaD-hyaC y dcbF, respectivamente. De acuerdo con los valores establecidos por el software API WEB, se logró la identificación de 14.09% (32/227) de cepas de P. multocida, que mostraron 96% de identidad y una tipicidad de 1 a P. multocida. Por medio de la PCR múltiple se logró la amplificación de los genes hyaD-hyaC correspondientes al grupo capsular A en el 100% (32/32) de las cepas identificadas previamente como P. multocida. No existen datos similares en México sobre la identificación y caracterización de P. multocida en bovinos destinados a la producción de carne. Con los resultados obtenidos se corrobora que, de manera similar a otros países de Europa y América, en México el grupo capsular predominante de P. multocida es el A.

Palabras clave: Pasteurella multocida, tipos capsulares, caracterización bioquímica, caracterización molecular, exudado faríngeo, bovinos, PCR.

Abstract

The objective of the present study was to identify and characterize capsular types of P. multocida isolated from beef cattle pharyngeal exudate in the state of Querétaro. Two hundred and twenty seven pharyngeal exudate swab samples from clinically healthy animals in a slaughterhouse in the municipality of Ezequiel Montes, Querétaro were obtained. Samples were seeded in blood agar and incubated at 37°C for 24 h under aerobiosis. Strains were identified through morphological characteristics, conventional biochemical tests and commercial API 20NE Micro-System. Capsular typing of groups A and D was performed by a multiplex PCR for amplification of genes hyaD-hyaC and dcbF, respectively. According to the values established by API WEB software, it was possible to identify 14.09% (32/227) of P. multocida strains, which showed an identification percentage of 96% and a typicality of 1 to P. multocida. By multiplex PCR, the amplification of genes hyaD-hyaC, correspondent to capsular group A in 100% (32/32) of the strains previously identified as P. multocida, was achieved. There are no similar data in Mexico on the identification and characterization of P. multocida in beef cattle. With the results obtained it is confirmed that, in a similar way with other countries of Europe and America, capsular type A of P. multocida is predominant in Mexico.

Introducción

El complejo respiratorio bovino (CRB) está conformado por tres entidades clínicas: neumonía enzoótica de los terneros, neumonía intersticial y la pasteurelosis neumónica bovina; ésta última se describe como una enfermedad de curso agudo que afecta a los bovinos jóvenes y adultos, en la cual se involucran microorganismos de la familia Pasteurellaceae, como Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica e Histophilus somni y otros agentes como el virus de la rinotraqueitis infecciosa bovina (RIB), entre otros.^1,2

Los principales patógenos presentes en el CRB son parte de la microbiota normal de las vías respiratorias de los bovinos de engorda. P. multocida es uno de los principales microorganismos aislados dentro del CRB, al igual que M. haemolytica. Estos microorganismos colonizan normalmente la nasofaringe de diversos animales domésticos y silvestres, cuando existen condiciones de tensión (estrés) o bien en infecciones virales.^3,4

P. multocida se subdivide en cuatro subespecies, que incluye a Pasteurella multocida subs multocida, gallicida, septica y tigris. P. multocida se puede clasificar en cinco grupos capsulares: A, B, D, E y F, basándose en los diferentes polisacáridos de la cápsula. ^5-7

La distribución geográfica de estos grupos es variable, los grupos B y E producen la septicemia hemorrágica, que afecta a los búfalos de agua y al ganado bovino en Asia, África y sur de Europa. Se ha demostrado que los grupos capsulares A y D afectan al ganado bovino en México. La determinación de la prevalencia contribuye a la elaboración de productos biológicos para la prevención y control de la pasteurelosis neumónica. ^6,7

El diagnóstico de las enfermedades producidas por P. multocida se basa en los signos clínicos y características fisicoquímicas del agente. Estas pruebas se realizan con base en cualidades fenotípicas; sin embargo, las condiciones del cultivo pueden influir en la expresión de algunas características, como la morfología, fermentación de carbohidratos y propiedades serológicas, y con ello disminuir la sensibilidad y especificidad de los métodos basados en estas características.⁸

En años recientes, las técnicas de biología molecular han significado grandes beneficios para la identificación bacteriana, superando algunas limitaciones de los procedimientos convencionales. Los ensayos basados en la detección de los ácidos nucleicos permiten la detección de organismos directamente de las muestras clínicas, así se mejora la sensibilidad, la especificidad y el tiempo requerido para la identificación del microorganismo. Particularmente la PCR ha sido muy útil, pues con el uso de iniciadores específicos resulta fácil la identificación del género y los grupos capsulares.^8,9

No obstante que en México se cuenta con estudios previos sobre la caracterización y prevalencia de los tipos capsulares de P. multocida en bovinos destinados a la producción de leche, aún no se han realizado estudios en bovinos destinados a la producción de carne; por tal motivo, los objetivos de este estudio fueron: identificar los diferentes tipos capsulares y estimar la frecuencia de Pasteurella multocida en exudado faríngeo de bovinos clínicamente sanos destinados a la producción de carne.

Material y métodos

Diseño del muestreo

Se consideró una prevalencia de 18% con base en estudios previos¹⁰ y se calculó el tamaño mínimo de muestra (TMM) con 95% de confianza y un error estimado de 5%.

Se aplicó la siguiente ecuación: n= z² x p x q/ d², en la que z= nivel de confianza al 95%= 1.96; p= probabilidad de que ocurra el evento o prevalencia; q= 1-p, probabilidad de que no ocurra el evento; d= error estimado. Con base en dicha ecuación, el TMM fue de 227 bovinos, para determinar la proporción de animales positivos a P. multocida.

Obtención y tipo de muestras de estudio

La obtención de las muestras se llevó a cabo en la planta de sacrificio tipo inspección federal (TIF) de la Distribuidora de Carne del Bajío (DICABSA), ubicada en el municipio de Ezequiel Montes, Querétaro, en bovinos provenientes del mismo municipio; dichos animales fueron muestreados después del sacrificio y antes del lavado de las cabezas. Se recolectaron muestras de exudado faríngeo mediante hisopos estériles que se colocaron en medio de transporte Stuart y se conservaron en refrigeración hasta su procesamiento, el cual se llevó a cabo en el Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública Veterinaria y en el Centro de Enseñanza Investigación y Extensión en Producción Animal en Altiplano, FMVZ- UNAM.

Aislamiento e identificación de P. multocida

El aislamiento e identificación de las colonias se realizó por siembra en cajas de agar sangre a partir del hisopo, se incubaron en aerobiosis durante 24 h a 37°C. Posteriormente se realizó la tinción de Gram. Se observaron las características morfológicas de las colonias y se seleccionaron aquéllas que coincidieron con las de P. multocida: redondas, grises, mucoides y sin presencia de hemólisis. Posteriormente se llevaron a cabo las pruebas de identificación de catalasa y oxidasa. Se realizó una nueva siembra con el fin de obtener cultivo puro de las cepas de P. multocida, y posteriormente se llevó a cabo la identificación bioquímica mediante un microsistema comercial.

Identificación bioquímica de P. multocida

Caracterización molecular de los grupos capsulares de P. multocida

Extracción de ADN

Las cepas identificadas como P. multocida mediante el sistema API 20NE se resembraron en agar sangre al 5% y se incubaron a 37°C durante 24 h. La extracción de ADN se llevó a cabo mediante el método de choque térmico.¹¹ Se suspendió una asada de la muestra bacteriana en 200 μl de agua destilada estéril, la cual se sometió a una temperatura de 92°C (ebullición) durante 15 minutos. Se centrifugó a 8000 g durante 15 minutos y se tomaron 5 μl del sobrenadante (ADN) para agregarlos a la mezcla de la PCR.

PCR

Para la caracterización de los tipos capsulares, los genes amplificados para el A fueron: hyaD-hyaC, que codifican para la síntesis de ácido hialurónico por medio de los iniciadores 5'-TGCCAAAATCGCAGTCAG-3' y 5'- TTGCCATCATTGTCAGTG- 3', y para el grupo capsular D, el gen amplificado fue dcbF, que codifica para la síntesis de una glicosil transferasa del operón capsular, para lo cual se emplearon los iniciadores 5'-TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC-3' y 5'- CATCTACCCACTCAATATCAG-3'. La caracterización molecular se realizó por medio de una PCR múltiple tomando como base el protocolo descrito por Campuzano et al.⁸ La amplificación se realizó en un termociclador** bajo las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial a 95°C por 5 minutos, seguida de una desnaturalización a 95°C por 30 segundos, elongación a 56.5°C por 30 segundos y extensión a 72°C durante 30 segundos por 30 ciclos. La extensión final a 72°C por 5 minutos. Las reacciones se mantuvieron a 4°C hasta su visualización. Se colocaron 32.5 μl de agua destilada estéril, 5 μl de amortiguador 1x PCR, 3 μl de MgCl₂, 2 μl de DNTP‘S, 0.5 μl de cada uno de los iniciadores, 5 μl de ADN y 0.5 μl de Taq ADN polimerasa. La visualización de los productos amplificados se efectuó en geles de agarosa al 1%, teñidos con bromuro de etidio al 10% (10 mg/ml).

Resultados

Identificación morfológica de las cepas de P. multocida

De un total de 227 muestras procesadas, se recuperaron 77 aislados (33.92%) que correspondieron a la morfología de P. multocida (redondas, grisáceas, mucoides y sin presencia de hemólisis). Posteriormente se realizó la tinción de Gram, en donde 54 colonias (23.78%) correspondieron a cocobacilos Gramnegativos. Finalmente se utilizaron las pruebas de oxidasa y catalasa, con las que resultaron 50 aislamientos (22.02%) positivos.

Los 50 aislados que resultaron positivos a los ensayos de catalasa y oxidasa fueron sometidos al microsistema API 20NE para obtener la identificación bioquímica definitiva, con los siguientes resultados: 64% (32/50) mostró 96% de identificación y tipicidad de 1 a P. multocida, y 24% (12/50) correspondió a Pasteurella spp, con una identificación y tipicidad menores a 96% y 1, respectivamente.

Tipificación molecular

Mediante la prueba de PCR se amplificaron los genes hyaD-hyaC para el grupo capsular A, y el gen dcbF para el grupo D, cuyos productos de amplificación tuvieron un peso molecular esperado de 1044 pb para el grupo A y de 657pb para el grupo D (Figura 1). Por medio de la PCR múltiple se logró la amplificación de un producto de ~1044 pb en 100% de las cepas (n = 32), que corresponde al grupo capsular A de P. multocida (Figura 2).

Frecuencia de P. multocida en bovinos clínicamente sanos destinados a la producción de carne.

Con base en los resultados obtenidos en la identificación bioquímica y molecular, la frecuencia estimada de P. multocida fue de 14.09% (32/227), de la cual el 100% (32/32) fue grupo A.

Discusión

El CRB ha sido reconocido como una enfermedad de gran importancia económica en el ganado. Su confirmación es difícil debido a la variedad en los signos clínicos y a que los procedimientos para su diagnóstico pueden tomar mucho tiempo. Los agentes bacterianos son los patógenos más comúnmente involucrados, actualmente no existe una prueba eficaz y sencilla para determinar la etiología de la enfermedad.^{1, 11,12}

Las principales bacterias encontradas en los problemas respiratorios en el ganado bovino son: M. haemolytica, H. somni y P. multocida, ésta última se cita como la más comúnmente aislada en las neumonías de becerras de razas especializadas en la producción de leche,^13,14 lo cual refleja, en alguna medida, la naturaleza oportunista de este microorganismo al superar el desarrollo de otras bacterias.^15,16

Se han identificado los grupos capsulares A y D de P. multocida como los responsables de la pasteurelosis neumónica en México. En estudios llevados a cabo en el país con muestras pulmonares provenientes de rastros, se han logrado aislamientos de Pasteurella spp en alrededor de 50% de los casos, en los que P. multocida ha sido el principal agente patógeno identificado.^17-19

El diagnóstico de P. multocida se ha basado en la presencia de signos clínicos y la presentación de características fisicoquímicas del agente. Las pruebas se realizan con base en características fenotípicas; sin embargo, las condiciones de cultivo pueden influir en la expresión de las propiedades de la bacteria y con ello disminuir la especificidad y sensibilidad de los métodos basados en estas características.

Para la identificación bioquímica de P. multocida se dispone de métodos que se basan en microsistemas comerciales o miniaturizados, los cuales facilitan y agilizan la tipificación. Entre ellos se encuentra el sistema API 20NE, el cual se ha empleado como herramienta en la identificación de enterobacterias y no enterobacterias en medicina veterinaria, con resultados muy satisfactorios en cepas de P. multocida y M. haemolytica.¹⁹ El sistema API es capaz de identificar con precisión P. multocida en menos tiempo (64% menos), en comparación con otros sistemas como Oxi/Ferm. El porcentaje de errores de identificación es de sólo 10% en los aislamientos de P. multocida.^20-21

En los resultados obtenidos mediante el uso de este sistema se observó un alto porcentaje de identificación y tipicidad completa a P. multocida en 100% de los aislamientos. Al utilizar el sistema API 20NE se logró identificar 32 cepas (14.09%) como P. multocida, las cuales mostraron 96% de identificación y tipicidad de 1 a P. multocida; se observaron 12 cepas (5.28%) con porcentajes de identificación y tipicidad menores a 96% y 1, respectivamente. Los resultados obtenidos del perfil bioquímico de las cepas estudiadas en este trabajo, en cuanto al porcentaje de identificación y tipicidad con respecto a P. multocida, concuerdan con los obtenidos por Campuzano et al.,⁸ quienes en 97.5% de las cepas analizadas encontraron 96% de identificación y tipicidad de 1 a P. multocida, por lo cual se considera al sistema de identificación API 20NE como un método fácil de aplicar y de alta confiabilidad para el reconocimiento de este microorganismo.

Se ha observado que la detección de P. multocida se realiza en una menor cantidad de tiempo utilizando la técnica de PCR. Con la identificación de los genes implicados en la biosíntesis del polisacárido capsular, las secuencias específicas de los grupos capsulares identificadas se utilizan como iniciadores para la tipificación capsular de P. multocida²² La PCR puede realizarse a partir de una colonia bacteriana o mediante la extracción de ADN por ebullición, lo que reduce el tiempo para la tipificación, sin necesidad de la extracción del ADN bacteriano por métodos más costosos o con mayor inversión de tiempo, como en el caso de la lisis alcalina. La PCR dirigida a los genes hyaD -hyaC proporciona una detección específica de las cepas de P. multocida.^11,12

Las ventajas de la PCR, en comparación con otras pruebas existentes, incluyen una mayor velocidad, sensibilidad, especificidad y simplicidad. No requiere medios de cultivo especiales ni la inoculación de animales de laboratorio y, por lo tanto, es más segura, ya que evita el manejo de bacterias vivas.¹¹

En otros informes basados en la caracterización fenotípica de las cepas de P. multocida de origen bovino y otros rumiantes, el grupo capsular predominante es el A. Investigaciones realizadas en bovinos con muestras de pulmones neumónicos de becerras Holstein en el Estado de México,²⁴ y en pulmones neumónicos en el Estado de México y en Durango, informaron la presencia del grupo A en un intervalo de 98.7 a 100% de las muestras estudiadas y 1.2 % para el grupo D.^19,24 Blanco et al.¹¹⁸ indicaron la presencia del grupo A en el 100% de los aislamientos de P. multocida en pulmones con lesiones neumónicas provenientes de becerras en el Estado de México.

En el presente estudio, la totalidad de los aislamientos de P. multocida corresponden al grupo capsular A, dichos resultados demuestran que este grupo predomina en los bovinos clínicamente sanos destinados a la producción cárnica y se asemejan a los resultados obtenidos en el trabajo de Campuzano et al.,⁸ en el que se utilizaron muestras de exudado nasal de bovinos lecheros clínicamente sanos procedentes de la Comarca Lagunera de los estados de Coahuila y Durango, y en el estado de Hidalgo, con lo cual se corrobora que, de manera similar a otros países de Europa y América, en México el grupo capsular predominante de P. multocida es el A.

La identificación y caracterización de los grupos capsulares de P. multocida es importante en la prevención y tratamiento de la pasteurelosis neumónica en bovinos destinados a la producción de carne, así como para conocer la situación epidemiológica de este microorganismo en el municipio de Ezequiel Montes, en el estado de Querétaro. De igual forma, puede contribuir al desarrollo de inmunógenos más eficaces y como apoyo en los programas de prevención y control de dicha enfermedad.

Es menester resaltar que no existen datos publicados en México sobre la identificación y caracterización de P. multocida en bovinos destinados a la producción de carne.

Agradecimientos

Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt) por el apoyo recibido para el proyecto CB104031; al Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública y al Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Animal en Altiplano (CEIEPAA) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAM, por las facilidades otorgadas para la realización de este trabajo.

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Este trabajo es parte de la tesis de licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnia del primer autor.

* BioMérieux sa F-69280 Marcy l'Etoile, Francia.

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