Especies de Trichoderma en suelos cultivados con Agave tequilana en la región de Los Altos Sur, Jalisco y valoración de su capacidad antagónica contra Thielaviopsis paradoxa

Trichoderma species in soil cultivated with Agave tequilana in Los Altos South region, Jalisco and assessment of their antagonistic capacity against Thielaviopsis paradoxa

Vladimir Sánchez¹ Oscar Rebolledo²

¹Instituto de Biotecnología. Universidad del Papaloapan. Campus Tuxtepec. Circuito central # 200. Colonia Parque Industrial, C.P. 68301. Tuxtepec, Oaxaca, México.

²Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Colima, A.P. 36, C.P. 28'00, Tecomán, Colima, México

Recibido 22 de febrero 2010;
Aceptado 1 de septiembre 2010.

Abstract

A survey was conducted to determine the species of Trichoderma from the soil of commercial plantations of tequila agave (Agave tequilana) in the Los Altos Sur region located in Jalisco State, Mexico in order to study them as biocontrol agents against one of the plant pathogens that attack the tequila agave. Sixty four cultures of Trichoderma were identified morphologically and some of them by DNA sequencing analyses of the internal transcribed space (ITS), translation elongation factor 1 alpha (tef1), actin (act), and calmodulin (cal). Morphologically, 60 isolates (93.7%) were identified as T. longibrachiatum and ITS sequence data for 25 of these cultures confirmed their identity. Three cultures (4.6%) were identified as T. harzianum and DNA sequences of ITS, tef1, act and cal confirmed the result. One culture (1.5%) was identified morphologically and by ITS sequence data as T. reesei. Antagonism against Thielaviopsis paradoxa was evaluated for several isolates of each species of Trichoderma. Isolates of T. longibrachiatum, T. viridescens and T. reesei produced significantly higher inhibition against Th. paradoxa than T. harzianum.

Key words: molecular identification, morphology, taxonomy, biological control.

Resumen

Palabras clave: Identificación molecular, morfología, taxonomía, control biológico.

Introducción

El agave tequilero (Agave tequilana Weber cv. 'Azul') es una planta que se utiliza como materia prima para la producción del tequila. Este cultivo es susceptible a la enfermedad "marchitez del agave" o "tristeza y muerte del agave" caracterizada por el enrollamiento anormal de las hojas y la posterior marchitez generalizada de la planta. Se ha reportado a Fusarium oxysporum Schlecht. y Thielaviopsis paradoxa De Seynes Hõhn como los fitopatógenos involucrados con esta enfermedad (Fucikovsky, 2001; Castañeda, 2002), para su control se realizan prácticas culturales y la aplicación de una amplia variedad de agroquímicos tales como: Sulfocop F® (sulfato de cobre), Comet® (sulfato de cobre pentahidratado), Benlate® (benomilo), y Bactrol® (sulfato de gentamicina y clorhidrato de oxitetraciclina) (Flores et al., 2002). Sin embargo, el empleo de pesticidas se asocia con una serie de afecciones a la salud humana, entre las cuales se resaltan: la muerte fetal por anomalías congénitas (Regidor et al., 2004), la degeneración de retinas (Kirrane et al., 2005) y el aumento en la incidencia de leucemia (Lee et al., 2004).

Una alternativa a la aplicación de químicos nocivos es el control biológico, el cual debe ser incluido en el manejo integrado de la enfermedad "marchitez del agave". Entre los agentes de biocontrol, se ha demostrado que diversas especies del género Trichoderma tienen la capacidad de controlar un amplio rango de hongos fitopatógenos (Whipps, 2001). El género Trichoderma está ampliamente distribuido en la naturaleza, incluye especies de vida libre que habitan en las primeras capas edáficas y en la zona rizosférica de las plantas, es considerado como oportunista y simbionte de plantas (Harman et al., 2004). Los mecanismos mediante los cuales las especies de Trichoderma pueden controlar los fitopatógenos son: micoparasitismo, producción de antibióticos, competencia por espacio y nutrientes. Además se ha comprobado que algunas especies promueven el desarrollo de la planta e inducen en ellas mecanismos de defensa contra patógenos (Howell, 2003; Vinale et al., 2008).

Como primer paso para el desarrollo de un método de biocontrol para el manejo de la enfermedad del agave tequilero, se aislaron cepas de Trichoderma de suelos cultivados con agave tequilero en la región Los Altos Sur, en el estado de Jalisco (Sánchez et al., 2007), donde la enfermedad "marchitez del agave" se encuentra distribuida.

Los objetivos del presente trabajo fueron: i) identificar los aislamientos de Trichoderma mediante estudios morfológicos y algunos con secuenciación y análisis de ADN y ii) evaluar in vitro la capacidad inhibitoria de cada una de las especies de Trichoderma identificadas sobre Th. paradoxa.

Materiales y métodos

Sesenta y cinco cepas se incluyeron en este estudio (Tabla 1), las cuales fueron aisladas de muestras edáficas colectadas en 28 plantaciones comerciales de agave "azul", ubicadas en las comunidades de Acatic, Las Motas, Tepatitlán y Arandas en el estado de Jalisco, México (Sánchez et al., 2007). Todas las cepas se depositaron en la colección de United States Department of Agriculture, Systematic Botany and Mycology Lab., Beltsville, Maryland, USA, en donde se conservan a 5°C en tubos con medio harina de maíz agar y en nitrógeno líquido con glicerol al 10%.

Determinación taxonómica mediante caracteres morfológicos

Las observaciones morfológicas se realizaron en micelios de Trichoderma cultivadas en harina de maíz agar más dextrosa (HMD). Este medio se preparó de la siguiente manera: 17 g de harina de maíz agar y 20 g de dextrosa se disolvieron en 1000 ml de agua destilada. Las cajas Petri se incubaron a 20°C con 12h luz y 12h oscuridad por 7 días. Se registró la apariencia del micelio, la presencia y la forma de las pústulas, la pigmentación y el aroma del medio.

Las características de los conidióforos, células conidiógenas y clamidosporas fueron observadas con un microscopio compuesto, utilizando campo claro y contraste de fases. Se midieron 30 unidades de las siguientes estructuras: conidias (longitud y ancho); fialides (longitud, ancho y la base); ancho de la célula que soporta la fiálide y clamidosporas (longitud y ancho). Para la identificación de las especies de Trichoderma se usó la clave interactiva disponible en http://nt.ars-grin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm.

Determinación taxonómica mediante caracteres moleculares

Cada cepa de Trichoderma se cultivó en medio líquido de papa dextrosa (24 g en 1000 ml de agua destilada) en cajas petri (6 cm de diám.) por 3 días a 25°C. Se colectó el micelio y se transfirió a un tubo de centrifuga de 1.5 ml. Posteriormente el ADN se extrajo empleando un kit comercial PureGene con el protocolo descrito para tejidos de plantas (Dodd et al., 2002). La amplificación por PCR y secuenciación de una región nuclear del ADN ribosomal, que contuvo los genes: región espaciadora transcriptora interna (ITS), factor de elongación 1-α (tef1), actina (act), y calmodulina (cal), se efectuó en base a los métodos descritos por Samuels et al. (2006). Las secuencias obtenidas se compararon con secuencias de otras especies de Trichoderma incluidas en el GenBank utilizando la herramienta básica de búsqueda BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) disponible en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

De las 65 cepas estudiadas se seleccionaron algunas de ellas en base a las especies de Trichoderma identificadas, cuatro de T. longibrachiatum (una por cada localidad de muestreo), una de T. reesei, tres de T. harzianum y una de T. viridescens (V.S.L. 143 = G.J.S. 04-232), la cual fue aislada de una plantación ubicada en Tepatitlán por Sánchez et al. (2007) y reportada previamente por Jaklitsch et al. (2006). El hongo fitopatógeno Th. paradoxa empleado fue aislado de plantas de palma datilera enfermas, se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC MYA-1387), Manassas, Virginia, USA y se conservó en medio papa dextrosa agar (PDA) a 4°C.

Se empleó el método de membrana de celofán en cajas Petri (Dennis y Webster, 1971) para lo cual se cortaron membranas de papel celofán de 9 cm de diám., se hirvieron durante 10 min, se enjuagaron y se esterilizaron (121°C por 20 min) antes de ser colocadas sobre el medio PDA contenido en cajas Petri. Después se colocó un disco de 5 mm de diámetro con micelio de Trichoderma (tres días de edad) sobre el centro de cada membrana de celofán. Como testigo se colocó un disco de 5 mm de diámetro con micelio de Th. paradoxa (tres días de edad) sobre el centro de la membrana en lugar del antagonista. Las cajas se incubaron a 25°C por dos días en la oscuridad y después se retiró la membrana con el micelio del hongo adherido. Posteriormente, se colocó un disco de 5 mm de diámetro con micelio de Th. paradoxa (tres días de edad) sobre la superficie del medio PDA en el centro de la caja Petri. Se midió el diámetro del micelio hasta que el testigo cubrió completamente la superficie del medio PDA. El porcentaje de inhibición del crecimiento del micelio de Th. paradoxa, se determinó mediante la siguiente relación (Worasatit et al., 1994): % inhibición = [(D₁-D₂) / D₁] * 100.

Donde D₁ es el diámetro del micelio de Th. paradoxa creciendo en cajas Petri donde antes creció Th. paradoxa y D₂ es el diámetro del micelio de Th. paradoxa creciendo en cajas Petri previamente inoculadas con las especies de Trichoderma a valorar. Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con cuatro repeticiones y se realizó al menos dos veces. El análisis de varianza (ANOVA) se efectuó con el programa estadístico SAS (SAS version 6.12, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) y las medias fueron comparadas con la prueba de Tukey (α = 0.05). Los datos expresados en porcentaje fueron transformados (seno^-1 v x) antes de llevar a cabo el análisis.

Resultados

Identificación de Trichoderma

Sesenta cepas se identificaron como T. longibrachiatum, tres como T. harzianum, una como T. reesei y T. viridescens, basándose en los análisis morfológicos crecidos sobre medio HMD a 25 °C por una semana. T. longibrachiatum se encontró distribuida en las cuatro localidades, T. harzianum solamente en Arandas, T. reeseiy T. viridescens en Tepatitlán (Tabla 1).

Con el propósito de confirmar la determinación taxonómica realizada mediante caracteres morfológicos, 25 de los 60 aislamientos determinados como T. longibrachiatum se seleccionaron para una identificación mediante métodos moleculares usando la secuencia de su región ITS. La herramienta de búsqueda BLAST identificó positivamente a todas estas cepas. Posteriormente las secuencias de la región ITS de estos aislados se compararon con la secuencia ITS de la cepa ATCC 18648 de T. longibrachiatum identificada por el experto en el género (Samuels, 2006). De las 25 cepas, 20 tuvieron una homología del 100 %, cuatro del 99 % y una del 91 % a la cepa ATCC 18648. El análisis tipo BLAST de la cepa V.S.L. 74 reveló una identidad con 12 ITS de T. reesei o Hypocrea jerorina (estado sexual o teleomorfo de T. reesei) (Lieckfeldt et al., 2000). Para las tres cepas identificadas morfológicamente como T. harzianum, se amplificaron y secuenciaron los genes: ITS, tef1 , act y cal. Las secuencias obtenidas de los fragmentos ITS, tef1 y cal se compararon con las secuencias de la cepa G.J.S. 00-22 de T. harzianum (Chaverri et al., 2003) y la secuencia del gene act con la cepa G.J.S. 90-22 de Hypocrea lixii (estado sexual de T. harzianum), las cuales fueron identificadas por especialistas en el género (Samuels, 2006). Ninguna de las tres cepas investigadas mostraron una homología idéntica con los cuatro fragmentos secuenciados a las cepas G.J.S. 00-22 y G.J.S. 90-22. Las secuencias de la región ITS de las cepas V.S.L. 282, V.S.L. 291 y V.S.L. 292 presentaron una homología del 99 % a la cepa G.J.S. 00-22. La secuencia del gene tef1 de V.S.L. 282 presentó la homología más alta (90 %) a la cepa G.J.S. 00-22, mientras que el resto de las cepas tuvieron un porcentaje de similitud del 89 %. La secuencia del gene act de nuestras cepas de T. harzianum mostraron una homología del 95 al 96 % con la cepa G.J.S. 90-22. En el caso de la secuencia del gene cal, la cepa V.S.L. 282 mostró la homología más alta (97 %) a la cepa G.J.S. 00-22, siguiendo las cepas V.S.L. 292 y V.S.L. 291 con un 96 y 95% respectivamente. En base a los análisis de la secuencia de DNA de cuatro genes (ITS, tef1, cal y act) estas cepas se identificaron como T. harzianum.

De acuerdo a los análisis estadísticos, se encontraron diferencias significativas entre las especies de Trichoderma en su habilidad para inhibir el crecimiento de Th. paradoxa (Tabla 2). Las cepas de T. longibrachiatum mostraron ser las más antagónicas. Dos de las cuatro cepas evaluadas inhibieron completamente el crecimiento de Th. paradoxa y las otras dos inhibieron en porcentajes de 95.60 y 87.52. Mientras que la cepa V.S.L. 143 de T. viridescens y la cepa V.S.L.74 de T. reseei inhibieron el crecimiento del fitopatógeno en un 87.52 y 80.27 %, respectivamente. Por otra parte, se observó un bajo porcentaje de inhibición (4.65 al 10.22 %) de las cepas de T. harzianum.

Discusión

El método principal para la identificación de especies de Trichoderma es mediante caracteres morfológicos, cada especie descrita en la literatura tiene características distintivas que nos ayudan en su diferenciación. Debido a que se siguen estudiando nuevas especies, las características morfológicas ya no son suficientes para definir otras especies, y ahora se tienen que analizar secuencias de varios genes incluyendo ITS, tef1, act, y cal, siendo el gene tef1 con mayor capacidad para reflejar diferencias entre especies estrechamente relacionadas (Samuels, 2006).

Basándose por una combinación de características morfológicas, por análisis y secuenciación de algunos genes, se identificaron cuatro especies en el ecosistema del agave tequilero: T. harzianum, T. reesei, T. viridescens y T. longibrachiatum, siendo esta última la especie más ampliamente distribuida en la zona de estudio. Estos resultados sugieren que las condiciones fisicoquímicas que prevalecen en el suelo donde se cultiva el agave tequilero en dicha región, favorece en particular el dominio de T. longibrachiatum.

T. longibrachiatum y T. harzianum son especies que se encuentran ampliamente distribuidas en diferentes habitats en el mundo (Samuels, 2006), T. harzianum es considerado como cosmopolita y es la más utilizada como agente de biocontrol contra varios fitopatógenos (Samuels, 1996; Chaverri et al., 2003), sin embargo, en este estudio sólo se identificaron tres cepas de esta especie. En México, estas dos especies han sido aisladas de suelos cultivados con mango en Colima (Michel-Aceves et al., 2001). T. viridescens también tiene una amplia distribución, pero es más común en regiones templadas (Jaklitsch et al., 2006), en este trabajo se corroboró la identificación de la cepa V.S.L. 143 de T. viridescens reportada por Jaklitsch et al. (2006) y los resultados obtenidos coinciden con la descripción morfológica realizada por estos autores. A nuestro conocimiento es la primera cepa de México que se identifica como T. viridescens. Mientras T. reesei presenta una distribución reducida, la mayoría de las cepas se han aislado de regiones que se encuentran dentro de la línea ecuatorial (Samuels, 2006), y otras se han aislado de regiones geográficas que incluyen el hemisferio sur (Lieckfeldt et al., 2000) y la que se identificó en esta investigación que corresponde al hemisferio norte. Esta especie es de gran importancia industrial debido a que ha sido utilizada para la producción de grandes cantidades de celulasas.

El experimento de antibiosis mostró que cepas de T. longibrachiatum inhibieron completamente el crecimiento de Th. paradoxa indicando la eficacia de los metabolitos producidos por el antagonista. Comparativamente, Sánchez et al., (2007) obtuvieron resultados similares al evaluar nueve cepas de T. longibrachiatum contra Th. paradoxa, donde todas las cepas del antagonista produjeron metabolitos no volátiles que inhibieron totalmente el crecimiento del patógeno. Otros trabajos con experimentos similares al presentado anteriormente, mostraron una inhibición total en el crecimiento de Rhizoctonia solani por T. koningii (Worasatit et al., 1994), R. cerealis por T. atroviride y T. harzianum (Innocenti et al., 2003), y Moniliophthora roreri por T. theobromicola (Samuels et al., 2006). La habilidad de algunas especies de Trichoderma para inhibir el crecimiento de fitopatógenos, es atribuida a la síntesis de un amplio rango de sustancias antibióticas (Reino et al., 2008). Lumsden et al. (1992) reportaron que la gliotoxina (producida por T. virens) mostró un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de Pythium ultimum y R. solani. Worasatit et al. (1994) reportaron que el metabolito pirona producido por T. koningii, fue el responsable de la inhibición del crecimiento de R. solani. Otros estudios reportaron que la atroviridina y neoatroviridina producidos por T. atroviride exhibieron fuerte actividad antifúngica contra Curvularia inaqualis, Colletotrichum dematium y F. oxysporum y moderada actividad contra Verticillium dahliae, Aspergillus niger y Cladosporum sp. (Oh et al., 2002). Estos estudios podrían explicar la inhibición del crecimiento de Th. paradoxa por la producción de metabolitos con actividad antibiótica sintetizados por T. longibrachiatum.

Nuestros resultados indican que T. longibrachiatum es un promisorio candidato para el biocontrol del fitopatógeno Th. paradoxa. Sin embargo, no se recomienda su empleo como agente de biocontrol en campo, debido a que es la especie más comúnmente identificada como el agente causal en la mayoría de las micosis reportadas, particularmente en pacientes inmunocomprometidos e inmunosuprimidos (Druzhinina et al., 2008). No obstante, T. longibrachiatum podría considerarse como una fuente de metabolitos con actividad antibiótica, para lo cual se requiere realizar estudios para aislar y caracterizar los metabolitos implicados en la inhibición de Th. paradoxa. De esta investigación, la cepa V.S.L. 143 de T. viridescens y la cepa V.S.L.74 de T. reseei inhibieron más del 80% el crecimiento del fitopatógeno, las cuales se proponen como agentes potenciales de biocontrol del fitopatógeno Th. paradoxa. Para complementar el control de la "marchitez del agave", además se requiere extender los muestreos a otras regiones productoras de agave tequilero, y para evaluar el efecto inhibitorio de las poblaciones de Trichoderma contra F. oxysporum el cual es considerado también como agente causal de la enfermedad.

Este trabajo de investigación fue financiado por el proyecto No. 42303-Z del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT). Se agradece al Dr. Gary J. Samuels y al Dr. Adnan Ismaiel (USDA-ARS) por su apoyo en la identificación de Trichoderma.

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