Un probiótico definido aumenta la exclusión de Salmonella enterica serovariedad Enteritidis durante la crianza de aves ligeras*

Enhancement of competitive exclusion by a defined probiotic on Salmonella enterica serovar Enteritidis colonization during rearing of Leghorn chicks

Marco Antonio Juárez Estrada** Jessica Alejandra Molina Hernández** Lourdes González Soto**

** Departamento de Producción Animal: Aves, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F., Tels. 5616–6923, 5622–5867 y 68 ext. 220. Correo electrónico: britoco@unam.mx

Abstract

Competitive exclusion degree from a defined (DP) and undefined probiotic (UDP) administered to one–day Leghorn chicks and challenged with 1 x 10⁸ CFU of Salmonella enterica serovar Enteritidis fagotype 13^A (SE) was evaluated. Birds with DP at 20 day old showed 21.7% of SE positive isolates in liver–spleen (LS), less than 51.7% recorded from birds without any probiotic. In a second study, birds that received DP living together with a group inoculated with SE at third day old, showed 7.5% infection in LS at 13 day of age and 12.5% at 15 day. Whereas, SE inoculated group had 75% and 57.5% of SE isolates, respectively. A third group, living with the last two, without DP or SE showed 27.5% of SE in LS at 13 day, and only 10% at 15 day of age. DP group at 13 day of age, showed a decrease of 75% of SE colonization at cecal tonsils (CT), instead, SE inoculated group was 100% colonized; at 15 day of age, DP decreased 51.4% of SE colonization in CT, while control group showed a decrease of 42.5%, and 68.6% of SE in CT at 13 and 15 days, respectively. In a third study, a DP booster group was dosed three times, at 14 days of age, it had only 4.5% of SE isolates from LS. Birds without DP showed 34.6% of SE isolates, and the group inoculated with only one dose had 17.2% of SE positive birds. DP booster group showed 22.7% of SE in CT, the group with one dose had 62% of SE isolates; birds without DP decreased only 3.9% of SE colonization. DP showed greater margin of protection, decreased horizontal transmission of SE PT13^A in LS and CT, and it has good transmission potential. DP booster treatment was better than only one dose. DP is a good alternative for SE prevention and eradication in commercial poultry.

Key words: Competitive Exclusion, Food Safety, Foodborne Illness, Probiotics, Newly Hatched Chicks.

Resumen

Se determinó el grado de exclusión de un probiótico definido (PECD) y otro no definido (PECND) administrados a aves de la raza Leghorn, de un día de edad, sobre el desafío con 1 x 10⁸ UFC de Salmonella enterica serovariedad Enteritidis fagotipo 13^A (SE). Las aves con PECD al día 20 mostraron 21.7% de aislamientos positivos de SE en hígado–bazo (HB), menor al 51.7% observado en las aves sin probiótico. En un segundo estudio, las aves que recibieron el PECD y convivieron en piso con un grupo inoculado con SE desde el día tres, mostraron una infección en HB de 7.5% al día 13 y 12.5% al día 15 de edad, el grupo inoculado mostró 75% y 57.5% de SE, respectivamente. Un tercer grupo que convivió con los dos anteriores y no recibió probiótico ni SE, mostró 27.5% de SE en HB al día 13 y sólo 10% al día 15. El grupo con el probiótico muestra una reducción de 75% de SE en tonsilas cecales (TC) al día 13, mientras que el inoculado fue 100% colonizado; al día 15, el probiótico redujo 51.4% la colonización, mientras que el testigo mostró una reducción de 42.5% al día 13 y de 68.6% al día 15. En un tercer estudio un grupo redosificado tres veces, al día 14 de edad disminuyó el porcentaje de aislamientos de SE en HB a tan sólo 4.5%. Las aves que no recibieron el probiótico mostraron 34.6% de SE y las aves que lo recibieron una sola vez mostraron 17.2%. El grupo con refuerzo mostró 22.7% de colonización en TC, el grupo con una dosis mostró 62% de aves positivas a SE, las aves sin probiótico redujeron sólo 3.9% esta colonización. El grupo con PECD muestra mayor margen de protección, reduce la transmisión horizontal de SE PT13^A en HB y TC; exhibe además un buen potencial de transmisión. El refuerzo de dosificación del PECD fue mejor que una sola toma. El PECD constituye una buena alternativa en la prevención y erradicación de la SE en la avicultura comercial.

Palabras clave: Exclusión competitiva, Inocuidad alimentaria, Intoxicación alimentaria, Probióticos, Pollitos neonatos.

Introducción

El género Salmonella es un grupo de bacterias gramnegativas que pertenece a la familia Enterobacteriaceae y comprende más de 2 463 serotipos. Los serotipos de interés en la producción avícola se dividen en dos grupos, en el primero se encuentran las Salmonellas inmóviles, como Salmonella enterica serovariedad Gallinarum (SG) y S. enterica sero–variedad Pullorum (SP); en el segundo grupo algunas Salmonellas móviles, como S. enterica serovariedad Typhimurium (ST) y Salmonella enterica serovariedad Enteritidis (SE), que producen paratifoideas en humanos.^1–3 Las campañas para la erradicación de SG que se han efectuado en varios países, incluido México, han sido muy efectivas.^4,5 Se ha observado que SE estuvo excluida de las aves comerciales durante la primera parte y parte de la segunda mitad del siglo XX, principalmente debido a la exclusión que ejercía SG sobre S. enteritidis; sin embargo, de acuerdo con las observaciones efectuadas por Rabsch et al.,⁵ actualmente SE cubre el nicho ecológico que ha dejado S. gallinarum, por lo cual S. enteritidis se ha convertido en el principal agente patógeno asociado con la producción de huevo y carne de pollo.^1,2,6,7 El consumo de cualquier alimento contaminado con S. enteritidis puede dar lugar a enteritis humana severa, la cual en niños, ancianos y personas inmunocomprometidas puede ser mortal.^2,6–8

Debido a la integración vertical en la industria avícola moderna, una parvada de reproductoras puede generar miles de descendientes comerciales contaminados con Salmonella spp.^1–3,6 Las aves reproductoras no muestran signos clínicos; aun cuando existan aislamientos positivos de SE a partir de muestras de contenido cecal, heces y cama, las aves se convierten en un reservorio que representa un riesgo potencial para la salud pública.^2,9 En cuanto una parvada es positiva a S. enteritidis, ésta es difícil de eliminar.¹,²,⁹,¹⁰ Ante la inminente prohibición de los antibióticos empleados como promotores de crecimiento (APC) por parte de la Unión Europea y Estados Unidos de América, aquéllos deben sustituirse por métodos igualmente efectivos que los APC.^10–13 En los últimos años se ha explorado como alternativa a la utilización de antibióticos, algunos métodos naturales que tienen la finalidad de combatir este tipo de patógenos entéricos.¹³–²³En condiciones de crianza natural, el pollito al momento de su eclosión adquiere su microbiota nativa intestinal (MNI) a partir del medio ambiente, esta última coloniza el tracto digestivo, principalmente el divertículo esofágico y los sacos ciegos.^24,25 La MNI es una compleja y dinámica población de microorganismos que normalmente habitan el tracto digestivo de las aves domésticas en una estrecha relación de homeocinesis.^12,26–28 La alta susceptibilidad de las aves jóvenes a patógenos entéricos, aunada a su falta de MNI competitiva, fueron señaladas hace más de 30 años como causantes de infección de Salmonella spp.²⁹

Nurmi y Rantala²⁹ mostraron que la colonización por Salmonella spp, en los pollitos recién nacidos, podía ser prevenida a través de la administración oral de bacterias procedentes de MNI de aves adultas. La propuesta de Nurmi ha sido ampliamente adoptada en diferentes países para el control de Salmonellas en aves y se conoce como concepto Nurmi o exclusión competitiva (EC).^{9,17,22,30,31}

Gran parte del conocimiento fundamentado en estas nuevas metodologías se ha basado en el empleo de bacterias lácticas presentes en la MNI, las cuales sintetizan, como parte de su metabolismo, sustancias que muestran actividad inhibitoria para bacterias filogenéticamente relacionadas y no relacionadas con ellas.^{16,17,22,26,32}

Actualmente se están desarrollando productos derivados de la tecnología con la finalidad de encontrar organismos específicos con propósitos específicos; dicho avance se basa en el aislamiento de microorganismos potencialmente benéficos; en este grupo se encuentran los probióticos.^13,18,19,23 Los probióticos incluyen bacterias y algunos de sus metabolitos, los microorganismos más utilizados son las bacterias productoras de ácido láctico, que contribuyen al equilibrio microbiano intestinal.^{12,17,19,23,26} El empleo de probióticos puede ser una alternativa para el control de S. enteritidis.^{11,17,18,22,31,33}

El éxito o fracaso del tratamiento con cultivos de EC en los pollos recién nacidos depende del rápido establecimiento de las bacterias que contienen; sin embargo, aún no se conoce exactamente la cantidad y periodicidad óptima para lograr este objetivo.^{9,11,15,34–37} En el presente estudio se evalúa el efecto de la administración primaria de un probiótico sobre el establecimiento de Salmonella en aves de la raza Leghorn de reemplazo, criadas en jaula o en piso.

Material y métodos

Animales de experimentación

Se emplearon pollitos de la raza Leghorn de un día de edad, provenientes de una incubadora comercial, en los estudios de piso se alojaron en corrales de 1.5 m2, en las pruebas en jaula se alojaron en baterías eléctricas.*****

Condiciones de manejo

Las aves se mantuvieron en unidades de aislamiento del Departamento de Producción Animal: Aves, de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México (DPA: Aves, FMVZ–UNAM), en condiciones de bienestar, de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM–069–ZOO–1999. Se alimentaron con dieta de harina isocalórica e isoproteínica, no se le adicionó antibiótico ni anticoccidiano y se proporcionó agua potable ad libitum.

Prueba bacteriológica de inocuidad

Con la finalidad de descartar presencia de Salmonella spp, en las aves empleadas en cada estudio, se tomó al día de edad una muestra de hígado, bazo y tonsilas cecales de 20 aves, 100 g de muestras de la cama de transporte y 200 g de las muestras del alimento que se proporcionó durante todo el estudio, se efectuó un estudio bacteriológico de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM–005–ZOO–1993.

Inóculo de desafío

Se empleó una cepa de SE PT13^A proveniente del National Veterinary Services Laboratory, en Ames, Iowa, Estado Unidos de América aprobada para su uso en el DPA: Aves, FMVZ–UNAM. La cepa SE PT13^A crece en medios generales y selectivos aun en presencia de AN o NO (resistencia genómica). Con la finalidad de inhibir el crecimiento de otras bacterias que no fueran SE PT13^A, el AVB contenía 200 ug/mL de AN y 25 ug/mL de NO. El inoculo de SE PT13^A fue ajustado mediante espectrometría en PBS estéril. La dosis de desafío por ave fue de 1 x 10⁸ unidades formadoras de colonia (UFC) contenidas en 250 uL. El desafío se efectuó per os. En cada desafío el grupo testigo negativo recibió únicamente PBS estéril per os.

Probiótico comercial de exclusión competitiva definido (PECD)******

Este probiótico es una mezcla de bacterias anaerobias facultativas y obligadas. Para su elaboración se obtuvieron 32 diferentes cultivos puros a partir de MNI proveniente de aves adultas libres de patógenos específicos (LPE), estos cultivos ya se han caracterizado. Los aislamientos incluyen 22 tipos de bacilos aerobios y cocos que representan cinco géneros, y diez tipos de bacilos anaerobios y cocos que representan tres géneros. Algunas bacterias que lo componen son Enterococcus spp, Bacteroides spp, Bacillus spp, Lactobacillus spp, Eubacterium spp, Escherichia spp, Propionobacterium spp, y cocos anaerobios grampositivos.³⁸ El probiótico está libre de cualquier organismo formador de esporas, tiene una cuenta bacteriana de 1 x 10¹⁰ bacterias por gramo de polvo liofilizado. Se administró 1 mg/ave del PECD al día uno de edad a través de una sonda directa en ingluvies; cuando fue necesario se redosificó en el agua de bebida de acuerdo con la recomendación del fabricante para dosis única (1 mg/ave/día).

Producto comercial de exclusión competitiva no definido (PECND)*******

Está compuesto de MNI proveniente de aves LPE. El fabricante menciona que esta microbiota se encuentra integrada por microorganismos de los géneros Bacteroides spp, Citrobacter spp, Clostridium spp, Escherichia spp, Enterococcus spp, Eubacterium spp, Lactobacillus spp, Propionibacterium spp, Ruminococcus spp, Streptococcus spp, y otros aún no identificados.³⁹ A cada una de las aves del grupo de tratamiento correspondiente al PECND se les administró 12.5 mg del producto de exclusión competitiva per os.

Se asignaron 480 aves en cuatro grupos de 120 pollos con tres réplicas cada uno, las aves fueron desafiadas en dos diferentes fechas. Se diseñó el siguiente arreglo que únicamente contempló el análisis de un factor (tipo de probiótico: definido o indefinido). Grupo A (testigo negativo), al día uno de edad a las aves de este grupo se les administró únicamente PBS estéril, no recibieron ningún tipo de desafío; tres réplicas se sacrificaron a los 12 días de edad y otras tres réplicas al día 20 de edad. Grupo B, al día uno de edad a las aves se les administró el PECD per os; tres réplicas se desafiaron con SE PT13^A a los 11 días de edad y otras tres réplicas al día 19 de edad. Grupo C, al día uno de edad a las aves se les administró el PECND per os, tres réplicas se desafiaron con SE PT13^A a los 11 días de edad y otras tres réplicas al día 19 de edad. Grupo D (testigo positivo), al día de edad únicamente se les administró PBS estéril per os, tres réplicas se desafiaron con SE PT13^A a los 11 días de edad y otras tres réplicas al día 19 de edad.

Efecto del probiótico definido sobre la infección con Salmonella spp en una prueba efectuada en un corral de piso

Para la evaluación del PECD sobre la transmisión horizontal de SE PT13^A, la variable de respuesta se determinó con 240 aves asignadas en cuatro corrales, 60 pollos por corral, en los cuales había tres grupos de 20 aves cada uno, los cuales se evaluaron en dos fechas diferentes. Para la administración del PECD se diseñó el siguiente arreglo aleatorio, que contempló únicamente el análisis de un factor de acuerdo con lo mencionado por Nava⁴⁰ y Snoeyenbos et al.²⁴ Grupo E, las aves recibieron al día de edad 250 µL de PBS estéril per os, al tercer día de edad se administró per os 250 µL/ave del inoculo (SE PT13^A). Grupo F (testigo negativo), recibió 250 µL de PBS estéril/ave per os día, los días uno y tres de edad, respectivamente; este grupo no se desafió. Grupo G, sólo se le administró el PECD per os al día de edad, al día tres de edad recibieron 250 µL de PBS estéril/ave per os; las aves de este grupo no se desafiaron. Cada una de las réplicas de los tres grupos convivieron sobre la cama de un mismo corral, comieron y bebieron de la misma fuente durante el periodo anterior a la eutanasia, por lo cual en cada corral de 1.5 m² hubo 20 aves del Grupo E, 20 aves del Grupo F y 20 aves del Grupo G. Dos réplicas se sacrificaron diez días después del desafío y otras dos réplicas, doce días después del mismo.

Efecto de la dosificación del probiótico definido sobre la infección con Salmonella spp en una prueba efectuada en jaulas colocadas en batería

Se asignaron 252 aves en tres grupos de tratamiento de 28 pollos cada uno en tres fechas de evaluación (total = 9 grupos), cada grupo se alojó aleatoriamente en diferentes niveles de las jaulas colocadas en dos baterías eléctricas.******** Para la asignación de la variable explicativa (una sola dosis de probiótico o su redosificación hasta por tres ocasiones) se diseñó el siguiente arreglo: Grupo H, al día uno de edad las aves recibieron el PECD per os, las aves se desafiaron con SE PT13^A a los siete, 13 y 23 días de edad. Grupo I, se le administró el PECD al día de edad per os, a este grupo se le reforzó el tratamiento con el probiótico comercial por agua de bebida a los seis, 12 y 22 días de edad.

Las aves de este grupo se desafiaron con SE PT13^A 24 horas después de haber recibido el PECD como parte del esquema de refuerzo. Grupo J, al día uno de edad se le administró únicamente PBS estéril per os, las aves de este grupo se desafiaron con SE PT13^A los días siete, 13 y 23 de edad, respectivamente.

Veinticuatro horas después del desafío con SE PT13^A, a las aves procedentes de cada grupo se les aplicó la eutanasia de acuerdo con lo indicado para este fin por la Asociación Estadounidense de Medicina Veterinaria.⁴¹ A partir de cada ave se obtuvieron de manera aséptica muestras combinadas de hígado–bazo y tonsilas cecales, las cuales se sembraron en 10 mL de CT cada una.^21,40 Las muestras se incubaron durante 24 horas a 37°C. Después de la incubación el caldo se sembró en cajas de AGV con AN/NO. Se incubaron durante 24 horas a 37°C; posteriormente, las cajas se examinaron en busca de colonias lactosa negativas sugerentes de SE PT13^A resistente a NO y AN. De las colonias lactosa negativas se seleccionó 10% de las muestras, se refrigeraron y en un periodo menor a siete días se realizó su identificación bioquímica y serotipificación.³

Análisis estadístico

El porcentaje de aves positivas a SE PT13^A se evaluó a través de la prueba de Ji–cuadrada con un grado de 5% de significancia estadística para alfa.⁴²

Resultados

Invasión y colonización de Salmonella spp en aves tratadas con probiótico de exclusión competitiva definido y no definido

El Cuadro 1 muestra que al día 12 de edad no se registra inhibición de la invasión por SE PT13^A a hígado–bazo o tonsilas cecales por parte de cualquiera de los dos probióticos. Al día 20, el grupo con PECD mostró mayor inhibición (P < 0.05) en la invasión a hígado–bazo por SE PT13^A que la mostrada por el testigo positivo. El grupo del PECND no fue diferente a los otros dos grupos desafiados. No hubo diferencia entre grupos en los aislamientos de SE PT13^A a partir de tonsilas cecales. Los grupos testigos negativos no presentaron crecimiento de Salmonella spp.

En el Cuadro 2 se observa que al día 13 de edad, SE PT13^A invadió hasta 75% de hígado–bazo en el grupo semilla, proporción mayor (P < 0.05) al 27.5% observado en el testigo negativo; el grupo con PECD mostró una invasión de sólo 7.5%, diferente (P < 0.05) a la observada en los otros dos grupos. La tasa de colonización de SE PT13^A en tonsilas cecales del grupo semilla fue completa (100%); sin embargo, no fue diferente al 57.5% de colonización observada en el testigo negativo, aunque sí difirió (P < 0.05) del grupo con PECD (25%), que a su vez fue menor y diferente (P < 0.05) del testigo negativo. El Cuadro 2 muestra que al día 15 de edad la invasión de SE PT13^A a hígado–bazo en el grupo semilla fue de 57.5%, proporción mayor (P < 0.05) al 10% observado en el grupo testigo negativo y al 12.5% del grupo complementado con el probiótico definido; estos dos últimos grupos no fueron diferentes entre sí. En el Cuadro 2 se ve que SE PT13^A colonizó 87.5% de tonsilas cecales del grupo semilla, lo cual fue significativamente mayor (P < 0.05) al 27.5% que se registró en el grupo testigo negativo y al 42.5% del grupo con el PECD; estos dos grupos no difirieron entre sí.

Invasión y colonización de Salmonella spp en aves tratadas con diferentes dosis del probiótico definido

En el Cuadro 3 se observa que al día ocho de edad no hubo diferencias entre grupos en el porcentaje de aislamientos de SE PT13^A a partir de hígado–bazo o tonsilas cecales. Al día 14 de edad en el grupo testigo positivo se aisló 34.6% de SE PT13^A a partir de hígado–bazo y 96.1 % a partir de tonsilas cecales; proporciones significativamente mayores (P < 0.05) al grupo que inicialmente recibió al día uno de edad el PECD y que posteriormente recibió dos dosis de refuerzo (a los seis y 12 días de edad); este grupo mostró la menor tasa de invasión y colonización de SE PT13^A (4.5% en hígado–bazo y 22.7% en tonsilas cecales). El grupo que recibió una sola dosis de PECD presentó 17.2% de invasión a hígado–bazo y 62.0% de colonización en tonsilas cecales, éste no fue diferente a los otros dos grupos. Al día 24 de edad no hubo diferencia entre los grupos en la proporción de aislamientos de SE PT13^A a partir de cualquiera de los órganos evaluados (Cuadro 3).

Prueba de inocuidad y serotipificación de las muestras positivas a Salmonella spp

Las muestras de la prueba de inocuidad bacteriológica resultaron negativas al aislamiento de Salmonella spp. Las colonias sospechosas que crecieron en AVB fueron identificadas mediante pruebas bioquímicas; se determinó que 100% correspondía a Salmonella spp móvil. En la serotipificación a partir de las mismas muestras, se determinó que éstas correspondieron a Salmonella enterica serovariedad Enteritidis (grupo D1; O:1,9,12; H:g,m).

Discusión

En el presente estudio el grupo que recibió PECD mostró al día 13 de edad disminución en la invasión de SE PT13^A a tonsilas cecales, esa tendencia se observó con la concomitante traslocación bacteriana y aislamientos positivos en hígado y bazo; sin embargo, no hubo diferencia estadística con el grupo testigo. en este contexto, Schneitz et al.,³⁸ al administrar el PECD en aves de un día de edad, observaron protección desde el día siete de edad; aunque las aves de este estudio mostraron mayor cantidad de SI con respecto a la observada en su evaluación posterior al día 19, Schneitz et al.³⁸ sí observaron diferencia significativa entre PECD y el grupo testigo.

Se ha mencionado que los probióticos indefinidos disminuyen también la infección contra Salmonella; sin embargo, en el presente estudio el PECND no fue capaz de disminuir la colonización de Salmonella en la misma proporción que lo hizo el probiótico definido; aun cuando Orencia et al.,⁴³ por ejemplo, mencionan que el PECD fue poco eficaz en la exclusión de Salmonella spp cuando lo compararon con el mismo probiótico no definido utilizado aquí.

Asimismo, observaron que las aves del grupo con PECND presentaron menor cantidad de Salmonella (0.48 log1 0 UFC/g de contenido cecal) después del desafío con 3 x 10⁴ UFC/ave de SE que lo observado en las aves del grupo con PECD (5.73 log₁₀ UFC/g de contenido cecal), mientras que el testigo positivo presentó 7.44 log₁₀ UFC de SE/g en contenido cecal. En la evaluación proporcional similar a la efectuada en el presente estudio, Orencia et al.⁴³ observaron que si bien los dos probióticos ejercen una reducción en el número de aves infectadas por Salmonella (PECND 30.0%; PECD 26.7%) ésta no fue diferente a la del testigo positivo (36.7%). De acuerdo con lo anterior, los resultados de Orencia et al.⁴³ son similares a los encontrados en la fecha análoga al primer experimento del presente estudio; además, se debe considerar que estos autores efectuaron su evaluación a los nueve días de edad, mientras que en el presente estudio la evaluación se efectúo tres días después, fecha en que la proporción de aves positivas a Salmonella en hígado–bazo mostró una tendencia de mejor exclusión con el PECND; sin embargo, esta tendencia no se constató en el número de aves positivas a Salmonella en tonsilas cecales, la cual fue similar al grupo complementado con PECD. Esta diferencia se pudo deber a la metodología usada, ya que en el presente modelo los cultivos bacterianos enriquecidos con caldo tetrationato yodado pueden potenciar la detección de muy pequeñas cantidades de UFC de Salmonella, mientras que la cuantificación de UFC por gramo de contenido cecal se encuentra condicionada a factores de mayor incertidumbre al tratar de cuantificar la cantidad exacta de UFC, además de ser más complicada, menos sensible y evaluar de manera epizootiológica sólo individuos y no poblaciones, de manera que es cuantitativamente menos apropiada.^36,39,40,44Un factor adicional que puede explicar esta diferencia es que la cuantificación del crecimiento bacteriano de Salmonella en el presente estudio se efectúa en la fase logarítmica de mayor crecimiento bacteriano, lo cual favorece la especificidad y sensibilidad de la prueba.^40,44

Aunque el PECND mostró tendencia de protección a los 12 días de edad, nunca fue diferente al testigo positivo. Esta aparente baja efectividad para excluir Salmonella por parte de este probiótico posiblemente se debió a un inadecuado establecimiento de su microbiota en los sacos ciegos, aun cuando Nurmi y Rantala²⁹ mencionan una resistencia adecuada a la infección por SI en pollitos de engorda de un día de edad, tan sólo 24 horas después de la administración de MNI proveniente de aves adultas. Asimismo, determinaron que aun cuando algunos pollitos mostraron infección después del desafío oral, la cantidad de SI en el ciego fue de 1 x 10² a 1 x 10³ UFC por gramo de contenido cecal en lugar de 1 x 10⁶ a 1 x 10⁹ UFC que se observaron en las aves que no recibieron la microbiota proveniente de las aves adultas.

En el presente estudio se mostró una tendencia similar, ya que la cantidad de aislamientos a partir de tonsilas cecales fue menor en los grupos que recibieron los dos tipos de probióticos a diferencia del testigo positivo que mostró mayor cantidad de aislamientos, lo cual indica que los probióticos muestran tendencia a disminuir la colonización por Salmonella en esta parte del tracto intestinal, así como un relevante proceso de exclusión. Una diferencia del presente estudio en relación con el trabajo de Nurmi y Rantala,²⁹ Schneitz y Hakkinen⁴⁵ y Orencia et al.,⁴³ fue que en las evaluaciones de los días 12 y 20 se determinó el número de aves positivas a Salmonella y no la cantidad de UFC en el contenido de sacos ciegos.

Nakamura et al.,³⁹ al administrar PECND a pollos de un día de edad y desafiarlos seis horas después (7.5 x 10⁶ UFC/ave de Salmonella), determinaron que aun cuando no lograba reducir por completo la eliminación de Salmonella en heces, sí hubo diferencia (P < 0.05) con respecto al testigo positivo, aunque esta diferencia la pudieron observar hasta 14 días después de administrado el probiótico, dos días después de la primera evaluación del presente estudio.

La diferencia entre lo observado por Nakamura et al.³⁹ y el presente estudio posiblemente se debió a detalles metodológicos (especie de Salmonella y UFC usadas en el desafío). Dichos autores realizaron la determinación de Salmonella a partir de hisopos cloacales, mientras que la determinación realizada aquí se hizo a través de la recuperación directa de Salmonella en órganos internos y tonsilas cecales, metodología que junto con el método de enriquecimiento muestra un gran potencial para la detección del crecimiento exponencial de una pequeña cantidad de UFC.^36,39,40 Adicionalmente, Nakamura et al.39 recuperaron Salmonella de órganos internos al día 22 de edad; sin embargo, no observaron diferencias en el contenido de Salmonella entre el grupo tratado con PECND y el testigo positivo. Estos resultados coinciden con los hallazgos del presente estudio; el PECND logró una ligera disminución en la colonización de los órganos internos por parte de SE; sin embargo, no fue diferente al testigo positivo, mientras que con el PECD sí hubo diferencia.

El probiótico no definido muestra la misma tasa de invasión a órganos internos en las dos fechas evaluadas, en tanto que el definido presenta un aumento gradual de protección, lo que se debió posiblemente a un progresivo establecimiento de su microbiota, aunque a los 12 días de evaluación no hubo diferencia estadística respecto del testigo positivo, al día 20 de edad sí la hubo, lo cual coincide con lo observado por Barnes et al.,²⁵ quienes determinaron que el establecimiento completo de la microbiota ocurre entre las tres y seis semanas de vida del ave; de acuerdo con lo anterior, estos últimos determinaron que el establecimiento de la microbiota puede variar según las condiciones de higiene, tipo de crianza y alimentación.

Otra razón de la diferencia en la efectividad de los probióticos evaluados es su composición, aunque en el PECD ésta se conoce al estar predeterminada, en el PECND puede variar en cantidad y tipo de microorganismo presente. Diversas investigaciones han documentado el papel que muestran diferentes tipos de Lactobacillus sobre su efectividad en la exclusión de patógenos entéricos, un solo tipo de Lactobacillus puede mostrar diferentes capacidades de adherencia, sobrevivencia o efectividad en el grado de exclusión que induce,^{16,17,23,26,32,33} por lo cual es factible que cada uno de los probióticos evaluados al contener diferentes microorganismos dentro de su composición propicien la interacción de éstos con la microbiota de las aves evaluadas y resulte diferente ensayo tras ensayo. Esta interacción se ha estudiado poco y posiblemente contribuye a explicar el grado de efectividad en la exclusión de Salmonella por los probióticos, adicionalmente algunos investigadores han indicado que menos del 40% de la microbiota de las aves domésticas se ha cultivado e identificado satisfactoriamente.^12,13,16,27

El probiótico definido coloniza el ciego de las aves e inhibe la colonización por Salmonella; de acuerdo con el fabricante, las bacterias del producto fueron seleccionadas con base en su capacidad de adhesión al epitelio cecal, por lo cual es previsible que su acción principal ocurra en este sitio y que los efectos de exclusión referidos por diferentes investigadores ocurran también a este nivel,^15,16,29 lo cual provoca una situación indirectamente observada en el presente estudio al determinar la diferencia entre el total de aves infectadas por Salmonella a nivel de órganos internos (bazo e hígado) con respecto a las mismas aves positivas a Salmonella en tonsilas cecales.

De forma general, cuando hubo mayor número de aves con aislamientos de Salmonella en tonsilas cecales proporcionalmente se observó mayor cantidad de aves infectadas en órganos internos (hígado–bazo) , a diferencia de cuando existió menor cantidad de aves positivas en tonsilas cecales con menor cantidad de aves infectadas con Salmonella en órganos internos.^21,40,46,47Lo anterior muestra la relevancia del uso de los probióticos en la avicultura comercial; sin embargo, de acuerdo con los resultados del presente estudio, los probióticos comerciales no siempre son iguales, aunque existen diferentes autores que mencionan un alto grado de protección por parte de los probióticos de tipo indefinido,^{9,24,31,39,43} su uso representa un riesgo, ya que los microorganismos que lo integran no están completamente caracterizados y pueden dar origen a un problema infeccioso, además la variabilidad de sus resultados es alta, posiblemente debido a la composición heterogénea de la microbiota que contienen.

Al comparar un probiótico definido con otro indefinido, algunos investigadores proporcionan resultados distintos, por lo cual en lo futuro se debe plantear una metodología estandarizada capaz de evaluar bajo las mismas premisas cada uno de los probióticos utilizados.⁹

La dosificación que contempló el reforzamiento con PECD por tres ocasiones mostró exclusión significativa de Salmonella después de la segunda semana de evaluación, ésta mejora posiblemente se debió a la acción eficiente de bacterias de tipo acido–lácticas que favorecen la subsiguiente colonización de bacterias de este mismo tipo y que promueven condiciones restrictivas para el crecimiento de otro tipo de bacterias al modificar el ambiente intestinal, limitar nutrimentos o al ocupar receptores bacterianos en intestino, que representan mecanismos documentados por diferentes autores.^{9,12,13,15–17}

La exclusión significativa observada en la segunda semana posiblemente se debió a que la microbiota se estableció rápidamente, lo cual se contrapone a lo indicado por Barnes et al.²⁵ y Nurmi y Rantala,²⁹ quienes mencionan que la colonización de la microbiota es lenta y llega a tardar hasta cuatro o seis semanas después de la eclosión. Sin embargo, hay que tomar en cuenta que aunque el fabricante del probiótico recomienda una sola aplicación al día de edad, bajo el esquema de dosificación del presente estudio el efecto protector se logró desde la segunda semana de edad, aunque para lograr este efecto se requirió de al menos tres aplicaciones del producto.

Al evaluar un probiótico que contenía Lactobacillus acidophilus y Streptococcus faecium, administrado por aspersión junto con anticuerpos específicos contra SE, ST y S. heidelberg al día de edad, dosificados en el agua de bebida durante los primeros cinco días y después dos tomas adicionales a los días diez y 14 de edad, Téllez et al.⁴⁷ observaron protección contra Salmonella desde el día uno de edad, que se conservó hasta el procesamiento de las aves (42 días); al reforzar el tratamiento en el agua de bebida, los autores lograron reducir hasta 2 Log₁₀ de Salmonella en sacos ciegos con respecto del grupo testigo, el cual a lo largo del estudio mostró mayor cantidad de Salmonella en el tracto gastrointestinal. Aun cuando estos investigadores no incluyeron un grupo testigo con una sola dosis del probiótico al día de edad, en el tratamiento con reforzamiento del probiótico en agua de bebida obtuvieron resultados similares a los del grupo de redosificación del presente estudio. Con base en los hallazgos del presente estudio y en el tiempo requerido para el establecimiento de la microbiota del probiótico, se recomienda que la administración de éstos se efectúe desde el primer día de edad, ya que Nurmi y Rantala²⁹ han probado que Salmonella puede infectar a las aves desde las primeras 24 horas de vida. En investigaciones recientes se ha observado que el embrión posee una microbiota al momento de la eclosión, la cual se cree que es adquirida a través de los poros del cascarón durante el último tercio del proceso de incubación.

En contraposición a los resultados del presente estudio, Schneitz y Hakkinen⁴⁵ no observaron diferencia en la protección contra SI entre dos tratamientos similares a los empleados aquí, su primer tratamiento consistió en aplicar una sola vez un probiótico definido análogo al del presente estudio; el segundo lo administraron cinco veces en las mismas aves durante un periodo de dos semanas con intervalos de dos a tres días de aplicación y observaron que los dos tratamientos funcionaron de manera similar al disminuir la cantidad de aves positivas a Salmonella, mientras que en el presente estudio el que mejor funcionó recibió la dosis de refuerzo. Estas diferencias posiblemente se debieron a la variación dinámica presentada por la microbiota del probiótico durante su periodo de establecimiento, o a su grado de viabilidad (caducidad), variables que actualmente no se encuentran completamente estudiadas.

En los aislamientos de hígado–bazo y tonsilas cecales efectuados día los días ocho y 24 de edad, el grupo testigo positivo no fue diferente a los grupos tratados con PECD, lo cual pudo estar ligado al efecto de la gran cantidad de Salmonella utilizada en el inóculo (1 x 10⁸ UFC/ave), ya que al compararla con las dosis empleadas para la recreación del peor escenario de infección en campo propuesto por Schneitz y Hakkinen⁴⁵ (6.0 x 10⁷ UFC/ave) y por Priyankarage et al.³⁰ (2.0 x 10⁶ UFC/ ave), por alguna razón sin determinar, el PECD no ejerció la exclusión esperada en las fechas evaluadas; en lo futuro debe considerarse una metodología de titulación del inoculo previa al desafío con la finalidad de determinar el grado óptimo de infección a diferentes niveles probabilísticos de desafío de campo.

En la prueba de protección en piso, la administración del PECD en aves de un día de edad logró disminuir de forma indirecta la infección por Salmonella en el grupo testigo no tratado, en comparación con el grupo semilla inoculado con Salmonella al día tres de edad, lo cual sugiere que la microbiota contenida en el probiótico definido mostró rápida transmisión horizontal, ya que la inoculación con Salmonella en el grupo semilla se efectúo al día tres de edad; en este contexto, la microbiota pudo haber colonizado el intestino de las aves no tratadas con el probiótico antes de que éstas fueran infectadas por la Salmonella proveniente del grupo semilla. Sin embargo, al no contar con un grupo testigo negativo que hubiera estado bajo condiciones de aislamiento total sin convivir los tres primeros días antes del desafío con el grupo semilla, con la metodología empleada aquí, no se puede comprobar fehacientemente este planteamiento.⁴⁰

Al comparar el grado de infección en los grupos semilla, testigo y con PECD, éste presentó menor número de aves infectadas con Salmonella, lo cual coincide con los resultados de Nava⁴⁰ y Snoeyenbos et al.²⁴ Es factible que se haya transmitido cierta cantidad de microbiota a partir del grupo con PECD, ya que de acuerdo con lo propuesto por Snoeyenbos et al.²⁴ y Nava,⁴⁰ este grupo recibió el probiótico tres días antes de inocular la Salmonella al grupo semilla; la disminución en aislamientos efectuados a los 13 días de edad a partir de hígado–bazo del grupo testigo, posiblemente fue menor con respecto a los del grupo semilla, debido a esta transmisión temprana de microbiota, lo cual, aunque es factible, no es posible verificarlo. Otra posibilidad es que la Salmonella del grupo semilla no se transmitió adecuadamente durante el periodo de evaluación (diez y 12 días), ello indica que la patogenicidad de la cepa empleada (SE PT13^A) fue diferente a la utilizada por Nava.⁴⁰ Una manera de corroborar si la microbiota se transmite al grupo testigo sería efectuar un análisis de discriminación utilizando como marcador la 16S de ARNr específico de las poblaciones microbianas que invaden a nivel cecal a este grupo antes de su contacto con el grupo semilla,^26,27 o bien verificar la cantidad de UFC de Salmonella presente en heces día tras día después de la inoculación del grupo semilla.

Aun cuando a los 13 días de edad los aislamientos de Salmonella de tonsilas cecales en el grupo con el probiótico definido fueron diferentes a los grupos semilla y testigo, respectivamente, dos días después los aislamientos en hígado–bazo y tonsilas cecales fueron únicamente diferentes en relación con el grupo semilla. Es posible que cierta cantidad del probiótico se haya transferido al grupo semilla en esos tres días previos a su inoculación; es factible también que este último grupo a esa edad, haya mostrado cierto grado de protección debida a resistencia inespecífica, lo cual probablemente de acuerdo con lo estudiado por Duchet–Suchaux et al.³⁷ se relaciona con el factor genético intrínseco de la estirpe.

El grado de invasión (hígado–bazo) y colonización (tonsilas cecales) por Salmonella en el grupo semilla a los 15 días de edad, es proporcionalmente menor que en la evaluación efectuada dos días antes, aun cuando el inóculo de Salmonella fue el mismo, lo cual posiblemente se debió a que las aves excluyen a la Salmonella en mayor cantidad conforme van madurando tanto fisiológica como inmunológicamente.^9,28,35,38 Aunque los grupos testigo y probiótico no son diferentes entre sí, muestran mayor número de aves positivas a Salmonella que las observadas al día 13 de edad; sin embargo, aunque el PECD fue diferente al grupo semilla, a los 15 días de edad mostró mayor porcentaje de aves positivas que las observadas en el grupo testigo, específicamente a nivel de tonsilas cecales, lo cual indica que el probiótico no protegió tan adecuadamente como lo hizo dos días antes, o bien en estas réplicas hubo pérdida de microbiota o ineficiente establecimiento del PECD desde el día uno de edad.

Snoeyenbos et al.²⁴ mostraron que los grupos tratados con probióticos protegieron a las aves desde los 12 días de edad, después de crecer desde el primer día de edad sobre cama contaminada con SI, en contraste con las aves que no recibieron probióticos y que convivieron en el mismo corral experimental. Si bien en el presente estudio la cantidad de Salmonella en el grupo que no recibió el probiótico, disminuyó a la par del grupo que sí la recibió, el mecanismo por medio del cual esta infección se reduce aún no se encuentra bien esclarecido. Es posible inferir que la microbiota contenida en el PECD se pudo haber transmitido horizontalmente en un corto periodo, en cantidades que aunque mínimas fueron capaces de disminuir la invasión a órganos internos por Salmonella.^{24,25,35,36,40} La exclusión competitiva promovida por los probióticos es un elemento más de control contra la colonización por patógenos entéricos en las aves comerciales; la redosificación con un probiótico es mejor que una sola dosis y si los probióticos se administran a tiempo disminuyen la transmisión horizontal por Salmonella.

Agradecimientos

Se agradece al Programa de Becas para la Elaboración de Tesis de Licenciatura (PROBETEL), de la Universidad Nacional Autónoma de México, el apoyo otorgado a Lourdes González Soto durante la elaboración del presente estudio. Los autores agradecen al Ing. Alejandro Romero Martínez del Sobral, Director General del grupo Investigación, Desarrollo Integral y Salud Animal, así como al Dr. José Luis Avilés Galván, Director Avícola de Incubadora Mexicana, S. A. de C. V., el valioso apoyo en la donación de las aves utilizadas en el presente estudio. Un agradecimiento especial al Dr. Carlos G. Gutiérrez Aguilar, por su invaluable asesoría en la escritura y conformación del presente manuscrito.

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Notas

** Sigma–Aldrich®, Estados Unidos de América.

*** Sigma–Aldrich®, Estados Unidos de América.

**** Sigma–Aldrich®, Estados Unidos de América.

† Sigma–Aldrich®, Estados Unidos de América.

‡ Difco®, Ann Arbor, Detroit, M. Estados Unidos de América.

° Difco®, Ann Arbor, Detroit, M. Estados Unidos de América.

***** Petersime, Estados Unidos de América.

****** Broilact® Orion Pharma Animal Health, Helsinki, Finlandia.

******* Aviguard® Microbiol Developments Ltd., Worcestershire, Inglaterra.