Sobrevivencia de Salmonella typhimurium en melon 'cantaloupe' durante el almacenamiento refrigerado en atmósferas controladas

Survival of Salmonella typhimurium on 'cantaloupe' melon during cold storage under controlled atmospheres

Patricia Landa Salgado¹, Ana M. Hernández Anguiano¹*, Joel Corrales García², Gustavo Mora Aguilera¹ y Cristóbal Chaidez Quiroz³

¹ Colegio de Postgraduados. Km 36.5, carr. México-Texcoco, Montecillo, Texcoco Edo de México. (595) 95-20200 ext. 1083, 1602 (fax). *Autor para correspondencia (ahernandez@colpos.mx)

³ Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C.

Recibido: 23 de Octubre de 2007.
Aceptado: 23 de Julio de 2009.

Resumen

Se analizó la sobrevivencia de Salmonella typhimurium sola y asociada con Rhizopus sp. en frutos de melón 'Cantaloupe' (Cucumis melo L.) var. reticulatus durante el almacenamiento en frío con atmósferas controladas (AC). Frutos de tamaño uniforme se inocularon con 8.2 logio UFC de una cepa de S. typhimurium ATCC2356, resistente a kanamicina (Km), y se almacenaron en las atmósferas: AC₁con O₂ 3 %, CO₂ 12 % y N₂ 85 %; AC₂ con O₂ 5 %, CO₂ 15 % y N₂ 80 %; y aire con O₂ 20.95 %, CO₂ 0.03 % y N₂ 78.08 %, a 3.7 °C y humedad relativa (HR) de 93.6 ±5.9 % por 192 h. Cada 48 h se extrajo un fruto en el que se tomaron muestras de tejido inoculado para pruebas de detección en agar entérico Hektoen con Km (50 µg mL^-1). Los resultados mostraron que S. typhimurium puede sobrevivir en la superficie del fruto en las atmosferas refrigeradas AC₁, AC₂ y aire; sin embargo, bajo estas condiciones la población bacteriana registró un decremento (P ≤ 0.05) de 3.7, 4.3 y 4.75 log₁₀ UFC por fruto, respectivamente. La presencia de Rhizopus sp. no afectó la capacidad de sobrevivir de la bacteria ni el nivel de su población en AC₂ y aire en condiciones similares de temperatura y HR. Se evidencia así la capacidad de S. typhimurium para sobrevivir en atmósferas con alta concentración de CO₂ y condiciones adversas de temperatura, así como de la importancia de prevenir la contaminación del melón 'Cantaloupe' durante su producción y comercialización.

Palabras clave: Cucumis melo, Salmonella typhimurium, Rhizopus, atmósferas controladas.

The survival of Salmonella typhimurium alone or associated with Rhizopus sp. was analyzed on 'Cantaloupe' melons (Cucumis melo L.) var. reticulatus during cold storage under controlled atmospheres (CA). Melons of uniform size were inoculated with 8.2 log₁₀ CFU of a strain of S. typhimurium ATCC2356, kanamycin resistant (Km) and stored under the atmospheres: AC₁ at O₂ 3 %, CO₂ 12 % and N₂ 85 %; AC₂ at O₂ 5 %, CO₂ 15 % and N₂ 80 %; and air (O2 20.95 %, CO₂ 0.03 %, and N₂78.08 %) at 3.7 °C and relative humidity (RH) of 93.6 ±5.9 % by 192 h. Every 48 h inoculated tissue samples were taken from fruits for testing on enteric Hektoen agar with Km (50 μg mL^-1).

Results showed that S. typhimurium can survive on the surface of the fruit in chilled atmospheres AC₁, AC₂ and air, although under these conditions the bacteria showed a decrease (P ≤ 0.05) in the population of 3.7, 4.3 and 4.7 log₁₀ CFU per fruit, respectively. The presence of Rhizopus sp. did not affect the bacteria ability to survive or its population level at similar conditions of temperature and RH. Therefore, it is demonstrated the ability of S. typhimurium to survive in atmospheres with high CO₂ concentration and adverse temperature conditions, and the importance to prevent the contamination of 'Cantaloupe' melons during its production and marketing.

Kay words: Cucumis melo, Salmonella typhimurium, Rhizopus, controlled atmospheres.

INTRODUCCIÓN

Salmonella es una bacteria enteropatógena que en las últimas dos décadas se ha relacionado con numerosos brotes asociados con el consumo de melón 'Cantaloupe' (Cucumis melo L.) (Calvin, 2003). Debido a la importancia sanitaria y económica de Salmonella varios investigadores se han dedicado a evaluar tratamientos químicos (Brackett, 1992; Ukuku y Sapers, 2006), físicos (Zhuang et al., 1995; Amanatidou et al., 1999; Wuytack et al., 2003; Ukuku, 2005; Da§ et al,. 2006) y biológicos (Richards y Beuchat, 2004) para lograr un control efectivo contra este patógeno. Sin embargo, actualmente se carece de un tratamiento 100 % efectivo contra Salmonella (Ukuku y Sapers, 2006).

Hay reportes de que algunos hongos como Botrytis, Cladosporium, Geotrichum, Penicillium y Rhizopus, integrantes de la microflora natural de la superficie de los productos hortofrutícolas frescos, pueden inducir cambios en textura y pH del tejido los cuales favorecen la sobrevivencia y proliferación de otros microorganismos (Draughon et al., 1988; Conway et al., 2000; Riordan et al., 2000; Wade y Beuchat, 2003b). Específicamente, se ha reportado (Wells y Butterfield, 1999) que en presencia de Rhizopus el nivel de población de S. typhimurium se incrementa de 10 a 100 veces en papa (Solanum tuberosum L.), cebolla (Allium cepa L.) y tomate (Lycopersicum esculentum L.), precortados y almacenados a 25 °C bajo atmósfera normal de aire.

Parte de la cadena productiva del melón 'Cantaloupe' involucra el almacenamiento antes de su distribución y comercialización. Las atmósferas controladas (AC) y atmósferas modificadas (AM) se utilizan para incrementar la vida postcosecha de varios productos agrícolas (Kader, 2002), y de manera reciente se usan para inhibir el crecimiento de hongos como Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer y Penicillium discolor durante postcosecha (Hoogerwerf et al., 2002) y para controlar algunos patógenos de humanos como Listeria monocytogenes (Conway et al., 2000), Salmonella enteritis (Nychas y Tassou, 1996) y S. typhimurium (Amanatidou et al., 1999).

Por la importancia que para los productores, transportistas y comerciantes tiene el contar con información sobre el impacto de las atmosferas controladas en la calidad sanitaria de los productos hortofrutícolas frescos, en este trabajo el objetivo principal fue analizar la sobrevivencia de S. typhimurium sola y asociada con Rhizopus en melón 'Cantaloupe', durante el almacenamiento refrigerado en las atmósferas controladas recomendadas a nivel comercial para este fruto. Adicionalmente, bajo estas mismas condiciones se registró la capacidad de crecimiento y de internalización de la bacteria en el melón 'Cantaloupe' con la hipótesis de que en condiciones de refrigeración las atmósferas controladas tienen efecto bactericida o bacteriostático en S. typhimurium, y de que Rhizopus puede modificar el pH y la textura de la corteza para favorecer el crecimiento y la internalización de la bacteria en el fruto.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas y preparación de inóculo

Bacteria. Se utilizó la cepa St-3^km50 resistente a kanamicina (Kanamicina A, Sigma Adrich®), la cual se derivó de una cepa de Salmonella enterica serotipo Typhimurium ATCC23564 (S. typhimurium), donada por el laboratorio de microbiología del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A. C. (CIAD) en Culiacán, México. A partir de un cultivo de la cepa St-3^km50 en glicerol-agua (50:50 v/v) mantenida a -80 °C, se sembró en agar entérico Hektoen (Bioxon®) con kanamicina a concentración de 50 µg mL^-1 (AEH-Km⁵⁰). De una colonia de 48 h de crecimiento se tomó masa bacterial y se transfirió a caldo de soya tripticaseína (Difco®, CST) con Km⁵⁰ (CST-Km⁵⁰). Después de 18 h a 37 °C, la suspensión bacterial se centrifugó a 8000 g por 10 min y la pastilla (masa bacterial) se resuspendió en 1 mL de agua buferada peptonada (ABP) a 0.1 % (p/v). Este procedimiento de lavado/centrifugado se repitió dos veces para recuperar nuevamente la bacteria en ABP a 0.1 %. Se estimó la población (UFC mL^-1) en AEH-Km⁵⁰ a 37 °C y la suspensión se mantuvo en hielo hasta su utilización.

Hongo. Se utilizó una cepa de Rhizopus sp. aislada de melones 'Cantaloupe' naturalmente infectados y mantenida en papa-dextrosa agar (PDA) y glicerol 50 % a 5 ^oC. Para la preparación del inóculo, la cepa se reactivó en cajas Petri con PDA a 20 °C, y después de 48 h de crecimiento se depositaron 10 mL de agua destilada estéril sobre la superficie del medio para dispersar las esporas del hongo desarrollado, con una varilla de vidrio estéril. La suspensión de esporas se filtró a través de una gasa estéril y se centrifugó a 16 000 g por 5 min. Las esporas se resuspendieron en agua destilada estéril y el proceso de lavado/centrifugado se repitió dos veces. Posteriormente, se determinó el nivel de la población de esporas en una cámara de recuento tipo Newbauer (Zuzi®) y la suspensión se mantuvo en hielo hasta su utilización como inóculo.

Establecimiento de cámaras con atmósferas controladas (AC)

Los tratamientos con AC se establecieron en una cámara frigorífica con temperatura promedio de 5 ± 1.5 ^oC y con base en mezclas comerciales estándar certificadas (INFRA, S.A. de C.V.), contenidas en tanques presurizados de 6 m³ de capacidad conectados a un sistema de flujo controlado (24 mL min^-1) por un tablero, lo que permitió la dosificación al interior de cámaras de AC (5 L de capacidad) a través de mangueras de plástico y látex. Para introducir la mezcla gaseosa a las cámaras de AC y al mismo tiempo evitar su acumulación mediante su salida continua, en la tapadera de estas cámaras se hicieron dos perforaciones circulares (1.7 cm de diámetro), en las cuales se instaló un puerto hermético de entrada y uno de salida. La hermeticidad de estas cámaras se logró mediante cinta de Teflón® colocada en la cuerda de cierre de sus tapaderas. Los tratamientos evaluados se denominaron: atmósfera controlada 1 (AC₁) con O₂ 3 %, CO₂ 12 % y N₂ 85 %; atmósfera controlada 2 (AC₂) con O₂ 5 %, CO₂ 15 % y N₂ 80 %; y aire (Testigo) cuya composición aproximada de acuerdo con Kader (2002) es O₂ 20.95 %, CO₂0.03 % y N₂ 78.08 %. Dentro de cada cámara se colocó un fruto (unidad experimental), y de cada tratamiento (mezcla gaseosa y periodo de exposición) se hicieron tres repeticiones (tres unidades experimentales).

Preparación e inoculación de frutos de melón 'Cantaloupe'

Se utilizaron melones 'Cantaloupe' con un promedio de 10.4 ^oBrix de sólidos solubles totales; es decir, melones de buena y muy buena calidad comercial, de acuerdo con Infoaserca (2000), adquiridos de la Central de Abastos de la Ciudad de México durante los años 2006 y 2007. El tamaño de los frutos fue uniforme, y correspondió a una clasificación de 15 por caja. Previo a la inoculación, los frutos se lavaron con agua corriente y jabón, se desinfectaron superficialmente por aspersión con 0.02 % de hipoclorito de sodio (NaClO) por 3 min, y se enjuagaron con agua destilada estéril. Después de secarse a 24 °C, los frutos se colocaron en las cámaras de AC, previamente desinfectadas con alcohol 70 % y en los costados de cada uno se marcaron con un marcador indeleble dos regiones de inoculación.

Para la inoculación de frutos se usaron dos protocolos: 1) S. typhimurium, y 2) S. typhimurium + Rhizopus sp. En el primero se depositaron 100 μL de suspensión bacterial (con 10^8.1 UFC en promedio) en la superficie de una de las regiones de inoculación y 100 μL de agua (testigo) en la otra. En el segundo, primero se depositaron 40 μL de una suspensión de esporas (con 6.1 x 10⁴ esporas) de Rhizopus sp. y 24 h después 100 μL de suspensión bacterial de S. typhimurium; ambos, bacteria y hongo, en las regiones de inoculación. Cada esquema de inoculación constó de 12 frutos, e inmediatamente después de la inoculación las cámaras de AC se cerraron y se conectaron al sistema de flujo controlado de intercambio gaseoso AC₁, AC₂ y aire.

De cada atmósfera estudiada se extrajeron tres frutos cada 48 h durante el periodo de almacenamiento, para determinar sobreviviencia, crecimiento e internalización de S. typhimurium. De la región inoculada de cada fruto se tomó una muestra de tejido con un sacabocados de acero inoxidable de 5.8 cm de diámetro y se depositó en papel aluminio para separar, con un bisturí, la corteza y el tejido de 5 mm y 10 mm de profundidad. El tejido seccionado se colocó por separado en bolsas Ziploc® (16.5 cm x 14.9 cm), se pesó en una balanza analítica y se mantuvo en hielo para su procesamiento y análisis. Tanto el papel aluminio como las bolsas Ziploc® se esterilizaron previamente con luz ultravioleta por 15 min. Las muestras de tejido se procesaron en una cámara de bioseguridad tipo II (ENVIRCO® Corporation 805-5-65-98 PN 3137) como indican Amador et al. (2000). A cada muestra se le adicionó un volumen de ABP 0.1 % equivalente a su peso, se frotó manualmente y de la suspensión obtenida se tomaron 100 μL para ser sembrados en cajas Petri con AEH-Km⁵⁰.

Después de que las cajas se incubaron a 37 °C por 48 h, se contaron las colonias de Salmonella desarrolladas en el medio y se aislaron algunas de ellas en AEH-Km⁵⁰ para su posterior confirmación por PCR (Rahn et al., 1992).

Para el aislamiento de Rhizopus se tomaron 100 μL de cada una de las suspensiones obtenidas en ABP 0.1 % y se sembraron en cajas Petri con PDA acidificado con ácido cítrico 10 % (14 mL L^-1) y se incubaron a 20 °C por 24 h. Después de la incubación se registró el crecimiento del hongo y se hicieron observaciones al microscopio compuesto para su identificación, de acuerdo con las características morfológicas (Barnett y Hunter, 1998). 

Determinación de textura y pH del fruto

La textura y el pH de la región inoculada de frutos de melón con Salmonella y Salmonella + Rhizopus sp., se determinaron al cabo de cada periodo de almacenamiento. La textura se determinó por penetrometría con un texturómetro (Stable Micro System, TA-XT2i, Texture Analyser®, England) y una sonda tipo aguja (Needle probe, Bate No. 3426) de acuerdo con las recomendaciones del instructivo del equipo para melón. Los parámetros de penetración establecidos fueron: velocidad de pre-ensayo 1.5 mm s^-1; velocidad de ensayo 5 mm s^-1; distancia de penetración 20 mm. Cada fruto se colocó e inmovilizó con pequeñas calzas sobre una superficie plana, justo debajo de la sonda, para que ésta penetrara en forma perpendicular. La zona de penetración se ubicó a una distancia entre 0.5 y 1 cm del punto de inoculación en la región ecuatorial. Los datos se procesaron con un programa automatizado integrado (Windows® software, Texture Expert, Stable Micro Systems Ltd, versión 1.20, en español). Los resultados se expresaron en gramos fuerza (g_f) necesarios para la penetración en el tejido. El pH se midió en un potenciómetro con electrodo tipo aguja (pH/°C meter with GLP; Hanna® Instruments HI 98230, Rumania).

Análisis estadístico

Los datos de población bacteriana se analizaron con el programa estadístico Statistical Analysis Software (SAS Institute, 1998) en un arreglo de parcelas divididas, con prueba de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05). Los datos de textura y pH del melón se analizaron como mediciones repetidas en el tiempo con el módulo GLM de SAS (Littell et al., 1998). Se probó el efecto de la interacción Tiempo x Tratamiento para determinar si en alguna fecha particular la medición de al menos uno de los tratamientos mostraba una respuesta diferente. Adicionalmente, se utilizó la prueba de t para comparar la textura y pH de los frutos dentro de cada tipo de atmósfera y periodo de exposición.

RESULTADOS Y DISCUSION

La cepa St-3^km5° de S. typhimurium sobrevivió en la superficie (cáscara) del fruto de melón 'Cantaloupe' en las atmósferas AC₁, AC₁ y aire durante 192 h a 3.7 °C y HR de 93.6 ± 5.9 %. Sin embargo, la población de la bacteria decreció (P ≤ 0.05) durante el almacenamiento: 3.7, 4.3 y 4.7 log₁₀ UFC en AC₁, AC₂ y aire, respectivamente, y la principal reducción se registró en las primeras 48 h de almacenamiento (Figura 1). Los resultados del análisis de los tejidos a 5 mm y 1° mm de profundidad mostraron que durante el almacenamiento no ocurrió internalización de S. typhimurium en el fruto porque no se recuperó a la bacteria en AEH-Km⁵⁰. Las atmósferas AC₁ y AC₂, recomendadas a nivel comercial para alargar la vida postcosecha del melón 'Cantaloupe' (Kader, 2002) no tuvieron efecto bactericida o bacteriostático para S. typhimurium. Los resultados también mostraron que S. typhimurium tiene habilidad para sobrevivir bajo condiciones adversas de temperatura y de baja disponibilidad de nutrientes en la superficie del fruto. Estudios preliminares reportaron que los serotipos de Salmonella no crecen por debajo de 7 °C (Blackburn y McClure, 2002) pero pueden sobrevivir en jugo de naranja (Citrus x sinensis ) a 4 °C (Eblen et al., 2004). La capacidad de la bacteria de sobrevivir bajo condiciones adversas de temperatura y sin disponibilidad de nutrientes puede estar relacionada con su habilidad para formar rápidamente biopelículas (células bacteriales embebidas en material polimèrico extracelular) que la protegen de factores externos del ambiente (Annous et al., 2005).

El riesgo que representa la capacidad de sobrevivir de S. typhimurium en atmósferas ricas en CO₂ y temperaturas de refrigeración, las cuales serían perjudiciales para otros patógenos (Enfors y Molin, 1980), es el de que contamine la parte comestible del fruto de melón durante el cortado para su consumo. La parte comestible del fruto presenta condiciones óptimas de crecimiento para la bacteria como la disponibilidad de nutrientes en ambiente acuoso (Gagliardi et al., 2003; Ukuku y Sapers, 2006). En general se considera que el mantener los productos en refrigeración puede controlar el crecimiento de patógenos como Salmonella; sin embargo, la refrigeración de melón precortado no es una práctica común. Por lo anterior, el consumo de melón 'Cantaloupe' contaminado con Salmonella es un riesgo grande para la salud del consumidor, como lo evidencian los numerosos brotes de salmonelosis asociados con este producto, ocurridos en la última década (Calvin,2003).

Sobrevivencia de Salmonella typhimurium en presencia de Rhizopus

La presencia de Rhizopus sp. no afectó el patrón de sobrevivencia de la cepa St-3^km50 de Salmonella typhimurium en la superficie del fruto de melón 'Cantaloupe' en AC₂ y aire a 3.2 °C y HR de 99.6 %. A las 144 h después de la inoculación, la población de S. typhimurium fue (P ≤ 0.05) menor que la población inicial (Figura 2). La principal reducción en la población ocurrió durante las primeras 48 h. Al final del almacenamiento, la reducción total registrada fue de 4.4 y 4.5 log₁₀ UFC g^-1 en AC₂ y aire, respectivamente. La presencia del hongo no favoreció la internalización de la bacteria ya que no se detectaron células de Salmonella en AEH-Km⁵⁰ cuando se sembraron muestras de suspensiones, en ABP 0.1 %, de los tejidos de 5 mm y 10 mm de profundidad. 

En las regiones inoculadas con el hongo se observó ligero crecimiento micelial oscuro en la superficie del fruto. En observaciones al microscopio compuesto se encontraron escasas esporas germinadas; el resto (99.52 %), estaba sin germinar. Estas últimas germinaron posteriormente cuando se depositaron en PDA acidificado e incubaron a 20 ^oC, lo que evidenció que el hongo mantuvo su viabilidad en la superficie del fruto. Estos resultados indican que la temperatura, más que la concentración de O₂ y CO₂ de la atmósfera, fue un factor importante en la germinación de las esporas. Mass (1998) reportó que Rhizopus no crece por debajo de 5 ^oC, por lo que no es de esperarse que el hongo infecte por penetración directa de la cáscara de melón por producir una lesión a través de la cual Salmonella pudiera penetrar.

El análisis de repeticiones en el tiempo indicó que la textura promedio de los frutos de melón 'Cantaloupe' inoculados con Salmonella y con Salmonella + Rhizopus fue similar sin diferencias (P ≤ 0.05) entre mezcla gaseosa y periodo de exposición (Cuadro1). Según García-Sahagún et al. (2005), la madurez a la que los melones se cosechan y la temperatura a la que se almacenan afecta la textura; los frutos cosechados maduros presentaron textura de 2510 g_f la cual decreció a 810 y 1300 g_f cuando se almacenaron a 2 y 5 °C, respectivamente. En este trabajo los frutos de melón registraron valores promedio iniciales de textura de 650 g_f, de lo que se infiere que la temperatura de 3.2 ^oC a la cual se mantuvieron durante el almacenamiento no afectó (P ≤ 0.05) su textura. El análisis de muestras repetidas en el tiempo y la prueba de t son consistentes y no muestran diferencias entre tratamientos.

El pH del fruto de melón fue estadísticamente igual (P ≤ 0.05) entre tratamientos, independientemente de la presencia o ausencia de Rhizopus sp. La prueba de t indicó que este resultado aplica para ambas atmósferas (Cuadro 1). En la mayoría de los estudios de las asociaciones de patógenos de humanos con hongos fitopatógenos se han reportado cambios en pH del tejido inoculado de hasta 2 ± 1 unidades (Conway et al., 2000; Richards y Beuchat, 2004; Wade y Beuchat, 2003 a, b). En este trabajo no se registraron cambios significativos en pH en tejido inoculado con Rhizopus sp en AC₂ y aire. Esto puede estar relacionado con la baja germinación de las esporas en la superficie y por consiguiente con la ausencia de infección del tejido interno, ya que no se recuperó el hongo de tejidos a 5 mm y 1° mm de profundidad. No obstante, cabe destacar que el pH de frutos con Rhizopus sp fue menor (P ≤ 0.07) que el registrado en frutos sin el hongo, cuando se mantuvieron bajo la atmosfera AC₂ a 3.2 ^oC por 144 h.

CONCLUSIONES

Salmonella typhimurium tiene capacidad de sobrevivir en la superficie de frutos de melón 'Cantaloupe' almacenados en atmósferas controladas como AC₁ con O₂ 3 %, CO₂ 12 % y N₂ 85 %; AC₂ con O₂ 5 %, CO₂ 15 % y N₂ 80 %; y aire con O₂ 20.95 %, CO₂ 0.03 %, y N₂ 78.08 % a 3.7 °C, a una humedad relativa de 93.6 ±5.9 % por 192 h. Sin embargo, bajo estas condiciones la población bacteriana registró un decremento (P ≤ 0.05) de 3.7, 4.3 y 4.75 log₁₀ UFC por fruto, respectivamente. La presencia de Rhizopus sp. no afectó la capacidad de sobrevivir de la bacteria ni el nivel de su población bajo AC₂ y aire en condiciones similares de temperatura y HR. Estos resultados evidencian sobre la capacidad de S. typhimurium para sobrevivir en atmósferas refrigeradas, así como de la importancia de prevenir la contaminación del fruto de melón 'Cantaloupe' durante su producción y comercialización.

AGRADECIMIENTOS

Al CONACYT por el apoyo económico a través de la beca de maestría, con numero de becario 201471, a INFRA S.A. de C.V. por el apoyo con parte de las mezclas de atmósferas utilizadas, y al Sr. Adrián Paredes García de la UACh por el apoyo técnico en los muestreos y análisis de muestras.

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