Diversidad genética en algunas especies de amaranto (Amaranthus spp.)

Genetic diversity in some species of amaranth (Amaranthus spp.)

J. Porfirio Legaria Solano

Departamento de Fitotecnia, Universidad Autónoma Chapingo. Km. 38.5. * Autor para correspondencia (legarias.juan@yahoo.com.mx)

Resumen

Se evaluaron 103 colectas de plantas del género Amaranthus previamente clasificadas mediante datos morfológicos como pertenecientes a razas de alguna de las tres especies cultivadas: A. hypochondriacus, razas 'Mercado' (7), 'Azteca' (38), 'Nepal' (30) o 'Mixteco' (1); A. caudatus, raza 'Sudamericana' (12); y A. cruentus, raza 'Mexicana' (15); para determinar la diversidad genética entre y dentro de razas y especies, obtener las huellas genéticas correspondientes, y hacer comparaciones para diferenciar sus variantes genéticas. El análisis de 141 fragmentos RAPD generados de 16 iniciadores reveló que A. hypochondriacus y A. caudatus están genéticamente más relacionadas, y que la especie más alejada fue A. cruentus. Entre razas de A. hypochondriacus, 'Mercado' y 'Azteca' mostraron estar genéticamente más cercanas entre sí y alejadas de 'Nepal' que agrupó a mayor distancia. La diversidad genética detectable en Amaranthus se encuentra dentro de especies y razas, más que entre especies y razas. El porcentaje de loci polimórficos entre poblaciones fue de 73.05 %, y dentro de poblaciones hubo baja variabilidad genética para la mayoría de ellas, con porcentajes de loci polimórficos que variaron de 27.66 % para A. caudatus raza 'Sudamericana' hasta 65.96 % en A. hypochondriacus raza 'Azteca'. El índice de diversidad genética de Nei (N) promedio fue de 0.15, que indica baja diversidad en las poblaciones. El grado de flujo genético (Nm) fue de 1.43, que indica que hay menos de dos individuos migrantes por generación entre las poblaciones evaluadas.

Palabras clave: Amaranthus spp., diversidad genética, RAPD.

Abstract

In this research, 103 accesions classified within races of three cultivated species of Amaranthus: A. hypochondriacus represented by races 'Mercado' (7), 'Azteca' (38), 'Nepal' (30) and 'Mixteco' (1); A. caudatus, 'Sudamericana' race (12); and A. cruentus, 'Mexicana' race (15); were analyzed to determine genetic diversity among and within them, to obtain the corresponding genetic fingerprints, and to carry out comparisons for differentiating and distinguishing between the genetic variants. Analysis of 141 RAPD fragments generated from 16 primers revealed that A. hypochondriacus and A. caudatus are genetically most similar to each other compared to A. cruentus. In A. hypochondriacus, races 'Mercado' and 'Azteca' are genetically more related between them than with 'Nepal'. In Amaranthus there is a higher genetic diversity within species and races than among species and races. The percentage of polymorphic loci between populations was 73.05 % and within populations the genetic variability was low, with polymorphism levels of 27.66 % for A. caudatus race 'Sudamericana' and 65.96 % in A. hypochondriacus race 'Azteca'. Nei's coefficient of diversity (N) of all loci studied in the amaranth populations was 0.15, confirming a low diversity within populations. The level of genetic flow (Nm) was 1.43, indicating that less than two migrants per generation are exchanged between the populations.

Key words: Amaranthus spp., genetic diversity, RAPD.

INTRODUCCIÓN

Existen cerca de 20 especies del género Amaranthus en México que crecen en forma silvestre (Mapes, 1986). Dos de ellas A. hypochondriacus L. y A. cruentus L. fueron domesticadas por algunos grupos étnicos prehispánicos de México, quienes las utilizaban como parte de su dieta alimenticia y de sus rituales religiosos (Alejandre y Gómez, 1986, 1999; Granados y López, 1986).

Entre las aproximadamente 60 especies descritas del género Amaranthus, tres de ellas predominan en los amarantos cultivados: A. hypochondriacus, A. cruentus y A. caudatus (Kauffman, 1986). Se considera que las tres especies son autopolinizables, con polinización cruzada de 3 a 25 % según la variedad y el ambiente (Jain et al., 1982). Las tres especies son diploides con 2n = 2x = 32 cromosomas, aunque hay reportes de 2n = 34 en A. cruentus (Sauer, 1976).

A. hypochondriacus se puede localizar desde el suroeste de los Estados Unidos hasta el centro de México, y se traslapa con la localización de A. cruentus que se extiende del Norte de México hasta Centroamérica. A. caudatus se encuentra principalmente en la región de los Andes en Sudamérica (Sauer, 1976).

Algunas colectas de amaranto pueden clasificarse rápidamente dentro de una especie particular con base en caracteres morfológicos. Sin embargo, la variación morfológica puede ser afectada por la interacción genotipo–ambiente, lo que frecuentemente conduce a una clasificación errónea de especies en algunas colectas. Para evitar dichos errores de clasificación, Feine (1986) desarrolló una clave provisional que requiere la evaluación de diferencias en tamaño y forma de estructuras florales. No obstante, la variabilidad de las estructuras florales a través del tiempo, entre plantas y dentro de una planta individual, impide una identificación inconfundible de las especies al usar solamente las estructuras florales.

Además, también hay claras incompatibilidades genéticas entre las tres especies. Gupta y Gudu (1991) analizaron la viabilidad y fertilidad de todos los híbridos F1 posibles entre las tres principales especies cultivadas. Las cruzas entre A. caudatus y A. cruentus rindieron un número pequeño de semillas F1 las cuales murieron a las cuatro semanas después de la germinación. Las cruzas entre A. hypochondriacus y A. cruentus también rindieron muy pocas semillas F1, la mayoría murieron como plántulas y las que sobrevivieron hasta la madurez (cuatro plantas) fueron estériles. Los híbridos F1 entre A. hypochondriacus y A. caudatus resultaron más exitosos porque pudieron madurar y ser autopolinizados para producir generaciones F2 y F3, aunque presentaron polen con baja fertilidad (10.3 a 15.1 %). Tales síntomas de incompatibilidad subrayan la necesidad de realizar una identificación fiel al nivel de especies para poder realizar mejoramiento genético y conservar los recursos genéticos de amaranto.

La técnica RAPD (polimorfismos en el ADN amplificados al azar) ha probado ser un método efectivo y de bajo costo para el mapeo de genomas (Reiter et al., 1992; Williams et al., 1990), para realizar selección asistida por marcadores (Michelmore et al., 1991; Martín et al., 1991) y para caracterizar recursos genéticos (Joshi y Nguyen, 1993). Esta técnica se basa en el análisis de marcadores de ADN heredables que son amplificados mediante iniciadores con secuencias arbitrarias de nucleótidos (Williams et al., 1990). El objetivo del presente trabajo fue estimar la diversidad genética presente entre y dentro de especies y razas cultivadas de Amaranthus, así como determinar si el análisis de los patrones RAPD puede ser útil para identificar individuos y especies de Amaranthus.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para la obtención de los marcadores RAPD se usaron plantas de un mes de edad crecidas en condiciones de invernadero rústico, sin calefacción y con cubierta de cristal, ubicado en Chapingo, Edo de México 19° 29' LN, 98° 53' LO, y 2250 m de altitud. La temperatura media en el invernadero osciló entre 22 y 28 °C.

El ADN genómico se extrajo con el método propuesto por De la Cruz et al. (1997). La concentración del ADN extraído se cuantificó en un espectrofotómetro Jenway 6305® UV/vis a 260 nm de absorbancia, y se verificó la integridad del mismo después de realizar la electroforesis de 5 µg de ADN en un gel de agarosa a 0.8 % (p/v) con amortiguador TAE (40 mM Tris–acetato, pH 7.6; 1 mM Na₂–EDTA), durante 2 h a 80 V y teñido con bromuro de etidio (0.5 mg mL^–1), para luego efectuar las reacciones en cadena de la Taq ADN polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). Se probaron 20 iniciadores de la serie A de Operon® (OPA01–OPA20) y 20 de la serie B (OPB01–OPB20) (Operon Technologies Inc, Alameda, CA, USA). Se seleccionaron 16 iniciadores que mostraron polimorfismo, y por la complejidad del patrón de bandeo para obtener los RAPD (Cuadro 2).

La PCR se hizo en un termociclador Perkin Elmer Modelo 480®. La mezcla de reacción se hizo con un volumen total de 25 µL, que incluyó: 4.2 µL de agua bidestilada esterilizadal, 10 µL de dNTPs 500 µM, 2.5 µL de amortiguador 10X, 1.0 µL de M_gCl₂ 50 mM, 3.0 µL del iniciador a una concentración de 10 pmol, 0.3 µL de enzima Taq ADN polimerasa a una concentración de 5U HL^–1, y 4.0 µL de ADN genómico a una concentración de 10 µg µL^–1. Las condiciones de reacción fueron: un ciclo a 94 °C, 2 min; 38 ciclos a 94 °C, 30 s, 40 °C por 30 s, 72 °C por 90 s; y al final 72 °C por 2 min. Los productos se separaron en geles de agarosa a 1.2 % (p/v) con amortiguador TAE (40 mM Tris–acetato, pH 7.6; 1 mM Na₂–EDTA), durante 3 h, a 85 V. Finalmente, los geles se tiñeron con bromuro de etidio (0.5 mg mL^–1) y se fotografiaron bajo luz UV. Las reacciones de amplificación se repitieron al menos dos veces, sin que hubiera discrepancias entre los patrones RAPD obtenidos.

Los materiales se compararon con base en similitudes y diferencias en los patrones de bandeo, y se asignó un valor de 1 a la presencia de una banda y de 0 a la ausencia de la misma, bajo el supuesto de que bandas de igual peso molecular son idénticas en colectas diferentes.

El porcentaje de loci polimórficos se calculó mediante la fórmula: Porcentaje de loci polimórficos = (Número de loci polimórficos/número total de loci) × 100 (Nei, 1973).

Se consideró a las colecciones de cada raza dentro de especies como poblaciones, y para estimar parámetros de polimorfismo al nivel de poblaciones, la matriz de datos presencia/ausencia de RAPD se analizó con el programa POPGENE32 (Yeh et al., 1999). Los parámetros de polimorfismo estimados dentro y entre poblaciones fueron: porcentaje de loci polimórficos (P), número de alelos por locus (A), número efectivo de alelos por locus (Ae), índice de Shannon (S), índice de diversidad genética de Nei (N), coeficiente de diferenciación genética (GST) y número de individuos migrantes (Nm).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El listado de iniciadores y sus secuencias, el número de productos amplificados, y el polimorfismo detectado por cada par de iniciador, se muestran en el Cuadro 2. De 40 iniciadores probados de las series A y B de Operon®, sólo 16 presentaron productos de amplificación (Cuadro 2) y 14 mostraron polimorfismo. La media de polimorfismo detectada por los iniciadores fue de 66.42 %. Los iniciadores OPA10, OPB04, OPB10 y OPB15 revelaron 100 % de polimorfismo, mientras que OPA09 y OPA11 detectaron 0 %. El número promedio de bandas reveladas por iniciador fue de 8.8, con un rango de 2 a 14. El tamaño de los fragmentos amplificados varió de 500 a 5000 pb.

El dendrograma de relaciones genéticas entre individuos pertenecientes a especies o poblaciones de Amaranthus obtenido mediante el análisis de 141 bandas (Figura 2), muestra la formación de tres grandes grupos, que corresponden con las tres especies aquí incluidas. Estos resultados muestran que A. hypochondriacus estuvo genéticamente más relacionado con A. caudatus, y la especie mas alejada fue A. cruentus. Las razas 'Azteca', 'Nepal' y 'Mercado' de A. hypochondriacus formaron un solo grupo; de éstas, 'Mercado' y 'Azteca' mostraron estar genéticamente más cercanas, en relación con la raza 'Nepal' que se ubicó a mayor distancia. La raza 'Mixteco' estuvo más cercana a 'Azteca' y 'Mercado' que a 'Nepal' (datos no mostrados). Lo anterior concuerda con la clasificación morfológica y molecular establecida por otros autores (Gupta y Gudu, 1991; Transue et al., 1994; Wassom y Travel, 2005; Drzewiecki, 2001). Estos resultados sugieren que los marcadores RAPD's son eficientes para discriminar especies y razas de Amaranthus.

El porcentaje de loci polimórficos (P) entre poblaciones fue de 73.05 % (Cuadro 3). Dentro de la población de A. hypochondriacus raza 'Mercado' (AhyM), los individuos mostraron un polimorfismo de 53.19 %, los de A. hypochondriacus raza 'Nepal' (AhyN) 43.97 %, A. hypochondriacus raza 'Azteca' (AhyA) 65.96 %, A. caudatus raza 'Sudamericana' (AcaSD) 27.66 % y A. cruentus raza 'Mexicana' (AcrMx) 39.01 %. La población con mayor polimorfismo genético fue A. hypochondriacus raza 'Azteca' y la menos polimórfica fue A. caudatus raza 'Sudamericana'. Estos valores indican que las poblaciones presentan baja variabilidad genética, y difieren de los reportados por Mandal y Das (2002) quienes encontraron polimorfismos de 69.2 % en A. cruentus, 38.5 % en A. caudatus y 15.4 % en A. hypochondriacus; estas diferencias pueden deberse a que son genotipos diferentes, con orígenes diferentes.

El coeficiente de diversidad (N) de Nei (1973) para todos los loci estudiados en las cinco poblaciones de Amaranthus fue de 0.20 (Cuadro 3); para cada especie y raza los coeficientes fueron: 0.17 para la raza 'Mercado' (AhyM), 0.14 para la raza 'Nepal' (AhyN), 0.21 para la raza 'Azteca' (AhyA), 0.09 para la raza 'Sudamericana' (AcaSD), y 0.13 para la raza 'Mexicana' (AcrMx). Estos valores otra vez muestran una reducida diversidad genética en las poblaciones. En lo referente al número de alelos por locus (A) y el número efectivo de alelos (Ae), A. hypochondriacus raza 'Azteca' (AhyA) superó a las poblaciones restantes con valores de 1.66 y 1.35, respectivamente.

El coeficiente de diferenciación genética entre las poblaciones (Cuadro 3) fue relativamente bajo (GST = 0.26; 26 %), lo que indica que las poblaciones están poco diferenciadas, y que aproximadamente 26 % de la variación detectada se debe a diferencias entre especies y razas; el resto (74 %) representa diversidad genética dentro de las especies y razas. El valor de GST entre especies es semejante a la media de GST (0.23) detectada por Nybom y Barthish (2000) mediante marcadores RAPD.

En función de G_ST se estimó el grado de flujo génico (Nm), con un valor de 1.43 (Cuadro 3), lo que significa que en promedio hay un individuo migrante por generación entre las poblaciones, lo que podría explicar su bajo grado de diferenciación.

Varios de los iniciadores probados, como OPA09 y OPA11, no detectaron polimorfismo, ya sea entre individuos pertenecientes a la especie o entre las especies y razas (Cuadro 2), lo que indica que las especies pudieran estar compartiendo grandes porciones de su genoma (Brown, 2002), y que las especies se derivan de un ancestro común (Whitkus et al., 1994).

Amaranthus hypochondriacus se relacionó más con A. caudatus y la especie más alejada fue A. cruentus. Al nivel de razas de A. hypochondriacus, 'Mercado' y 'Azteca' mostraron estar genéticamente más cercanas entre sí, y ambas alejadas de 'Nepal' que se agrupó a mayor distancia. En Amaranthus la mayor parte de la diversidad genética detectable se encuentra dentro de las especies y razas, con una menor proporción de variación entre especies y razas.

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