Nota de investigación
Hacia el cultivo monoxénico de Glomus claroideum en raíces transformadas de zanahoria
Towards the Monoxenic Culture of Glomus claroideum in Transformed Roots of Carrot
F. A. Solís-Domínguez1*, A. Alarcón1, R. Ferrera-Cerrato1, M. Salvador-Figueroa2, D. Espinosa-Victoria1 y E. Cárdenas-Soriano1
]]> 1 Colegio de Postgraduados. Campus Montecillo. 56230 Montecillo, Estado de México. * Autor responsable (fasolis76@hotmail.com)
2 Centro de Biociencias, Universidad Autónoma de Chiapas. 30700 Tapachula, Chiapas.
Recibido: mayo de 2004.
Aceptado: noviembre de 2008.
RESUMEN
Los hongos micorrícicos arbusculares (HMA) son microorganismos rizosféricos capaces de completar su ciclo de vida sólo cuando colonizan las raíces de hospedantes susceptibles. La técnica de cultivo de tejidos vegetales acompañada de la transformación genética de raíces ha permitido la propagación in vitro de algunas especies de HMA. Se germinaron esporas de Glomus claroideum en medio mínimo para establecer la simbiosis in vitro utilizando raíces de zanahoria transformadas por Agrobacterium rhizogenes. A pesar de no haber colonizado intrarradicalmente, el micelio externo presentó una forma rizada con distribución limitada; formó una masa enredada de hifas y esporas inmaduras. Las hifas presentaron protuberancias de la pared formando estructuras en forma de crestas, similares a las estructuras de contacto que poseen algunos hongos micoparásitos. La viabilidad del micelio extraradical de G. claroideum estimada por la tinción vital de la fosfatasa alcalina del hongo, se mantuvo hasta después de tres meses del cultivo monoxénico. Las posibles causas del comportamiento de G. claroideum bajo las condiciones de su cultivo monoxénico son discutidas.
Palabras clave: hongos micorrícicos arbusculares, micelio extraradical, cultivo in vitro.
]]> ABSTRACT
Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are rhizospheric microorganisms that complete their life cycle only when they colonize the root system of susceptible hosts. The plant tissue culture accompanied by genetic transformation of roots has allowed the in vitro propagation of some AMF species. The objective of this investigation was to establish and to study the behavior of Glomus claroideum in monoxenic culture of transformed carrot roots by Agrobacterium rhizogenes. Although G. claroideum did not show intraradical colonization, the curly external mycelia had limited distribution and formed an entangled mass of hyphae, and some immature spores were observed. In some regions, the hyphae presented wall elongations forming crest-like structures, resembling those contact structures exhibited by some mycoparasitic fungi. The viability of the extraradical mycelia, estimated via the fungal alkaline phosphatase vital stain, was maintained after three months of the monoxenic culture. The possible causes of the behavior of G. claroideum under monoxenic culture are discussed.
Keywords: arbuscular mycorrhizal fungi, extraradical mycelium, in vitro culture.
INTRODUCCIÓN
Los hongos micorrícicos arbusculares (HMAs) son biótrofos obligados que, para completar su ciclo de vida, deben colonizar las raíces de las plantas (Bianciotto et al., 1996). Una de las formas más comunes para propagar HMA involucra el uso de cultivos trampa en macetas (Sylvia, 1999). A través de la técnica de cultivo de órganos vegetales y la transformación genética de raíces con la inserción del plásmido Ri (inductor de raíces) de Agrobacterium rhizogenes, la simbiosis micorrícica se ha establecido en cultivo monoxénico (dos organismos creciendo juntos en condiciones estériles: HMA y raíces cultivadas in vitro, según Bago et al., 1998a). Sin embargo, el cultivo in vitro de los HMA sigue siendo un desafío, ya que sólo se han logrado cultivar algunas especies. De acuerdo con las páginas electrónicas del INVAM (2008) y del GINCO (2008), sólo 18 especies de HMA dentro del grupo Glomaceae han sido propagadas en cultivo monoxénico, así como otras especies reportadas en la literatura como Gigaspora margarita (Bécard y Fortin, 1988), Gigasporagigantea (Declerck et al., 2005), G. clarum (Adriano y Berbara, 1999), G. etunicatum (Schreiner y Koide, 1993), G. intraradices (St-Arnaud et al., 1996), G. mosseae (Douds, 1997), G. proliferum (Declerck et al., 2000) y G. versiforme (Declerck et al., 1996). Sin embargo, no se ha logrado la propagación exitosa de la especie Glomus claroideum en sistemas de cultivo monoxénico (GINCO, 2008). Mediante este sistema se han obtenido esporas libres de cualquier otro organismo y estudiado el ciclo de vida y ontogenia de algunas especies (Adriano y Berbara, 1999); el intercambio de señales químicas entre hongo-hospedante (Bécard et al., 1992); la captación y el transporte del carbono en el HMA (Douds et al., 2000), además de la descripción de la arquitectura y el desarrollo del micelio externo (Bago et al., 1998a; b). Todos ellos aspectos imposibles de estudiar en cultivos en maceta.
Ante la necesidad de iniciar estudios sobre el comportamiento en cultivo monoxénico de especies de HMA autóctonas de México, como las que integran al consorcio Glomus Zac-19 (Chamizo et al., 1998) cuya efectividad en el crecimiento de plantas importantes para el sector agrícola, frutícola y forestal, ha sido satisfactoriamente evaluada (Manjarrez et al., 2005; Alarcón y Ferrera-Cerrato, 2003; Alarcón et al., 2002; 2007; Cartmill et al., 2007; 2008), el presente trabajo tuvo como finalidad establecer el cultivo monoxénico de la especie Glomus claroideum y describir la morfología de su micelio externo.
MATERIALES Y MÉTODOS
La transformación de las raíces se realizó con la inoculación de Agrobacterium rhizogenes (cepa 9402, resistente a 25 μg mL-1 de kanamicina) en rodajas de zanahoria (Daucus carota L.) y, posteriormente, mantenidas en medio mínimo <<M>>, pH 5.5. (Bécard y Fortin 1988). De acuerdo con Tepfer (1984), las raíces transformadas que se obtuvieron presentaron geotropismo negativo, raíces laterales abundantes y de apariencia hialina.
]]> Las esporas de Glomus claroideum se obtuvieron del consorcio micorrícico Glomus Zac-19 (Chamizo et al., 1998), propagado en cultivos trampa de Sorghum vulgare L. durante varios años, en invernadero. Las esporas se extrajeron mediante tamizado y decantación en húmedo (Gerdemann y Nicolson, 1963) y se seleccionaron bajo un microscopio estereoscópico. Después se enjuagaron en Tween 20 al 0.05% durante 1 min; se desinfectaron superficialmente con hipoclorito de sodio al 1% y una solución estéril de 200 mg L-1 de estreptomicina y 100 mg L-1 de gentamicina (Bécard y Piché, 1992). Después de la desinfección, las esporas se distribuyeron en cajas de Petri con medio <<M>> y se incubaron horizontalmente a 24 °C durante 10 días para propiciar su germinación.Para establecer el cultivo monoxénico, se transfirieron segmentos apicales de raíces transformadas, de 5 mm de longitud, a cajas de Petri con medio <<M>> y cinco esporas germinadas colocadas a 2 mm de la raíz. Las cajas se incubaron a 24 °C por 90 días. Se hizo un seguimiento no destructivo del crecimiento del micelio extrarradical y la esporulación con microscopio estereoscopio cada 15 días.
Para comprobar la viabilidad del micelio extrarradical, se utilizó la tinción vital de la fosfatasa alcalina (ALP) del hongo (Tisserant et al., 1993), directamente en el cultivo monoxénico (10 repeticiones), a los 60 y 90 días de edad. Como control positivo se utilizó micelio de Glomus intraradices de 45 días en cultivo monoxénico. Una vez teñido el micelio, se hicieron preparaciones en portaobjetos para observar al microscopio de campo claro la reacción positiva de la ALP y tomar las fotomicrografías (fotomicroscopio III, Carl Zeiss).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El contacto de las hifas germinativas de las esporas de G. claroideum en estas raíces transformadas se estableció a los seis días después de inocular las esporas pregerminadas. La presencia de G. claroideum en las células epidérmicas de las raíces se confirmó mediante microscopía electrónica de barrido, en donde se observó que las hifas del hongo recorrieron la superficie de la epidermis radical (Figura 1). Sin embargo, no se detectó la típica colonización micorrícica intrarradical al observar raíces teñidas con azul tripano (Phillips y Hayman, 1970). La ausencia de estructuras de G. claroideum dentro de las raíces, a pesar de que las hifas estaban en contacto con la superficie de la raíz, pudo deberse a la ausencia de compuestos estimuladores derivadas del hospedante (Garbaye, 1994; Barker et al., 1998), lo que limitó al hongo para penetrar la epidermis y desarrollarse en las células corticales, como se ha descrito para Gigaspora gigantea (Bécard y Piché, 1990). No obstante, otros aspectos, como la composición mineral del medio de cultivo y su pH, pueden también estar relacionados en el establecimiento exitoso de la simbiosis en las raíces transformadas. De igual forma, los aspectos relacionados con los requerimientos ambientales y nutricionales de los HMA han sido poco estudiados (Nagahashi y Douds, 2005). En este caso en particular, G. claroideum requiere de diferentes fuentes de nutrimentos o factores de crecimiento que le permitan desarrollarse exitosamente bajo el sistema de cultivo monoxénico, para lo cual se necesita mayor estudio.
Aun cuando no se observó colonización intrarradical del G. claroideum, se detectó un profuso pero localizado desarrollo de micelio en el medio de cultivo, el cual se extendió en un radio de 2.5 cm a partir de la espora inoculada, en tres meses. Una vez germinadas las esporas, se observó el desarrollo de hifas principales y secundarias de 5 y 2.5 μm de diámetro, respectivamente. Durante los primeros siete días, las hifas ramificaron a intervalos más o menos regulares (210-260 μm, Figura 2a) dirigiéndose hacia la raíz hospedante. En la cuarta semana, el micelio creció de manera irregular en forma rizada (Figura 2b y c) y se inició la formación de esporas hialinas muy pequeñas que no desarrollaron completamente (Figura 2d y e), alcanzando de 15 a 20 μm de diámetro. En promedio, se produjeron cuatro esporas inmaduras por caja de Petri.
A diferencia del micelio externo de G. intraradices (Bago et al., 1998a), G. claroideum presentó escasa formación de hifas corredoras (Figura 2f). Predominaron las hifas delgadas que se desarrollaron en puntos localizados de manera desorganizada. Las hifas bifurcadas, parecidas a las estructuras ramificadas de absorción, se observaron en raras ocasiones (datos no presentados). Algunas zonas de las hifas presentaron elevaciones en forma de crestas, sobre todo en las regiones hifales cercanas a las raíces o debajo de ellas (Figura 3e).
La actividad de ALP en el micelio fue positiva, tanto para G. claroideum (Figura 3d y f) como para G. intraradices (control positivo, Figura 3b), aunque también se observaron regiones de micelio con reacción negativa a la tinción (Figura 2a y c). De acuerdo con la tinción de ALP, el micelio externo de G. claroideum permaneció activo luego de tres meses en cultivo monoxénico. El micelio activo estuvo libre de septos, mientras que el tejido inactivo se caracterizó por estar septado. Las regiones hifales con mayor intensidad de la reacción positiva de la fosfatasa alcalina fueron aquellas cercanas a la raíz. Lo anterior se puede relacionar con el aprovechamiento del hongo de las fuentes de energía y nutrición provistas por la raíz, lo que permitió el desarrollo observado del micelio externo. No obstante, al aumentar la distancia hacia la raíz, es probable que el suministro de carbono para el hongo fuera limitado, lo que produjo la contracción del citoplasma y la generación de septos, como se ha reportado para Gigaspora rosea (Bago et al., 1998c).
No todos los HMA son establecidos fácilmente in vitro (Douds, 1997). A pesar de no haberse establecido exitosamente G. claroideum, las esporas tuvieron la capacidad de desarrollar micelio activo durante tres meses. En el caso de esporas en medio <<M>> sin la presencia de la raíz, se observó el desarrollo de prolongaciones de hifas de 1.12 mm de longitud en promedio, sin mostrar diferencias en crecimiento a los tres meses. Por el contrario, las esporas colocadas cerca de las raíces presentaron un continuo crecimiento de las hifas hasta llegar a formar las esporas inmaduras mencionadas.
]]> Los resultados muestran, por vez primera, la capacidad del hongo para mantener su crecimiento hifal aun sin establecer exitosamente la simbiosis como tal, sugiriendo la habilidad de este hongo para desarrollarse a partir de sus propias reservas de carbono durante su fase asimbiótica (Bago et al., 2000a; b), mantener su viabilidad por tres meses, e incluso, llegar a formar esporas inmaduras (Figura 3f). Los HMA son biótrofos obligados que dependen completamente de la planta para abastecerse del carbono requerido. No obstante, Glomus hoi tiene aparentemente la habilidad de crecer en compartimentos ricos en materia orgánica, denotando un comportamiento saprofítico (Hodge et al., 2001). Sin embargo, no hay evidencias de que los HMA tomen carbono a partir de fuentes orgánicas, tanto en suelo como en medios de cultivo (Bago et al., 2000a).Las hifas de G. claroideum presentaron elevaciones de la pared formando crestas (Figura 3e) cuya función es desconocida. Barnett y Binder (1973) reportan que este tipo de estructuras fúngicas (estructuras de contacto) participan en relaciones micoparasíticas biotróficas para incrementar la obtención de nutrimentos del micoparásito, a partir del hospedante. Es probable que en G. claroideum, este tipo de estructuras permitan al hongo asimilar nutrimentos provenientes de los exudados radicales cuando las hifas estaban en contacto directo con la superficie de la raíz o cuando estaban desarrollándose en el medio de cultivo.
CONCLUSIONES
Glomus claroideum no pudo establecerse exitosamente en cultivo monoxénico, aunque se observó, por vez primera, un desarrollo profuso y localizado de micelio externo en el medio de cultivo. La actividad metabólica del micelio revelado con la tinción vital de la enzima fosfatasa alcalina, obtenido bajo cultivo monoxénico, se mantuvo durante tres meses. El desarrollo de micelio a partir de esporas, a expensas de sus propias reservas de carbono, permitió, además, generar nuevas esporas, pero sin llegar a un estado de madurez. La presencia de estructuras atípicas del micelio de G. claroideum requiere de mayor estudio para establecer su posible función bajo condiciones de cultivo monoxénico.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la Dra. Lucía Varela Fregoso del Instituto Politécnico Nacional el haber proporcionado la cepa de Agrobacterium rhizogenes.
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