La vacunación simultánea de bovinos con Lactobacillus casei y la vacuna bivalente contra babesiosis bovina genera una mejor protección contra Babesia bovis y B. bigemina transmitidas por garrapatas en condiciones extremas de campo

The simultaneous vaccination of bovines with Lactobacillus casei and the bivalent vaccine against bovine babesiosis induces a better protection against Babesia bovis and B. bigemina transmitted by ticks in extreme field conditions

Carlos R. Bautista-Garfias* Roberto Castañeda-Arriola* Jesús A. Álvarez-Martínez* Carmen Rojas-Martínez* Julio V. Figueroa-Millán* Astrid Rodríguez-Lozano*^,**

** C.E.P. La Posta, km 22.4, carretera Veracruz-Córdoba, Paso del Toro, Medellín de Bravo, 91700, Veracruz, México.

Recibido el 22 de agosto de 2011
Aceptado el 27 de febrero de 2012.

Abstract

The effect of Lactobacillus casei on INIFAP's mixed vaccine against bovine babesiosis (VAC) was assessed in bovines in an endemic babesiosis area. It was previously reported that L. casei increases the efficiency of the Mexican mixed vaccine against bovine babesiosis under controlled conditions. The results of the present study demonstrated the effectiveness of simultaneous vaccination of bovines with L. casei and the mixed vaccine against bovine babesiosis in eliciting a protective immune response under extreme conditions in the field. Twenty Babesia spp free bovines were allocated into three groups: un-vaccinated (Control, n = 9), vaccinated with VAC (n = 5), and vaccinated simultaneously with VAC and Lactobacillus casei (LC-VAC, n = 6). All animals were kept in a tick and Babesia spp free field at Coatepec, Veracruz during 24 days before moving them to Paso del Toro, Veracruz, for a natural exposition to Babesia spp transmitted by Riphicephalus (Boophilus) microplus ticks. Protection against Babesia spp was observed in bovines belonging to VAC and LC-VAC groups, while control animals showed severe clinical babesiosis. Bovines in VAC-LC group showed less clinical signs between days 12-16 after challenge as compared with animals in VAC group. All bovines showed both Babesia spp after challenge. Levels of IgG anti-Babesia in animals from both vaccinated groups, determined by indirect immunofluorescence test, always were higher to Babesia bovis than to B. bigemina after vaccination and challenge. It was demonstrated the efficiency of simultaneous vaccination of bovines with VAC and L. casei, in eliciting a better protective immune response against naturally transmitted Babesia spp under extreme field conditions.

Key words: Bovine babesiosis bivalent vaccine, Lactobacillus casei, efficacy, field challenge.

Se evaluó el efecto de Lactobacillus casei en la vacuna mixta contra babesiosis bovina del INIFAP (VAC), en bovinos de un área endémica de babesiosis. Previamente se informó que L. casei incrementa la eficacia de la vacuna mixta mexicana contra babesiosis bovina bajo condiciones controladas. Los resultados aquí expuestos demostraron dicha efectividad para generar una respuesta inmunitaria protectora bajo condiciones extremas en el campo. Veinte bovinos libres de Babesia spp fueron distribuidos al azar en tres grupos: testigo no vacunado (Testigo, n = 9), vacunado con VAC (n = 5), y vacunado simultáneamente con VAC y L. casei (LC-VAC, n = 6). Todos los animales se mantuvieron en un corral libre de garrapatas y Babesia spp en Coatepec, Veracruz durante 24 días antes de transportarlos a Paso del Toro, Veracruz, para una exposición natural a Babesia spp transmitida por garrapatas Riphicephalus (Boophilus). Se observó protección contra Babesia spp en bovinos pertenecientes a los grupos VAC y LC-VAC, mientras que los animales testigo mostraron signos clínicos de babesiosis aguda. Los bovinos del grupo VAC-LC mostraron menos signos clínicos que los del grupo VAC entre los días 12-16. Todos los bovinos mostraron Babesia spp después de la confrontación. Los niveles de IgG anti-Babesia en los animales de los grupos vacunados, determinados por inmunofluorescencia indirecta, siempre fueron más elevados contra Babesia bovis que contra B. bigemina después de la vacunación y de la confrontación. Se demostró la eficacia de la vacunación simultánea con VAC y L. casei en bovinos, para generar una mejor respuesta inmunitaria protectora contra Babesia spp transmitida naturalmente por garrapatas, bajo condiciones extremas de campo.

Palabras clave: Vacuna bivalente contra bebesiosis bovina, Lactobacillus casei, efectividad, confrotación de campo.

Introducción

Una de las enfermedades parasitarias más importantes del ganado en todo el mundo es la babesiosis bovina, enfermedad producida por protozoarios del género Babesia.¹ En México, 75% de las 23,316,000 cabezas de ganado vacuno² están en riesgo de adquirir babesiosis.³ En este sentido, es importante señalar que, además de los adultos, recientemente se han documentado casos clínicos de babesiosis en becerros menores a nueve meses de edad, nacidos en áreas endémicas de la enfermedad.⁴ En el Centro Nacional de Investigación Disciplinaria de Parasitología Veterinaria (CENID-PAVET) del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) del gobierno mexicano, se desarrolló una vacuna viva atenuada contra Babesia bovis y B. bigemina, que protege al menos a 80% de los bovinos vacunados contra cepas virulentas de Babesia^5-7 y a 70% de los animales bajo condiciones extremas de campo.⁸

Por otro lado, se ha propuesto la utilización de la bacteria ácido-láctica inmunoestimulante Lactobacillus casei como una alternativa para el control de diferentes enfermedades parasitarias.⁹ En este contexto, se ha demostrado que L. casei, por sí misma, induce una respuesta protectora contra Babesia microti en ratones cuando es inoculada antes o el mismo día de la infección¹⁰ y contra Babesia bovis y B. bigemina en ganado bovino, cuando la bacteria ácido-láctica es administrada antes de la vacuna mixta contra babesiosis bovina bajo condiciones controladas de laboratorio; sin embargo, L. casei sola no indujo protección en el ganado vacuno contra el desafío con Babesia.¹¹

En el presente estudio se evaluó la efectividad de la protección conferida por la administración simultánea de L. casei y la vacuna mixta contra babesiosis bovina en bovinos que después de vacunados fueron expuestos a la transmisión natural de Babesia bovis y B. bigemina por la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus del ganado bajo condiciones extremas en Paso del Toro, Veracruz, México, considerada como área endémica de babesiosis bovina.¹²

Material y métodos

Vacuna contra babesiosis bovina

Se utilizó la vacuna bivalente atenuada contra babesiosis bovina desarrollada por el INIFAP, que consiste en una mezcla de la cepa atenuada BIS de Babesia bigemina y la clona BOR de B. bovis.⁸

Cepa bacteriana

La cepa ATCC7469 de Lactobacillus casei se cultivó bajo condiciones aeróbicas en el medio MRS^* a 37°C durante 18 h. Posteriormente, los microorganismos fueron centrifugados a 5000 g por 10 min, y el precipitado se lavó varias veces con solución salina amortiguadora estéril de fosfatos (PBS), más tarde, los organismos murieron por calor en agua hirviendo durante 30 min y el número de organismos en el cultivo se ajustó a 10⁹ unidades formadoras de colonias (CFU)/ml de PBS.^13,14

Animales

Veinte bovinos cruza Holstein × Suizo, libres de tuberculosis, brucelosis, babesiosis y anaplasmosis, con una edad promedio de nueve meses, fueron distribuidos al azar en tres grupos: no-vacunado: Testigo (n = 9), inmunizado con la vacuna mixta contra babesiosis bovina: VAC (n = 5), e inoculado con VAC y Lactobacillus casei: LC-VAC (n = 6).

Diseño experimental

Los animales se alojaron en un potrero en Coatepec, Veracruz, ubicado a 1250 metros sobre el nivel del mar; coordenadas geográficas: 19°25'0'' Norte, 96°47'0'' Oeste, donde recibieron los siguientes tratamientos: los animales del grupo Testigo recibieron 3 ml de solución salina estéril vía intramuscular (im) en el anca derecha; los del grupo VAC fueron inmunizados vía im en el anca derecha con 1 × 10⁸ eritrocitos infectados con cada una de las especies de Babesia del cultivo in vitro en un volumen de 3 ml, y los bovinos del grupo LC-VAC fueron inoculados vía im en dos sitios diferentes: con VAC (3 ml) en el anca derecha y con Lactobacillus casei (3 × 10⁹ u.f.c.) en un volumen de 2 ml, en el anca izquierda. Luego se mantuvieron en observación 24 días antes de transportarlos a Paso del Toro, Veracruz (10 metros sobre el nivel del mar, coordenadas geográficas: 19°2'0'' Norte, 96°7'0'' Oeste), un área endémica de babesiosis bovina con una prevalencia estimada de babesiosis bovina mayor a 90%,¹² donde fueron expuestos en el campo a garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus naturalmente infectadas con Babesia bovis y Babesia bigemina. Esta situación se denominó "condiciones extremas de campo", definidas como la suma de condiciones de clima tropical, tiempo de verano, severa infestación de potreros con garrapatas y área endémica de babesiosis bovina.

Registro de temperatura, volumen celular aglomerado (hematocrito), eritrocitos parasitados con Babesia y niveles de anticuerpos IgG anti-Babesia

Criterio para determinar babesiosis aguda

Un animal fue considerado con babesiosis aguda (requiriendo tratamiento para evitar la muerte) cuando mostró los siguientes parámetros: 1) No vacunado contra babesiosis bovina; 2) Más de 25% de reducción del volumen celular aglomerado (VCA) con respecto al valor basal; 3) Temperatura rectal mayor a 40°C durante dos días seguidos; y 4) Presencia de Babesia spp en frotis sanguíneos teñidos con Giemsa.^5-8,11 Además, se tomó en cuenta la pobre condición física del animal (no medible).

Evaluación de signos clínicos de babesiosis y babesiosis aguda con riesgo de muerte

Similarmente, los porcentajes de signos clínicos de babesiosis y babesiosis aguda se determinaron de la siguiente manera:

• El porcentaje de signos clínicos de babesiosis = número de animales con fiebre y presencia de parásitos en frotis teñidos con Giemsa en el grupo/número total de animales en el grupo × 100.

• El porcentaje de babesiosis aguda con riesgo de muerte = número de animales en el grupo que mostraron fiebre, reducción de más de 25% del valor basal del VCA y presencia de parásitos en frotis teñidos con Giemsa /número total de animales en el grupo × 100.

Es importante señalar que, en contraste con estudios previos, los bovinos experimentales en el grupo Testigo se trataron contra Babesia con 4,4'-(diamino) dibenzamide diaceturate^* (Ganaseg) cuando mostraron signos clínicos de babesiosis aguda después de la confrontación, para evitar su muerte.^6-8

Análisis estadístico

Resultados

Temperatura

Desde el punto de vista clínico, los animales del grupo VAC-LC mostraron un mejor desempeño en comparación con los bovinos del grupo VAC, particularmente en el periodo de siete días, que abarcó del día 14 al día 20 dc. En este periodo, el promedio de la temperatura rectal (+ EE) fue significativamente más alto (P < 0.05) en los animales del grupo VAC (40 + 0.08°C), en comparación con los bovinos del grupo LC-VAC (39.5 + 0.1°C) (Figura 1).

Volumen celular aglomerado (VCA)

En el día 0 no se observaron diferencias significativas en este parámetro entre los grupos. Al día 15 dc el porcentaje promedio de VCA en el grupo no-vacunado (Testigo) fue significativamente más bajo (16.6%, P < 0.05), comparativamente con los valores observados en los grupos VAC (21.5%) y LC-VAC (22.3%), y representó una disminución de 52.4% con respecto al valor basal (día 0). Los días 16 y 17, el VCA fue significativamente diferente en los grupos vacunados, en comparación con el grupo Testigo (P < 0.05) (Figura 2).

Porcentaje de eritrocitos parasitados PEP

Niveles de anticuerpos IgG anti-Babesia

El promedio de los niveles de anticuerpos IgG anti-Babesia en ambos grupos de animales vacunados siempre fue más alto contra B. bovis que contra B. bigemina, después de la vacunación y después de la confrontación. Al día ocho dc, el promedio de los niveles de anticuerpos contra B. bigemina fue más alto en el grupo LC-VAC que en el grupo VAC (Figura 4a). Similarmente, el día 17 dv, el promedio de los niveles de anticuerpos contra B. bovis fue más alto en el grupo VAC en comparación con el grupo LC-VAC; mientras que el día 20 dc el promedio de los niveles de anticuerpos contra B. bovis fue más alto en el grupo LC-VAC que en el grupo VAC (Figura 4b); sin embargo, no se observaron diferencias significativas. En el grupo Testigo el promedio de los niveles de anticuerpos anti-Babesia dc fue muy bajo, comparado con los promedios de los grupos LC-VAC y VAC.

Signos clínicos de babesiosis y de babesiosis aguda con riesgo de muerte

Se observaron signos clínicos de babesiosis (principalmente fiebre) el día 16 dc en los nueve animales (100%) del grupo Testigo, en los seis bovinos (100%) del grupo VAC y en tres de seis animales (50%) del grupo LC-VAC; mientras que se observaron signos de babesiosis aguda con riesgo de muerte en los nueve bovinos (100%) del grupo Testigo pero en ninguno de los animales (0%) de los grupos LC-VAC y VAC. El mismo día, todos los animales del grupo Testigo mostraron tanto B. bovis como B. bigemina en sus frotis sanguíneos teñidos con Giemsa al ser examinados con el microscopio óptico. Al día 16 dc, tres de nueve animales no vacunados estaban echados, mientras que todos los bovinos de los grupos vacunados estaban de pie. Ese mismo día, todos los animales en el grupo Testigo fueron tratados contra babesiosis con 4,4'-(diamino)dibenzamide diaceturate^* (Ganaseg) durante dos días consecutivos; a pesar del tratamiento, el día 26 dc un animal murió. Los animales vacunados (grupos LC-VAC y VAC) no recibieron tratamiento contra babesiosis. El día 20 dc todos los animales fueron tratados contra garrapatas (baño garrapaticida). Los bovinos mostraron cargas promedio de 2000 garrapatas (oscilando entre 1500 a 3000 garrapatas por animal). Un ejemplo de la carga de garrapatas se muestra en la Figura 5.

Discusión

Los resultados obtenidos demostraron la capacidad de L. casei inoculado simultáneamente con la vacuna mixta contra babesiosis bovina, para incrementar la eficiencia de dicha vacuna en animales (aun en menores de nueve meses de edad) expuestos a la confrontación natural con B. bovis y B. bigemina transmitidas por la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus del ganado, y corroboraron los hallazgos previos observados en bovinos vacunados y confrontados bajo condiciones controladas con Babesia bovis y B. bigemina.¹¹ En el estudio de Bautista et al.¹⁰ no se observó protección contra la confrontación con Babesia spp en bovinos tratados únicamente con L. casei. Con base en esa observación, en el presente estudio no se incluyó un grupo de bovinos tratados solamente con L. casei. Similarmente, los resultados sugieren que los bovinos del grupo VAC-LC están mejor protegidos contra la infección natural con Babesia bovis y B. bigemina transmitidas por garrapatas, que aquéllos que solamente recibieron la vacuna contra babesiosis. Se cree que los incrementos en el promedio de temperatura observados los días 24 y 26 en el grupo VAC, se pudieron deber a una reinfección con Babesia que luego fue controlada. Se sabe que L. casei estimula el sistema inmunitario innato por medio de la activación de receptores tipo-Toll (Toll-like receptors, TLRs) y la producción de citocinas tipo Th1.^17,18 Los TLRs no solamente inducen respuestas inmunitarias innatas, sino que también modulan la respuesta inmunitaria adaptativa celular y humoral que da lugar a una mejor respuesta inmunitaria adquirida a un antígeno en particular, como los antígenos de las vacunas.^19,20 En este sentido, se ha demostrado que una vacuna protectora de Leptospira borgpetersenii muerta induce una potente inmunidad Th1 que comprende respuestas mediadas por linfocitos T CD4 y T γδ T en el ganado vacuno.^21,22

Los resultados observados en el presente estudio sugieren que el uso de L. casei en vacunas contra babesiosis bovina podría disminuir las severas respuestas a la vacunación que se observan en el ganado vacunado.²³

Es probable que la respuesta inmunitaria generada en este estudio por L. casei y la vacuna bivalente contra babesiosis consistió en una combinación de ambos brazos de la respuesta inmunitaria, celular y humoral; sin embargo, los mecanismos celulares deben ser investigados con más detalle en estudios futuros.

El bajo promedio de temperatura observado en el periodo de siete días después de la exposición en el campo (días 14-20) probablemente se debió a la menor presencia de parásitos en los animales del grupo LC-VAC (39.5°C), en comparación con lo observado en los bovinos del grupo VCA (40°C).

La caída en el VCA (particularmente durante los días 15, 16 y 17) se observó principalmente en los bovinos del grupo Testigo por la infección de ambas especies de Babesia y la severa infestación por garrapatas (Figura 5), mientras que la observada en los animales de los grupos LC-VAC y VAC probablemente fue causada por la sola infestación de garrapatas.

El PEP mostrado por los animales del grupo VAC, similar al de los bovinos del grupo Testigo, sugiere que Babesia spp fue finalmente controlada; sin embargo, los parásitos atenuados de la vacuna sola generaron una respuesta protectora en los animales vacunados, pero incapaz de evitar los signos clínicos temporales causados por las cepas virulentas provenientes de la infección natural.

El bajo PEP observado en los bovinos del grupo LC-VAC en comparación con los valores mostrados en los animales de los grupos Testigo y VAC probablemente se debió a la estimulación de una mejor respuesta inmunitaria que controló la infección por Babesia con mayor eficacia. En este contexto, es probable que la respuesta inmunitaria innata fue activada por L. casei, como se ha demostrado en las infecciones por B. microti.¹⁰ Similarmente, se ha demostrado que es importante la estimulación apropiada de la respuesta inmunitaria innata en becerros, que involucra la inducción de citocinas Th1 y de células tipo-NK en el bazo, para el control de B. bovis transmitida por garrapatas R. (Boophilus) microplus.²⁴

Se especula que las diferencias en los promedios de los niveles de anticuerpos IgG anti-B. bovis y anti-B. bigemina en los sueros de los animales vacunados en este sentido, posiblemente se debieron a diferentes subclases de IgG estimuladas por los tratamientos; es decir, el tratamiento simultáneo con L. casei y la vacuna contra babesiosis estimuló diferentes subclases de IgG, a diferencia del tratamiento con la vacuna sola. Sin embargo, se requiere llevar a cabo más estudios en este sentido.

Es importante señalar que todos los animales en los tres grupos fueron mantenidos en el potrero infestado con garrapatas hasta por 16 días después de que se aplicó el tratamiento anti-Babesia en los animales del grupo Testigo, periodo en el cual se observó una disminución en el VCA en todos los animales. Respecto a ello, debe tomarse en cuenta que el efecto directo de la infestación masiva con garrapatas en los animales, que causa anemia y supresión del sistema inmunitario de los bovinos,^27,28 puede dar lugar a reinfecciones con Babesia u otras infecciones (virales, bacterianas, fúngicas) en animales débiles; por esta razón, es vital llevar a cabo medidas de control de garrapatas, además de la vacunación contra Babesia spp en zonas endémicas de babesiosis. Los resultados del presente estudio concuerdan con investigaciones recientes en las cuales se ha indicado que para mejorar las vacunas, los patrones moleculares asociados con patógenos pueden ser utilizados para inducir respuestas inmunitaria innatas, vía receptores tipo-Toll, que promueven la inmunidad adaptativa.²⁹ En este contexto, la observación reciente de que casos clínicos de babesiosis se pueden presentar en becerros menores de nueve meses de edad no-vacunados de una zona endémica de babesiosis⁴ y los resultados del presente trabajo, sugieren que el uso de L. casei puede proporcionar protección adicional a la vacuna bivalente contra babesiosis bovina, tanto en bovinos adultos como en becerros, contra la infección por Babesia en explotaciones localizadas bajo condiciones tropicales donde la babesiosis bovina generalmente es endémica.

Con base en los resultados obtenidos, se concluye que: 1) la eficacia de la administración simultánea de L. casei y la vacuna mixta mexicana contra babesiosis bovina fue mejor que la de la vacuna sola, en términos de presentación de signos clínicos de la enfermedad después de la exposición de animales vacunados a una infestación masiva con garrapatas infectadas con B. bigemina y B. bovis en un área endémica de babesiosis bovina; 2) la administración simultánea de L. casei y la vacuna bivalente contra babesiosis bovina genera una protección en los animales vacunados contra la infección natural por Babesia, similar a la observada en bovinos tratados con L. casei dos días antes de la administración de la vacuna bivalente contra babesiosis bovina; 3) se requiere de más estudios para dilucidar los mecanismos que ocurren en los animales vacunados con L. casei y la vacuna bivalente contra babesiosis bovina; 4) los animales menores de nueve meses de edad no vacunados contra babesiosis, desarrollan babesiosis aguda cuando se exponen a una infestación masiva con garrapatas infectadas con B. bovis y B. bigemina.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado con fondos del proyecto número 6216955P del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP).

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