Distribución de fracciones de proteína y su contribución a las características de calidad de trigo

Protein fraction distribution and their contribution to quality characteristics in wheat

Nayelli Hernández Espinosa¹, Gabriel Posadas Romano¹, Fausto Cervantes López¹, Héctor I. González Santoyo¹, Amalio Santacruz Varela², Ignacio Benítez Riquelme² y Roberto J. Peña Bautista^1*

¹ Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo. km 45 carr. México-Veracruz. El Batan. 56130, Texcoco, Edo. de México. Tel (595) 9521900 ext. 1244 ó 2236. *Autor para correspondencia (j.pena@cgiar.org)

Recibido: 25 de Mayo del 2011
Aceptado: 4 de Marzo del 2013

Resumen

Las características visco-elásticas del gluten del trigo (Triticum aestivum L.) están definidas por la composición de las gliadinas, las gluteninas de alto (G-APM) y bajo (G-BPM) peso molecular y por la distribución de sus principales fracciones, la monomérica (rica en gliadina, PM), la polimérica soluble (rica en glutenina soluble, PPS) y la polimérica insoluble (rica en glutenina insoluble, PPI). Con el objetivo de examinar la relación e influencia de estas fracciones sobre las características reológicas de calidad de procesamiento, se evaluaron 117 líneas de trigo procedentes de seis poblaciones contrastantes en calidad, cultivadas bajo riego en Sonora, México (ciclo 2005-2006). La variedad 'Avocet' fue el progenitor materno común en cada una de las seis poblaciones. Se consideraron dos variantes en la composición de gluteninas en los loci Glu-A1, Glu-B1, Glu-D1, y tres en el locus Glu-B3. Las medias generales de las proporciones de las tres fracciones fueron de 42 %, 20.4 % y 37.5 % para PM, PPS y PPI, respectivamente. La distribución de fracciones fue distinta entre las seis poblaciones. El análisis estadístico mostró valores de predicción mayores a 30 % de las fracciones proteicas y del contenido de proteína, para estimar variables de calidad del mixógrafo, de fuerza de masa, y de fuerza del gluten medida con el alveógrafo. La magnitud del efecto de las fracciones sobre las características de calidad varió entre las poblaciones de trigo evaluadas. La fracción PM mostró correlaciones significativas con características de extensibilidad de la masa (Sedim-SDS; AlvP/L), mientras que la fracción PPI correlacionó con las variables de fuerza de gluten (MIXTD, %Tq/min y AlvW). La determinación de la distribución de fracciones proteicas, de la composición de G-APM y G-BPM, aunada a pruebas de elaboración rápida en laboratorio (proteína y Sedim-SDS), constituyen una importante herramienta para selección por calidad en el fitomejoramiento del trigo.

Palabras clave: Triticum aestivum, trigo harinero, proteínas monoméricas, proteínas poliméricas, propiedades visco-elásticas.

Abstract

Key words: Triticum aestivum, bread wheat, monomeric proteins, polymeric proteins, visco-elastic properties.

INTRODUCCIÓN

En trigo (Triticum aestivum L.) las proteínas de reserva comprenden de 80 a 85 % del total de proteínas presentes en el grano (Pomeranz, 1978). Estas proteínas de reserva ya hidratadas y orientadas forman una red insoluble llamada gluten (Weegels, 1996). Las propiedades visco-elásticas del gluten dependen de factores como el genotipo (composición de gliadinas y gluteninas controlados por el complejo loci Gli-Glu) y la distribución de las principales fracciones de proteínas de gluten (gliadinas y gluteninas). Las gliadinas, también conocidas como proteínas monoméricas por sus agregados simples de polipéptidos, son proteínas de reserva presentes en el endospermo, se componen de las sub-unidades α, β, γ y ω -gliadinas, y se caracterizan por su solubilidad en alcohol a diferentes concentraciones (Shewry et al., 2002). Estas fracciones de proteínas están asociadas con la viscosidad de las masas (Sapirstein y Fu, 1998; Uthayakumaran et al., 1999; Suchy et al., 2007).

Las gluteninas son proteínas poliméricas también presentes en el endospermo, y están formadas por dos principales grupos de cadenas polipeptídicas llamadas subunidades de alto (APM) y bajo peso molecular (BPM), las cuales se mantienen unidas por puentes disulfuro. Estas proteínas se relacionan con el tiempo de desarrollo de la masa en el mixógrafo, la estabilidad en el farinógrafo y con el volumen de pan (Gupta et al., 1992; Uthayakumaran et al., 1999; Suchy et al., 2007).

Se han desarrollado diversos protocolos que separan y cuantifican la concentración de las principales fracciones de proteína y ayudan a esclarecer su relación con parámetros específicos de calidad (Bean et al., 1998; Figueroa et al., 2009). Destacan tres protocolos que logran una mejor separación con métodos más simples (solubilidad). Sapirstein y Fu (1998) lograron aislar dos fracciones, una rica en proteínas monoméricas y otra rica en proteínas poliméricas, estas últimas divididas en gluteninas solubles e insolubles en alcohol. DuPont et al. (2005) publicaron un método más específico que logra separar a las proteínas monoméricas en una fracción rica en gliadina y otra en albuminas/globulinas. Suchy et al. (2007) separaron gluteninas monoméricas y poliméricas, y demostraron que es posible cuantificar las proporciones de proteína por espectrofotometría.

El estudio de las proteínas presentes en el grano de trigo así como de las diferentes interacciones con ellas (por efecto de cruzamiento, del ambiente o de una combinación de alelos), contribuye parcialmente a definir las características visco-elásticas y la calidad de panificación del trigo. Son escasos los estudios realizados sobre el comportamiento de las variaciones alélicas dentro del genoma del trigo para las fracciones de proteína. De la O et al. (2010) reportaron que el genotipo y el ambiente tienen efecto sobre las fracciones de glutenina y gliadina, y su contribución parcial en las características de calidad en trigo.

Es necesario, por tanto, investigar otros factores que permitan entender mejor el comportamiento complejo de la calidad industrial del trigo. Por ello, el presente trabajo tuvo como objetivo determinar la composición de subunidades de glutenina y la distribución de las fracciones ricas en gliadina (proteínas monoméricas, PM), en glutenina soluble (proteína polimérica soluble, PPS) y en glutenina insoluble (proteína polimérica insoluble, PPI), para valorar la posible influencia de estas fracciones sobre parámetros específicos de calidad, en líneas recombinantes de trigo.

Material vegetal

Las seis poblaciones recombinantes de trigo evaluadas tuvieron a la variedad 'Avocet' como progenitor materno común, la cual fue cruzada con las líneas experimentales Attila', 'Pastor', Amadina', 'Parula', 'Tonichi' y 'Pavón. La progenie de cada población se derivó por descendencia de una sola semilla hasta F₆, cultivada bajo condiciones de riego en Cd. Obregón, Sonora, donde la última generación se cosechó en el ciclo otoño-invierno 2005-2006. Los materiales utilizados en el estudio fueron sembrados por duplicado, y cada unidad experimental consistió de un surco doble de 2 m con 0.75 cm de espacio en cada surco doble. Para el manejo agronómico se aplicó fungicida y nitrógeno sin limitaciones.

'Avocet' destaca por su resistencia a la roya amarilla causada por el hongo Puccinia striiformis; las seis líneas experimentales son variedades de alto potencial de rendimiento pero contrastantes en calidad, vigentes en el programa de fitomejoramiento del Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT).

De estas cruzas resultaron 400 líneas, de las cuales sólo se evaluaron las 117 líneas que fueron contrastantes en composición alélica, con las siguientes variantes: loci Glu-A1 (0, 2*), Glu-B1 (7+8, 17+18), Glu-D1 (2+12, 5+10) y Glu-B3 (b, h, g). Todas las líneas mostraron en común las gluteninas Glu-A3c y Glu-D3b. Esta selección de líneas respondió a la necesidad de controlar la disparidad genotípica propia de la población y de poder analizar el efecto de cada alelo sobre las fracciones proteínicas analizadas.

Evaluación de la calidad y determinación alélica

Los análisis se realizaron en el Laboratorio de Química y Calidad de Cereales del CIMMYT, por duplicado. Muestras de 500 g de grano, previamente acondicionadas a niveles de humedad entre 14 y 16 %, de acuerdo con la dureza de grano, fueron molidas en un molino Brabender Quadrumat Jr.® (C. W. Brabender OHG, Germany), para obtener harina refinada en la cual se midieron las variables de calidad.

La dureza (DURGRN) y la humedad del grano fueron estimados por espectroscopía de reflectancia en el espectro infrarrojo cercano (NIRS, por sus siglas en inglés; NIRSystems 6500™, FOSS Dinamarca), conforme al método oficial AACC 39-70A (AACC, 2000). El contenido de proteína en harina (PROTREF) se estimó con espectrofotometría NIRS en el equipo INFRATEC® 1255 (FOSS-TECATOR, Dinamarca). Para el volumen de sedimentación (Sedim-SDS) se usó 1 g de harina refinada, con la metodología descrita por Peña et al. (1990).

Las propiedades de desarrollo de masa se determinaron con el mixógrafo de Swanson® (National Mfg., USA) mediante el método oficial 54-40A (AACC, 2000), en 35 g de harina refinada. Del mixograma se obtuvieron los datos de: tiempo de desarrollo de la masa (MIXTD), y el torque (Tq) al tiempo de desarrollo expresado en %Tq/min, que se define como el trabajo necesario para mezclar el agua con la harina y lograr una masa con desarrollo óptimo (Walker y Walker, 2001). Adicionalmente, se utilizó el equipo Mixolab® System de Chopin (Trippette & Renaud, Francia) para determinar propiedades de desarrollo de la masa: tiempo de desarrollo (TD-Mxlb), estabilidad al amasado (Est-Mxlb), ambas relacionadas con la calidad de gluten. Se usó un protocolo basado en las recomendaciones del fabricante, pero con modificaciones en la velocidad de desarrollo de masa (200 rpm) y en la temperatura de calentamiento (6° C/min). Las propiedades de fuerza y extensibilidad de la masa se determinaron en el alveógrafo Chopin® (Trippette & Renaud, Francia) con el método 54-30A (AACC, 2000), en una muestra de 60 g de harina refinada; así se determinó tanto la fuerza general del gluten (W x 10^-4 J) como la relación tenacidad/extensibilidad (P/L).

Fraccionamiento y cuantificación de proteínas

Las muestras se procesaron por duplicado mediante extracción secuencial (Figura 1). De cada muestra se utilizaron 10 mg de harina refinada (14 % de humedad, base húmeda) pesados directamente en tubos eppendorf de 2 mL. Las PM (proteínas monoméricas) fueron extraídas con 1.8 mL de una solución que combina 2.3 % NaI/3.75 % 2-propanol, después de centrifugar por 3 min a 16 500 Xg y 25 °C. Para la extracción de PPS (proteína polimérica soluble) se tomó el precipitado del tubo anterior y se le adicionó 1.8 mL de una solución preparada con 2 % SDS/0.75 % Tris/40 % de 2-propanol, y la mezcla se centrifugó a 25 °C por 5min a 16 500 Xg. Por último, se extrajo la fracción de PPI (proteína polimérica insoluble) después de añadir 1.8 mL de 0.2 % DTT (dithiothreitol) /50 % 2-propanol e incubar por 1 h 15 min a 55 °C.

Las muestras fueron incubadas a temperatura, velocidad y tiempo controlado con un incubador Eppendorf Thermomixer® Comfort (Eppendorf-Netheler, Hamburgo, Alemania). Para cuantificar las concentraciones de proteínas, se colocaron 100 μL del sobrenadante en microplacas de 384 pozos para UV (marca CORNING), y la lectura se hizo en espectrofotómetro (Microplate reader BioTek Epoch™) a absorbancia de 280 nm (Suchy et al., 2007), y las lecturas se recuperaron con el programa Gen 5™ (Microplate Data Collection & Analysis Software).

Análisis estadístico

Se calcularon las medias generales y desviaciones estándar de las concentraciones de proteína extraída por familia. Se hizo también una comparación de medias con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05), con el programa estadístico SAS versión 9.0 (SAS Institute, 2002). Los datos fueron transformados de mg a %. Se aplicaron modelos de regresiones simples y múltiples acumulativos para estimar el porcentaje de explicación de las fracciones de proteína extraídas sobre los parámetros de calidad, con el programa estadístico CropStat 7.2.3, programa libre bajo los términos del IRRI (International Rice Research Institute). Mediante correlaciones de Pearson se determinó el grado de asociación entre las fracciones de proteína con las variables de calidad evaluadas, tanto de manera general como individual, de los alelos en los loci Glu-A1, Glu-B1, Glu-D1 y Glu-B3, y a nivel de combinaciones alélicas presentes en las poblaciones analizadas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En el Cuadro 2 se presenta la distribución proporcional de las tres fracciones de proteína, desglosadas por cruza y en forma general. Se obtuvo una media general de 42 % en proteína monomérica (PM), 20.4 % en proteína polimérica soluble (PPS), y 39.1 % en proteína polimérica insoluble (PPI). Estos resultados son similares a los valores de 50, 14 y 35.7 % de PM, PPS y PPI, respectivamente, reportados por Sapirstein y Fu (1998) en trigos canadienses, y a los de DuPont et al. (2005) quienes reportaron 40.2 % en la fracción rica en gliadina, 9.6 % del complejo albúmina/globulina, y 48.0 % de proteínas poliméricas, en líneas de trigos rojos de primavera.

Williams et al. (2008) y De la O et al. (2010) sugirieron que el genotipo y el ambiente son factores que afectan directamente a la expresión de la calidad. En las líneas provenientes de cruzas de una madre común con seis líneas experimentales contrastantes en calidad, se detectaron diferencias (P ≤ 0.05) en las proporciones de las fracciones extraídas; así, las cruzas de 'Avocet' con 'Pavón' y 'Tonichi' tuvieron la mayor proporción de PM, mientras que las cruzas de 'Avocet' con 'Pastor' y 'Amadina' tuvieron la mayor proporción de PPI (Cuadro 2).

En un contexto general, las PM se relacionaron negativamente con las propiedades de fuerza de gluten y extensibilidad de la masa (Cuadro 3); ello indica que a mayor proporción de PM presentes, existiría menor fuerza de gluten y mayor extensibilidad en la masa. También Suchy et al. (2007) encontraron asociaciones negativas significativas de las PM contra seis características de calidad evaluadas en mixógrafo y cuatro en farinógrafo. Por su parte, Hu et al. (2007) reportaron relaciones positivas y significativas entre las PM y la extensibilidad, área de extensión y longitud de extensión, tres variables evaluadas en la elaboración de tallarines.

Mediante análisis de regresión se estimó el porcentaje de explicación atribuible a las fracciones de proteína sobre características de calidad del trigo. La regresión simple mostró que las PM explican 14.0 % del torque (%Tq/min) y las PPI el 20.4 % en volumen de sedimentación (Sedim-SDS) y 27.9 % de fuerza general de gluten (AlvW) (Cuadro 4). Estos resultados muestran una mayor influencia de las PPI que las PM, en la explicación y predicción de la calidad. Sin embargo, el análisis acumulativo destaca la acción combinada de las tres fracciones de proteína al explicar 30.2 %, 35.8 % y 35.1 % de tiempo de desarrollo de la masa (MIXTD), %Tq/ min y AlvW, respectivamente; este tipo de análisis resulta muy útil en la elaboración de modelos matemáticos para la predicción de variables o parámetros reológicos de calidad.

En las líneas evaluadas se encontraron variaciones para los loci Glu-A1, Glu-B1, Glu-D1, Glu-B3 y sus alelos. La prueba de comparación de medias (Cuadro 5) permitió apreciar la relación de cada variante alélica con las fracciones de proteína extraída. Así, en el locus Glu-A1 la subunidad 2* se asoció con mayor proporción de PM que el alelo nulo (0), mientras que este último se asoció con mayor contenido de PPI en comparación con el 2*. Luo et al. (2001) comparó el efecto de las gluteninas de bajo y alto peso molecular en características de calidad de trigo, y encontró que la presencia de 2* en el locus Glu-A1 se asocia con mayores volúmenes de pan que en presencia de la subunidad de glutenina nula (0).

En el locus Glu-B1 las subunidades 7+8, 17+18 no mostraron diferencia significativa en las medias de las proporciones de proteína extraída (Cuadro 5). El locus Glu-D1 arrojó valores similares entre alelos para la fracción de PM, mientras que la presencia de la subunidad 5+10 mostró una proporción ligeramente mayor de PPI. Para el locus Glu-B3 se encontraron tres variantes alélicas, entre las que destaca el alelo h con mayor proporción de PM, y el alelo g con mayor proporción de PPI, aunque estadísticamente igual que el alelo b; en cambio, estas tres subunidades h, b, y g presentaron diferencias significativas en contenidos medios de PPS.

Para el locus Glu-A1, De la O et al. (2010) no encontraron diferencias entre genotipos con los alelos 1, 2* para la concentración de la fracción rica en gliadinas, pero la presencia de 2+12 (Glu-D1) se asoció con mayor cantidad de gliadinas; así mismo, para la fracción rica en glutenina las subunidades encontradas en el locus Glu-A1 no difirieron de manera significativa. Sin embargo, para el locus Glu-D1 la mayor cantidad de gluteninas correspondió a la presencia del alelo 5+10. En presencia de Glu-B3h se detectó un mayor contenido de la fracción rica en gliadina.

El análisis de correlación de Pearson del Cuadro 6 presenta la asociación entre las proporciones de proteína y las variables de calidad evaluadas, desglosada para cada variante alélica. En la fracción PM se encontró significancia negativa (P ≤ 0.05 o P ≤ 0.01) para las correlaciones en las subunidades 0, 2* (Glu-A1); 7+8 (Glu-B1); 2+12, y 5+10 (Glu-D1); b, g (Glu-B3). Estas correlaciones se presentaron en volumen de sedimentación y en variables evaluadas en mixógrafo, mixolab y alveógrafo, en función del efecto individual de cada alelo. En la fracción de PPI se encontraron correlaciones positivas con fuerza de gluten, en su mayoría altamente significativas (P ≤ 0.01), como en el caso de las subunidades 0 (Glu-A1); 7+8 y 17+18 (Glu-B1); 2+12 y 5+10 (Glu-D1); b y g (Glu-B3). Su grado de influencia dependió del efecto de cada uno de los alelos.

Se obtuvieron ocho combinaciones alélicas de los loci Glu-A1, Glu-B1, Glu-D1 y Glu-B3 (Cuadro 7). Con referencia a PM destacó la combinación alélica 2 por tener correlaciones negativas y relevantes con variables de mixógrafo; de la misma forma, la combinación 3 correlacionó negativamente con AlvW, y la 7 con variables de Mixolab. Para las correlaciones encontradas con la PPI, las agrupaciones alélicas 1 y 7 presentaron mayor número de correlaciones significativas con variables de fuerza; en cambio, las combinaciones 2, 6 y 7 sobresalieron por presentar correlaciones significativas con la extensibilidad de la masa. Sólo la combinación 8 careció de correlación significativa entre las fracciones de proteína y las variables de calidad. Similarmente, De la O et al. (2010) concluyeron que para mejorar la cantidad de proteínas del gluten los genotipos idóneos deberían contener las combinaciones de alelos 2* 17+18 5+10/ Glu-A3c, Glu-B3g, Glu-D3b y 1 17+18 5+10/ Glu-A3e, Glu-B3g, Glu-D3b.

La caracterización de proteínas de alto y bajo peso molecular, el fraccionamiento de las principales proteínas presentes en el grano de trigo, el análisis de sus combinaciones, el efecto de éstas dentro de la cruza y su efecto sobre características importantes de la calidad, constituye una importante herramienta de apoyo al fitomejoramiento, porque permite realizar los cruzamientos entre progenitores sobresalientes y luego en su descendencia efectuar una selección más eficiente de líneas con los atributos de calidad que satisfagan las demandas específicas de la industria harinera.

CONCLUSIONES

La proporción de las principales fracciones de proteína presentes en el trigo y su influencia sobre características importantes de calidad, es afectada por el genotipo tanto a nivel de variación alélica individual como en combinación de diferentes alelos.

Se confirma la influencia de las proteínas monoméricas en la extensibilidad de la masa (> PM, > extensibilidad) y de las PPI sobre características de fuerza de gluten (> PPI, > fuerza).

AGRADECIMIENTOS

Al financiamiento parcial del Fondo Sectorial SAGARPA-CONACYT-COFUPRO, Proyecto: 146788. Al equipo del Laboratorio de Química y Calidad de Trigo de CIMMYT, y a la colaboración conjunta de investigadores de CIMMYT-Colegio de Postgraduados.

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