Virulencia y termotolerancia de cultivos monospóricos de Metarhizium anisopliae var. anisopliae de la mosca pinta (Hemiptera: Cercopidae)

Virulence and thermotolerance of monospore cultures of Metarhizium anisopliae var. anisopliae isolated from spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)

Conchita Toriello^{1 *}, Elena Montoya–Sansón¹, Monserrat Zavala–Ramírez^{1, 2}, Hortensia Navarro–Barranco¹, David Basilio–Hernández¹, Victor Hernández–Velázquez³, Teresa Mier²

¹ Depto. de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, UNAM. México D.F. 04510 México.

² Depto. El Hombre y su Ambiente, UAM–Xochimilco, México D.F. 04960 México.

*Autor para correspondencia:
toriello@servidor.unam.mx

Recibido 10 de agosto 2008
Aceptado 1 de diciembre 2008

Abstract

The virulence and thermotolerance of 18 monospore cultures of Metarhizium anisopliae var. anisopliae derived from isolates of the spittlebug (Aeneolamia sp.) in sugarcane were tested. Virulence was determined by the median lethal time (LT₅₀) in Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) pupae and thermotolerance by fungal growth at 25, 30, 35 and 40 °C. Thermotolerance of monospore isolates was studied by the diameter of the fungal colonies at day 14. Virulence results revealed EH–481/1, EH–469/6, EH–476/3, EH–474/6, EH–475/2 y EH–473/4, with a LT₅₀ of 5.19, 5.76, 5.97, 6.04, 6.15 and 6.53 days, respectively. The highest growth of isolates and of reference strain FI–1029, correspond ing to M. anisopliae var. anisopliae, same as the isolates from Mexico, occurred at 25 and 30 °C. Growth at 35 °C was very low, and no growth occurred at 40 °C. Results show the relevance of virulence and thermotolerance studies for strain selection to be used as biological control microbial agents.

Resumen

Se evaluó la virulencia y termotolerancia de 18 cultivos monospóricos de Metarhizium anisopliae var. anisopliae derivados de aislados originales de la mosca pinta (Aeneolamia sp.), plaga de la caña de azúcar. La virulencia de las diferentes cepas se determinó en pupas de Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) considerando el Tiempo Letal Medio (TL₅₀) y la termotolerancia durante el crecimiento de los cultivos monospóricos a 25, 30, 35 y 40 °C, considerando el crecimiento radial durante 14 días. De acuerdo con los resultados del TL₅₀ y la mortalidad acumulada, los aislados con mayor virulencia fueron EH–481/1, EH–469/6, EH–476/3, EH–474/6, EH–475/2 y EH–473/4, con TL₅₀ de 5.19, 5.76, 5.97, 6.04, 6.15 y 6.53 días, respectivamente. Los resultados de termotolerancia indicaron que el mayor crecimiento de los cultivos monospóricos y de la cepa de referencia FI–1029 correspondiente a M. anisopliae var. anisopliae fue igual a los aislados de México evaluados a 25 y 30 °C. El crecimiento de los aislados a 35°C fue menor, y a 40°C no hubo crecimiento. Se discute la relevancia de la virulencia y termotolerancia para la selección de cepas de hongos como agentes microbianos para el control biológico.

Palabras clave: control biológico, hongos entomopatógenos, plagas agrícolas.

Introducción

El hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae var. anisopliae (Metsch.) Sorokin es un biorregulador natural de la mosca pinta o salivazo de los pastos (Aeneolamia sp., Prosapia sp.) (Hemiptera: Cercopidae) el cual ha sido usado exitosamente para el control de esta plaga en Brasil (Sobral da Silveira, 1990), Trinidad (Allard et al., 1990), Australia (Samuels y Pinnock, 1990) y Guatemala (Toriello et al., 1999). A nivel mundial existen productos registrados a base de conidios de M. anisopliae (Jenkins y Gryzwacz, 2000) que representan una alternativa ecológica al uso de insecticidas químicos. En México, M. anisopliae se ha aplicado en programas de manejo integrado de la mosca pinta, insecto que afecta en promedio 150,000 ha de caña de azúcar (Flores, 1994; García de León y Mier, 2003; Leal–Guerra et al., 1998).

Con el fin de garantizar la calidad de un bioinsecticida biológico se requiere llevar a cabo estudios para seleccionar y caracterizar los aislados con mayor potencial. La efectividad de M. anisopliae var. anisopliae para el control del salivazo de los pastos, requiere de estudios interdisciplinarios que garanticen su eficacia bajo condiciones de campo, entre ellos, el desarrollo de técnicas para el monitoreo e identificación de aislados termotolerantes y con mayor grado de virulencia. La temperatura es un factor ambiental relevante que afecta la eficacia de los hongos entomopatógenos (Ayala–Zermeño et al., 2005; De Cross y Bidochka, 1999; Ouedraogo et al., 1997) así como la virulencia en insectos (Hajek y St. Leger, 1994; Liu et al., 2000; Torres de la Cruz et al., 2006). También la viabilidad de las esporas de los hongos es afectada cuando las formulaciones se exponen a altas temperaturas (Luz y Fargues, 1997), el crecimiento vegetativo (Ouedraogo et al., 1997), la tasa de penetración del tubo germinativo en el insecto (Xu et al., 2002) y la colonización y reproducción en los hospederos (Alves et al., 2002; Glare y Milner, 1991).

Asimismo, la temperatura y la humedad relativa del ambiente durante el periodo de almacenamiento y aplicación en el campo, pueden influir en la estabilidad de las formulaciones (Lecuona y Alves, 1995). Es fundamental considerar dichos factores durante la selección de aislados para el control biológico.

En el presente trabajo se estudió la variabilidad de 18 cultivos monospóricos de M. anisopliae var. anisopliae considerando su termotolerancia y su virulencia en pupas de Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae), utilizado como modelo experimental, con el objetivo de seleccionar cepas con alto potencial para el control biológico de la plaga de la mosca pinta.

Materiales y métodos

Hongo y condiciones de crecimiento

Los aislados de M. anisopliae var. anisopliae fueron obtenidos de adultos de la mosca pinta de los pastos (Aeneolamia sp.) infectados que fueron colectados en cultivo de caña de azúcar y otros provienen del Centro Nacional de Referencia de Control Biológico (CNRCB), SAGARPA–DGSV, Tecomán, Colima, México. Los cultivos monospóricos fueron obtenidos en el Laboratorio de Micología Básica, Facultad de Medicina, UNAM, y se conservan en agua destilada, aceite mineral y nitrógeno líquido a–196 °C. Para los diferentes ensayos se sembraron en medio APD (infusión de papa blanca 30 %, dextrosa 2 %, agar 1.5 %) y agar de Sabouraud–dextrosa adicionado de extracto de levadura (SDYA: peptona de soya 1 %, glucosa 4 %, extracto de levadura 1 % y agar 1 %). Se utilizaron 11 cepas de Entomopathogenic Fungi, United States Department of referencia del hongo (Tabla 1) de las colecciones de Agricultura (ARSEF–USDA) y del Commonwealth entomopatógenos del Agricultural Research Service of Scientific and Industrial Research Organization, Australia (CSIRO), representantes de los 10 clados (grupos) taxonómicos descritos por Driver et al. (2000), para comparar la termotolerancia con los aislados de México. Antes de realizar los bioensayos, la virulencia de las cepas fue reactivada en larvas de Tenebrio molitor Linneo (Coleoptera: Tenebrionidae).

Para el bioensayo de virulencia se utilizaron 16 cultivos monospóricos, y para los ensayos de termotolerancia se utilizaron 18 monospóricos y 11 cepas de referencia (Tabla 1)

Insectos

Como indicador biológico de la virulencia del hongo se usaron pupas de T. molitor (Alves, 1999). Los insectos fueron mantenidos en recipientes de plástico a temperatura ambiente y fueron alimentados con alimento para pollo estéril y agua. Después de establecida la cría, los insectos fueron separados de acuerdo a los estadios de larva, pupa y adulto. Durante el transcurso del experimento las condiciones de las pupas de T. molitor se mantuvieron idénticas a las mencionadas para la cría. La pupa del coleóptero T. molitor fue utilizada como insecto de elección para este estudio por reunir requisitos de cría y manejo sencillos, y además por presentar alteraciones definidas y fácilmente observables después de ser inoculado con M. anisopliae (Alves, 1999).

Bioensayos de virulencia

Para registrar el número de insectos muertos se revisaron diariamente utilizando un microscopio estereoscopio (Olympus SZ40). El criterio para establecer la muerte de la pupa fue la observación de crecimiento fúngico en una zona diferente a donde se había depositado el inóculo. Se corroboró la identificación del hongo específico mediante siembras de muestras en APD.

La virulencia fue determinada mediante el tiempo letal medio (TL₅₀) aplicando análisis Probit (Finney, 1972) con el paquete estadístico POLO PC (1987), con base en el porcentaje de mortalidad acumulada. Se aplicó un análisis de varianza (ANDEVA, α =5 %) univariado previa transformación de los datos a arcoseno (%)/100. En caso de observar diferencias significativas, se aplicó una prueba de comparación múltiple de medias de Tukey (Montgomery, 1991).

Termotolerancia

La determinación de la termotoleracia se llevó a cabo según el método de Driver et al. (2000) modificado. Se obtuvo una suspensión conidial de 10⁸ conidios/mL a partir de cultivos en APD de 10 días de crecimiento a 28 °C. En el centro de cajas de Petri (100 x 15 mm) con medio de SDYA se colocó un círculo de papel filtro estéril de 6 mm de diámetro y se impregnó con 2 µL de la suspensión conidial (2 x 10⁵ conidios). Se utilizaron cinco cajas por aislado y por cepa de referencia y se incubaron a cuatro diferentes temperaturas: 25, 30, 35 y 40 °C. El crecimiento fue medido diariamente considerando dos diámetros perpendiculares de las colonias, determinando el crecimiento radial por el promedio de los diámetros menos el diámetro del papel filtro. El análisis de los promedios del crecimiento radial se hizo a los 14 días de incubación.

Para determinar las variaciones en el crecimiento de los hongos a las temperaturas evaluadas se aplicó un análisis de varianza (ANDEVA) con los datos obtenidos a un nivel de significancia de α = 0.05. Cuando se encontraron diferencias significativas se aplicó la prueba de comparación múltiple de medias de Tukey. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo con el programa SPSS, versión 12, 2003.

Resultados y discusión

Tenebrio molitor (o escarabajo de la harina) ha sido utilizado como hospedero del hongo entomopatógeno M. anisopliae en diversos estudios de virulencia (Sosa Gómez, 1983; Vanninen et al., 1989) ya que es considerada una especie modelo para este tipo de estudios debido a su facilidad de manejo, a condiciones y requerimientos sencillos y de ciclo biológico simple (Sevala et al., 1994).

La virulencia de los aislados fúngicos fue determinada con base en su TL₅₀. Para considerar los aislados de mayor virulencia, se tomaron en cuenta también los límites de confianza del TL₅₀ y el análisis de varianza y pruebas de medias del porcentaje de mortalidad acumulada (Tabla 2). De acuerdo a la separación de medias de los datos de la mortalidad acumulada, los aislados con mayor virulencia fueron EH–481/1, EH–469/6, EH–476/3, EH–474/6, EH–475/2, EH–473/4, EH–468/1, EH–470/6 y EH–479/2 (Tabla 2). Sin embargo, dentro de estos aislados, los más virulentos son EH–481/1, EH–469/6, EH–476/3, EH–474/6, EH–475/2 y EH–473/4, debido a que caen dentro del intervalo de confianza de cada valor calculado de TL50 entre los aislados. Durante el bioensayo, en el aislado EH–481/1 con un TL₅₀ de 5.19 días, la mortalidad de las pupas comenzó a registrarse a partir del tercer día, mientras que el aislado EH–467/6 con un TL₅₀ de 7.69 días la mortalidad comenzó a registrarse hasta el quinto día. Por otro lado, el aislado EH–473/4, con un TL₅₀ de 6.53 días, fue el único que ocasionó en las pupas tratadas un 100% de mortalidad acumulada, y los insectos muertos comenzaron a registrarse entre los tres y cuatro días (Tabla 2). Los insectos del grupo testigo tuvieron un desarrollo normal y todas las pupas alcanzaron la fase de adulto.

El progreso de la infección del cultivo monospórico EH–481/1 en T. molitor fue gradual y la esporulación del hongo se expresó de manera marcada a los 9 días (216 h) del experimento (Figura 1). La presencia temprana de micelio en los últimos segmentos abdominales, área retirada de la zona de inoculación indicó que el hongo penetró por la cutícula, invadió el interior del insecto, y le causó la muerte, para luego salir y esporular sobre la superficie de la pupa (Figura 1). Cuando se sembraron en APD las muestras de las diferentes cepas del hongo que salieron sobre la superficie cuticular de las pupas tratadas, se observaron los conidióforos y conidios basípetos catenulados que son específicos y característicos de M. anisopliae var. anisopliae. En el testigo no se registraron pupas muertas e infectadas.

La mortalidad de los insectos está relacionada a la concentración de conidios de M. anisopliae (Butt y Goettel, 2000). En estudios previos utilizando Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae contra Conotrachelus psidii (Coleoptera: Curculionidae), se encontraron mortalidades entre 26.6 y 88.6% en diversos aislados (Brito et al., 2008). En Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae), se observó una mortalidad entre 11 y 34% al utilizar dosis entre 1.3 a 2.9 x 10⁷ conidios/mL con cinco cepas de M. anisopliae (De la Rosa Reyes et al., 1995). En nuestro trabajo, en infección de un coleóptero con M. anisopliae se alcanzó una mortalidad del 100% con un aislado, y para los demás, la mortalidad varió de 69 a 96 % pero nunca fue menor. La cantidad de conidios utilizada debe alcanzar cierta concentración para obtener una penetración efectiva del hongo en la cutícula del insecto y así ocasionar la muerte del hospedero (Zhioua et al., 1997).

Los cultivos monospóricos de M. anisopliae var. anisopliae que mayor crecimiento mostraron a 25 °C fueron EH–468/1 y EH–477/5 y el de menor desarrollo fue EH–472/6. Con respecto a las cepas de referencia incubadas a 25 °C, la que mayor crecimiento alcanzó fue FI–1029 proveniente de la colección CSIRO de Australia y que corresponde a M. anisopliae var. anisopliae (Tabla 1), especie igual a la estudiada en nuestro trabajo. La cepa 1941 de la colección ARSEF de Filipinas que corresponde a M. album (Tabla 1) mostró el menor crecimiento colonial a esta misma temperatura. Las diferencias observadas en el crecimiento a 25 °C fueron significativas tanto entre los aislados de México (F=226.602; g.l.=17,72; ρ<0.01), todos de M. anisopliae var. anisopliae, como entre las cepas de referencia (F=1126.871; g.l.=10, 44; ρ< 0.01), de diferentes especies de Metarhizium (Tabla 3).

El aislado de México que alcanzó el mayor desarrollo a 30°C fue EH–465/8, y los aislados que mostraron el menor desarrollo fueron EH–472/6 y EH–473/4 (Tabla 3). De las cepas de referencia la que mayor crecimiento alcanzó a esta misma temperatura fue la cepa FI–1029 (CSIRO) de Australia, misma de M. anisopliae var. anisopliae que tuvo el mejor crecimiento de las de referencia a 25° C. La cepa FI–698 (CSIRO, Nueva Zelanda) que corresponde a M. anisopliae var. novazealandicum mostró el menor desarrollo a 30 °C. Las diferencias observadas en el crecimiento a 30 °C fueron significativas tanto entre los aislados de México (F= 86.389; g.l. = 17, 72; ρ<0.01), todos de M. anisopliae var. anisopliae, como entre las cepas de referencia (F= 2988.797; g.l.=10,44; ρ<0.01), de diferentes especies de Metarhizium (Tabla 3).

A 35°C, los aislados de México que alcanzaron el mayor crecimiento fueron EH–468/1, EH–474/6, EH–479/2, EH–465/8 y EH–475/2 a diferencia de los aislados EH–466/2, EH–467/6, EH–478/1, EH–480/8 y EH–481/1 que mostraron el menor crecimiento (Tabla 3). A esta temperatura, el crecimiento de las cepas de referencia disminuyó considerablemente con excepción de las cepas FI–1029 (CSIRO) de Eritrea y 985 (ARSEF) de Australia que registraron un crecimiento intermedio. Estas dos cepas corresponden a M. anisopliae var. anisopliae (FI–1029), misma de los aislados de México y a M. anisopliae var. acridum de Australia. Las diferencias observadas en el crecimiento a 35 °C fueron significativas tanto entre los aislados de México (F=49.541; g.l.=17,72; ρ<0.01), todos de M. anisopliae var. anisopliae, como entre las cepas de referencia (F=74.087; g.l.=10, 44; ρ< 0.01), de diferentes especies de Metarhizium (Tabla 3). A 40 °C, ni los aislados de México ni las cepas de referencia tuvieron crecimiento.

De acuerdo con nuestros resultados, las temperaturas óptimas para el crecimiento de los aislados de México son 25 y 30 °C. Esto concuerda con los resultados de Berlanga–Padilla y Hernández–Velázquez (2002), quienes encontraron altos porcentajes de germinación en cultivos de M. anisopliae a 27 °C. Fargues et al. (1992) también reportó que M. anisopliae requiere para su crecimiento micelial una temperatura óptima entre 25 y 28 °C, mientras que los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana, B. brongniartii, Paecilomyces fumosoroseus y Nomuraea rileyi tienen un mayor desarrollo a 25 °C.

Los aislados que tuvieron el mayor crecimiento a 25 y 3 0 °C fueron colectados en regiones tropicales del estado de Veracruz (Tabla 1). Con respecto a las cepas de referencia, la que alcanzó un mayor crecimiento en estas temperaturas fue M. anisopliae var. anisopliae (FI–1029) proveniente de Eritrea (Tabla 1), con clima tropical. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Driver et al. (2000) quienes realizaron ensayos de termotolerancia con cepas representativas de diversos clados (grupos) del género Metarhizium, pues muestran la relación entre la región geográfica de procedencia de la cepa y su tolerancia a temperaturas asociadas a la región en donde fueron aisladas. Observaciones similares fueron obtenidas por Bidochka et al. (2001) quienes realizaron análisis de genética de poblaciones de 83 aislados de M. anisopliae, de un área forestal y otra agrícola de Ontario, Canadá. Los aislados se separaron en dos grupos, cada uno de los cuales estuvieron asociados a las condiciones del hábitat pero no al grupo de hospedero. En este mismo trabajo (Bidochka et al., 2001), las cepas provenientes del área forestal, crecieron en medios de cultivo a temperaturas bajas, aproximadamente a 8 °C; mientras que las cepas provenientes del área agrícola, crecieron a temperaturas mayores como 35 °C, y además estas mismas mostraron una mayor resistencia a la exposición de rayos UV.

En este estudio se muestra la variabilidad intraespecífica existente entre aislados de M. anisopliae var. anisopliae provenientes de tres estados mexicanos: Oaxaca, San Luis Potosí y Veracruz, considerando la virulencia en pupas de T. molitor y la termotolerancia a 25, 30, 35 y 40 °C durante el crecimiento. Con base en los resultados obtenidos concluimos que los aislados EH–481/1, EH–469/6, EH–476/3, EH–474/6, EH–475/2 y EH–473/4 de M. anisopliae var. anisopliae debido a su virulencia y buen crecimiento a 25, 30 y 35°C serían buenos candidatos para ser utilizados en el control microbiano de la mosca pinta; sin embargo, es necesario realizar estudios en condiciones de campo con el objeto de evaluar su eficacia.

Este trabajo fue llevado a cabo con el apoyo del CONACYT, megaproyecto grupal G–31451–B, en colaboración entre la UNAM, el CNRCB y la UAM–X.

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