Transmisión de Brucella abortus en becerras menores de tres meses diagnosticadas por medio de las pruebas de tarjeta e inmunodifusión radial en dos hatos lecheros del estado de Querétaro
Transmission of Brucella abortus to female calves younger than three months of age, diagnosed by the card and radial immunodiffusion tests in two dairy herds in the state of Queretaro, Mexico
Iván Carrisoza-Urbina* Mario Medina-Cruz** Erika Gabriela Palomares-Reséndiz*** Efrén Díaz-Aparicio ***
]]> * Estudiante de Maestría en Medicina Veterinaria y Zootecnia, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D.F.
** Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Animal en Altiplano, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, Km. 8.5 Carretera Federal Tequisquiapan-Ezequiel Montes, Tequisquiapan, Querétaro, México.
*** CENID Microbiología, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Km 15.5 Carretera Federal México-Toluca, 05110, Cuajimalpa, DF, México.
Autor para correspondencia:
Efrén Díaz Aparicio
email: efredia@yahoo.com,
teléfono 5536180800, ext.45.
Recibido el 19 de junio de 2013 ]]> Aceptado el 27 de noviembre de 2013.
Resumen
La transmisión de Brucella abortus a becerras de vacas positivas y negativas se determinó a la primera semana de vida y al tercer mes de edad. Se trabajó con dos hatos: el hato 1, con 670 vacas en producción, presentaba una seroprevalencia a brucelosis de 21.6% (145/670). En este hato se formaron dos grupos: vacas positivas y vacas negativas, como resultado de las pruebas de tarjeta y de inmunodifusión radial (IDR) realizadas con hapteno nativo. Se tomaron pruebas de sangre de las vacas en dos ocasiones, a la semana de edad y antes de que los animales fueran vacunados contra B. abortus. De las 22 vacas del grupo positivo, 2 (9.1%) becerras resultaron positivas a la primera semana de vida, pero no se encontraron vacas positivas a los tres meses de edad. En el grupo de becerras nacidas de vacas negativas no se encontraron animales positivos a la semana de vida, pero a los tres meses de edad, 4 de las 22 becerras resultaron positivas con la prueba de IDR. La tasa de prevalencia de vacas positivas a B. abortus fue de 13.6% a los tres meses de edad. De las 20 muestras de leche obtenidas de este hato se aisló B. abortus (100%). Mediante PCR se confirmó que estas cepas correspondían a cepas de campo y no a cepas vacunales. El hato 2, con 1800 vacas en producción, estaba inscrito en la campaña nacional contra la brucelosis animal y presentaba una seroprevalencia de 1.94% (35/1800) detectada de enero a diciembre de 2009. Se analizaron 1 170 registros usando los resultados de las pruebas de tarjeta y rivanol aplicada en becerras menores de tres meses de edad, de las que 24 (2.1%) resultaron positivas a B. abortus de enero de 2009 a junio de 2010. Se concluye que es necesario realizar el diagnóstico de brucelosis en becerras nacidas en establos donde se ha presentado la enfermedad, para prevenir que permanezcan animales positivos en el hato, ya que los anticuerpos posvacunales impedirán detectar la enfermedad, pero posteriormente se manifestará mediante abortos durante la primera gestación, perpetuando así la brucelosis en el establo.
Palabras clave: Brucella abortus, becerras, inmunodifusión radial.
Abstract
Transmission of Brucella abortus to female calves from positive and negative cows was determined in the first week and third month of age. Two herds were used. Herd 1 consisted of 670 milking cows with a brucellosis seroprevalence of 21.6% (145/670). In this herd, groups of positive and negative cows were formed using the card and radial immunodifussion (RID) tests with native hapten. Blood samples were taken from female calves on two occasions: at one week of age and before animals were vaccinated against B. abortus. Of the 22 calves from the positive group, two (9.1%) were positive in the first week of life, but no more positive calves were found at three months of age. In the group of female calves born to negative cows, there were no positive animals at one week of age, but four out of 22 were found positive with the RID test at three months of age. A prevalence rate of 13.6% of positive calves for B. abortus in the third month of age was calculated. Twenty milk samples were obtained from this herd and B. abortus was isolated from all of them (100%). Using PCR, the strains found were confirmed to be field strains and not vaccine strains. Herd 2 consisted of 1800 milking cows, participating in the National Campaign against Animal Brucellosis, that had a seroprevalence of 1.94% (35/1800) detected from January to December 2009. In this herd, 1 170 records were analyzed using the results of the card and rivanol tests obtained from female calves younger than three months of age, of which 24 (2.1%) were found positive for B. abortus from January 2009 to June 2010. It is concluded that the diagnosis of brucellosis is necessary in female calves born in dairies to cows that have the disease, in order to prevent positive animals from remaining in the herd. Vaccine-induced antibodies will avert disease detection, but brucellosis will later manifest itself through abortions during first pregnancies, thus perpetuating the disease in dairies.
Key words: Brucella abortus, female calves, radial immunodiffusion.
]]> Introducción
La brucelosis bovina es causante de grandes pérdidas económicas debido principalmente a abortos en el último tercio de la gestación, disminución en la producción de leche, desecho anticipado del hato, nacimiento de becerras débiles y nacimiento de becerras aparentemente normales, pero positivas a Brucella abortus. En México esta enfermedad se encuentra difundida en todos los estados, únicamente la parte norte del estado de Sonora se encuentra libre de ella.1-3
En México, de acuerdo con un trabajo previo,4 la prevalencia de brucelosis en ganado bovino adulto es de 9%, pero se desconoce la frecuencia de la infección en becerras. A la fecha, solamente un autor cita que la incidencia en becerras puede variar desde 2.5% hasta 9%.5
Las vacas infectadas después de un aborto o de un parto eliminan la bacteria, la cual se transmite a otras vacas a través del contacto con placenta, descargas vaginales, fetos y líquidos fetales, por lo que la vaca y sus detritus se convierten en fuentes de infección.6
De acuerdo con un estudio, la concentración bacteriana de B. abortus en los cordones umbilicales en dos fetos de diferentes vacas positivas a la enfermedad fue de 4.3 x 109 ufc/g y de 1.4 x 1013 ufc/g.7 Estos organismos pueden sobrevivir y propagarse por medio de los alimentos y el agua. En condiciones de humedad alta, temperaturas bajas y de baja intensidad solar, la B. abortus puede permanecer viable durante meses en el agua, fetos abortados, estiércol, heno, materiales de trabajo y la ropa, pudiendo resistir la desecación en polvo y suelo, especialmente en presencia de material orgánico.2,5,8,9
En los bovinos infectados de brucelosis no es frecuente que se presenten signos después del aborto o parto, pero la mayoría de estos animales se convierten en portadores potenciales y continúan eliminando Brucella en la leche, calostro y en las descargas uterinas en partos posteriores.2, 5,8-12
La infección que se presenta en el útero puede permanecer latente en las becerras durante los primeros meses de vida; el animal puede permanecer serológicamente negativo hasta su primer parto, momento en el que comienza a eliminar la bacteria. Es por ello que las infecciones congénitas, o en los primeros meses de vida, representan riesgos relevantes debido a que actúan como reservorios y fuentes potenciales de infección en su vida reproductiva.13
Algunos estudios mencionan que en países en desarrollo, que cumplen estrictamente con las normas de vacunación y en donde no existe la posibilidad de pagar indemnizaciones por la eliminación de bovinos resistentes a la enfermedad, se presentan con alta frecuencia hatos lecheros que muestran tasas de prevalencia mayores a 20%.1,14
El objetivo de este estudio fue conocer la prevalencia de brucelosis en becerras no vacunadas contra B. abortus en la primera semana de vida y al tercer mes de edad, nacidas de vacas positivas, para compararla con la de becerras nacidas de vacas negativas, empleando para su diagnóstico las pruebas de tarjeta e inmunodifusión radial (IDR) con hapteno nativo.
]]> Material y métodos
El estudio se realizó en el estado de Querétaro de enero a junio de 2010 en dos hatos de bovinos lecheros de la raza Holstein.
El hato 1, con 670 vacas en producción y un programa de control de brucelosis, tenía una sero prevalencia de 21.6% (145/670) de vacas positivas, diagnosticadas por medio de las pruebas de tarjeta e IDR. Se tomaron muestras de la vena coccígea de 80 vacas secas para la obtención de suero, el cual se congeló para realizar el análisis colectivo. Una vez reunidas todas las muestras, se descongelaron a temperatura ambiente y se llevaron a cabo las pruebas de tarjeta e IDR. La prueba de tarjeta al 8% de concentración celular se utilizó como tamiz.15 La prueba de IDR con hapteno nativo15 se empleó como prueba confirmatoria, ya que permite la distinción entre anticuerpos vacunales y anticuerpos presentes por la infección con Brucella.16,17 Las pruebas de diagnóstico se llevaron a cabo en el Centro Nacional de Investigación Disciplinaria (CENID) de Microbiología Animal del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP).
Se tomaron dos muestras sanguíneas de la vena yugular de las becerras; la primera entre los días 2 y 7 de vida y la segunda entre los días 91 y 120 de edad, ésta última antes de su vacunación con dosis completa de cepa S19 de B. abortus. Dentro de las primeras 6 h de vida, todas las becerras fueron alimentadas con 4 L de calostro no pasteurizado, indistintamente si procedían de vacas positivas o negativas a Brucella. Los animales fueron alojados en becerreras de intemperie hasta su destete, en promedio, a los 90 días de edad.
El hato 2, con 1 800 vacas en producción, se encontraba inscrito en la campaña nacional contra la brucelosis en los animales, promovida por la Secretaría de agricultura, ganadería, desarrollo rural, pesca y alimentación (Sagarpa) (NOM-041-ZOO-1995)15 a partir de enero de 2009. Con base en los informes emitidos durante la campaña, se detectó una seroprevalencia de 1.94% en vacas (35/1800) mediante las pruebas de tarjeta y rivanol. Debido a la baja prevalencia de la enfermedad en este hato, se decidió realizar un estudio retrospectivo utilizando los registros oficiales de 1 170 becerras de la campaña, que incluían las pruebas de tarjeta y rivanol llevadas a cabo con los sueros de los animales menores de 3 meses de edad desde enero de 2009 hasta junio de 2010.
La extracción de ADN de los aislados y las cepas de referencia se realizó por el método de fenolcloroformo, descrita por Sambrook et al.18 El ADN extraido (100 ng) se utilizó como molde para la PCR. Para diferenciar la cepa S19 de B. abortus de los aislados de campo se utilizaron los iniciadores descritos por Sangari et al.19, y para eliminar la posibilidad de la presencia de la cepa de B abortus RB51, se usaron los iniciadores descritos por Vemulapalli et al.20
Resultados
En el hato 1 se conformaron grupos de vacas positivas y de vacas negativas; de cada uno se seleccionaron las vacas que habían parido una cría hembra viva. Así, en el grupo de vacas positivas nacieron 22 becerras, de las cuales 6/22 (27.3%) resultaron positivas a la prueba de tarjeta en la primera semana de vida, mientras que mediante la prueba de IDR sólo 2/22 (9.1%) becerras resultaron positivas. Al tercer mes de vida, las mismas 6 becerras resultaron positivas mediante la prueba de tarjeta y las mismas dos becerras salieron positivas mediante la prueba de IDR (Cuadro 1).
De manera similar, en el grupo de vacas negativas nacieron 22 becerras, de las cuales 6 (27.3%) resultaron positivas a la prueba de tarjeta en la primera semana de vida, mientras que mediante la prueba de IDR no se registró ninguna becerra positiva. Al tercer mes de vida, 8/22 (36.4%) becerras resultaron positivas a la prueba de tarjeta, mientras que sólo se encontraron 4/22 (18.2%) becerras positivas mediante la prueba de IDR (Cuadro 1). Con base en estos resultados, en diferentes días se recolectaron 20 muestras de leche de los tanques de enfriamiento, de los cuales se obtenía la leche para la alimentación de las becerras; las muestras de leche fueron inoculadas en agar Farrell y agar Brucella para el aislamiento, y los aislados obtenidos fueron identificados por pruebas bioquímicas mediante la tinción con cristal violeta y la aglutinación con acriflavina, para determinar su fenotipo: rugoso o liso. Se realizó la extracción de ADN de los aislamientos obtenidos y se utilizó como referencia el ADN de las cepas de B. abortus 544 y de las cepas vacunales RB51 y S19 (PRONABIVE), que habían sido cultivadas previamente en agar Brucella a 37°C durante 72 h.
]]> Para diferenciar la cepa S19 de B. abortus de los aislados de campo, con la PCR se amplifica un producto de 361 pb y un producto de 1063 para las demás cepas, y para eliminar la posibilidad de la presencia de la cepa de B. abortus RB51, se amplifica un producto de 1298 pb y un producto de 456 pb cuando se trata de cualquier otra cepa.El aislamiento de B. abortus, identificado como cepa de campo, se obtuvo en el 100% (20/20) de las muestras cultivadas.
En el hato 1, de una población total de 44 becerras muestreadas, nacidas de madres positivas o negativas, en los primeros tres meses de vida se encontraron 6 becerras positivas a B. abortus mediante la prueba de IDR, con una tasa de prevalencia de 13.6%.
En el hato 2, con base en la campaña nacional contra la brucelosis en los animales, se obtuvieron 1 170 registros de becerras menores de 3 meses de edad, de las cuales 24 becerras resultaron positivas a B. abortus mediante las pruebas de tarjeta y rivanol, lo cual equivale a una prevalencia de 2.05%. No se contó con los resultados de la prueba de IDR.
Discusión
La prueba de tarjeta se ha caracterizado por tener una alta sensibilidad, por lo que fue la prueba de tamiz oficial de la campaña nacional contra la brucelosis en los animales y está fundamentada legalmente en la NOM-041-ZOO-1995. Sin embargo, la prueba no es confiable para diferenciar los anticuerpos vacunales o los pasivamente adquiridos por medio del calostro, de los anticuerpos causados por la enfermedad.5,15,17 En un estudio realizado por Aparicio et al.14 se menciona que utilizar una prueba diagnóstica de tamiz como la de tarjeta, aunada a la prueba de IDR, mejoraría considerablemente la capacidad de distinguir los anticuerpos vacunales de los anticuerpos causados por la infección. En este estudio, en el hato 1 se puede observar que en el grupo de becerras nacidas de madres positivas a B. abortus, 6 (27.3%) resultaron positivas en la primera semana de vida y al tercer mes de edad con la prueba de tarjeta, mientras que la prueba de IDR sólo dio 2 resultados positivos (9.1%) en becerras positivas de una semana de vida y también al tercer mes de edad. Se puede establecer que la prueba de tarjeta clasifica a 4 becerras (18.2%) como falsos positivos con respecto a la prueba de IDR.
En el grupo de becerras nacidas de madres negativas a B. abortus, 6 (27.3%) resultaron positivas en la primera semana de vida y 8 (36.4%) al tercer mes de edad con la prueba de tarjeta; con la prueba de IDR ninguna becerra resultó positiva en la primera semana de vida, pero 4 (18.2%) fueron positivas al tercer mes de edad. Se puede concluir que la prueba de tarjeta clasificó a 6 (27.3%) y 4 (18.2%) becerras como falsos positivos en la primera semana de vida y al tercer mes de edad, respectivamente, con respecto a la prueba de IDR. La OIE2 menciona que los rumiantes generalmente no presentan signos después de su primer aborto por B. abortus, y que pueden convertirse en portadores potenciales al continuar eliminando Brucella en la leche y en las descargas uterinas durante los partos posteriores.11 En un estudio realizado por Aparicio et al.14 en un hato bovino con brucelosis, de 35 vacas en producción, 6 (17.1%) resultaron positivas a las pruebas de IDR y ELISA-competitivo, de estas vacas se logró el aislamiento en leche de B. abortus biotipo 1, cepa de campo. En el presente estudio, al lograr el aislamiento de B. abortus cepa de campo de los tanques de enfriamiento de donde se obtenía el alimento de las becerras, se puede plantear la hipótesis de que las becerras nacidas de madres negativas se infectaron al consumir la leche de madres positivas, que no se separaba ni se pasteurizaba.
En un estudio realizado por Crawford et al.7 se menciona que la concentración bacteriana de los cordones umbilicales de dos fetos de diferentes vacas positivas a B. abortus fue de 4.3 x 109 bacterias/g y de 1.4 x 1013 bacterias/g, lo cual representa una fuente de infección para otras becerras que nazcan en el mismo lugar. La otra forma de posible infección es a través del personal que atiende los partos, ya que en ese hato no se contaba con paridero, ni con personal ni con materiales para vacas negativas, distintos del de vacas positivas.
Posiblemente un mayor número de becerras en el grupo de vacas negativas adquirió la infección en los primeros tres meses de vida con respecto al grupo de las vacas positivas, que estaban protegidas por los anticuerpos presentes en el calostro.
]]> En México no se realiza el diagnóstico de brucelosis a edades tempranas, por consiguiente las becerras que nacen o que se infectan en la etapa de lactancia pasan desapercibidas hasta que llegan a la edad reproductiva, cuando se realizan pruebas serológicas a todo el ganado en algunos hatos; en otros, sólo se realizan pruebas si abortan, y hay hatos en los que no se tiene ningún interés por diagnosticar la enfermedad. Éstas son algunas de las circunstancias por las que se dificulta el control y erradicación de la brucelosis.Se concluye que: es necesario realizar el diagnóstico de esta enfermedad en las becerras de establos con presencia de brucelosis, para evitar dejar animales positivos en el hato, cuya infección se ocultará con los anticuerpos posvacunales, y se manifestará al presentar aborto durante su primera gestación, perpetuando así la infección en el establo. Esta premisa se demuestra en el presente estudio realizado en un establo lechero con una prevalencia de 21.6% y con presencia de Brucella abortus comprobada mediante el aislamiento de cepas de campo. En él se demostró que de 22 becerras nacidas de vacas positivas a brucelosis, 2 becerras (9.1%) resultaron seropositivas a la semana de vida usando una prueba con elevada especificidad como la IDR, las mismas becerras se volvieron a presentar positivas a los tres meses de vida antes de la vacunación con S19. Adicionalmente, en las 22 becerras hijas de vacas seronegativas se encontró que eran seronegativas en el muestreo a la semana de edad, pero 4 de ellas (18.2%) se volvieron seropositivas a la prueba de IDR a los tres meses de vida debido a la elevada presencia de Brucella en el hato.
Agradecimientos
Se agradece al MVZ Tomás Merás Nevares por su apoyo técnico en la parte experimental de este estudio.
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