Conectividad genética de Stegastes partitus en el Caribe Sur evidenciada por análisis microsatélite
Genetic connectivity of Stegastes partitus in the South Caribbean evidenced by microsatellite analysis
SP Ospina-Guerrero, RM Landinez-García, DJ Rodríguez-Castro, R Arango, E Márquez*
Grupo de Biotecnología Animal, Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Universidad Nacional de Colombia, Calle 59A No. 63-20, Medellín, Colombia. * E-mail: ejmarque@unalmed.edu.co
]]>Recibido en marzo de 2007.
Aceptado en marzo de 2008.
Resumen
La damisela bicolor Stegastes partitus (Poey 1986) ha sido utilizada como modelo en estudios de estructura poblacional de especies arrecifales para el diseño y monitoreo de áreas marinas protegidas. Los estudios con aloenzimas reflejan flujo genético entre poblaciones pero se ha sugerido que la ausencia de estructuración puede ser una consecuencia de la insensibilidad de los marcadores utilizados. En el presente trabajo se utilizaron 11 loci microsatélites polimórficos para evaluar la conectividad genética de la damisela bicolor en 299 individuos provenientes de cuatro áreas representativas del sur del Mar Caribe en Colombia (Santa Marta, Islas del Rosario, Capurgana e Isla de San Andrés). La genotipificación se realizó adoptando la metodología de detección por fluorescencia de múltiples alelos. La diferenciación genética entre las poblaciones geográficas y entre los diferentes escenarios oceanográficos se analizó utilizando el estadístico ΦST y el análisis de varianza molecular. La correlación entre la distancia genética y la distancia geográfica se exploró mediante el uso de la prueba de Mantel. Todos los loci fueron polimórficos, presentaron elevado número de alelos por locus y déficit de heterocigosidad con consecuente desviación del equilibrio Hardy-Weinberg. Se encontró evidencia de flujo genético entre las poblaciones geográficas y entre los escenarios oceanográficos analizados y ausencia de correlación entre la distancia genética y la geográfica. La información obtenida puede ser utilizada por las instancias encargadas del diseño y la conservación de áreas marinas protegidas y constituye un punto de partida para el seguimiento de la diversidad genética y la estructura de las poblaciones bajo estudio.
Palabras clave: flujo genético, diversidad genética, areas marinas protegidas, damisela bicolor.
Abstract
Bicolor damselfish Stegastes partitus (Poey 1986) has been used as a model for studies of the population structure of reef species as an aid for the designing and monitoring of marine protected areas. Studies using allozymes have shown gene flow between populations, but it has been suggested that the lack of structuring could be a consequence of the insensitivity of these markers. We used 11 polymorphic microsatellite loci to evaluate the genetic connectivity of 299 bicolor damselfish from four representative areas of the Colombian coast in the South Caribbean (Santa Marta, Rosario Islands, Capurganá, and San Andrés Island). Genotyping was made using detection by fluorescence of multiple alleles. Genetic differentiation among geographic populations and different oceanographic scenarios was analyzed using the statistic ΦST and analysis of molecular variance. The correlation between genetic and geographic distance was explored using the Mantel test. All loci were polymorphic, and showed a high number of alleles per locus and heterozygosity deficit with a consequent departure from Hardy-Weinberg equilibrium. We found evidence of gene flow between the geographic and oceanographic populations examined and a lack of correlation between the genetic and geographic distances. The information obtained can be used by the agencies responsible for the design and conservation of marine protected areas and as reference in the monitoring of the genetic diversity and structure of the population under study.
]]> Key words: gene flow, genetic diversity, marine protected areas, bicolor damselfish.
Introducción
La damisela bicolor Stegastes partitus (Poey 1986) es una de las especies más abundantes de las comunidades ícticas en los arrecifes coralinos del Atlántico occidental y del Caribe (Emery 1973). Presenta un estadio larval pelágico con gran capacidad de movimiento (Leis 1991, Leis y Stobutzki 1997, Leis y McCormick 2002) y en su estado adulto es territorialista (Harrington 1993); su biología básica ha sido ampliamente estudiada, por lo que ha sido utilizada como modelo en estudios de estructura poblacional de especies arrecífales con ciclos de vida similares para el diseño y monitoreo de áreas marinas protegidas.
Los estudios de la estructura poblacional de S. partitus han sido controvertidos dependiendo de la metodología utilizada. Las evidencias obtenidas a partir de modelos matemáticos basados en predicciones sobre circulación, transporte de larvas (Schultz y Cowen 1994, Cowen et al. 2000, 2002) y comportamiento larval (Paris y Cowen 2004), apoyan la idea de poblaciones poco dispersas (poblaciones cerradas), mientras que los estudios con aloenzimas apoyan la idea de poblaciones con alto flujo genético (poblaciones abiertas) y un acervo genético común geográficamente extenso con altas tasas de dispersión (Lacson et al. 1989, Lacson y Morrizot 1991, Lacson 1992).
Ambas aproximaciones metodológicas presentan limitaciones. Por ejemplo, se ha dicho que algunas predicciones de los modelos matemáticos no concuerdan con las observaciones en el campo en cuanto a las distancias de dispersión y distribución de larvas (Mora y Sale 2002), y en el caso de los estudios genéticos, se ha sugerido que la ausencia de estructuración puede ser una consecuencia de la insensibilidad de los marcadores utilizados (Shulman 1998).
Lo anterior motivó, en este estudio, el uso de marcadores más polimórficos para analizar la estructura de las poblaciones de S. partitus en el sur del Mar Caribe. El estudio de las poblaciones locales es importante porque no sólo depende del comportamiento biológico de la especie y las características físicas y oceanográficas locales, sino también de la escala espacial y temporal en las que son analizadas las poblaciones (Mora y Sale 2002). En este trabajo se analizó la diversidad genética y la influencia de algunas características oceanográficas y geográficas sobre el flujo genético de poblaciones de S. partitus provenientes de cuatro áreas coralinas representativas del sur del Mar Caribe, mediante el análisis de 11 loci microsatélite.
Materiales y métodos
Recolección de la muestra
]]> Se capturaron 299 individuos de S. partitus en cuatro áreas colombianas de arrecifes coralinos del sur del Caribe influenciadas por diferentes condiciones oceanográficas: Isla de San Andrés (Hans Key, Barco Hundido y San Luis), Islas del Rosario (Majayura, Isla Pirata, Punta Brava), Santa Marta (Cinto, Punta Betín, Playa del Pozo) y Capurganá (Isla Narza, El Aguacate, Cabo Tiburón) (tabla 1, fig. 1). El muestreo se realizó en sentido contrario al sistema de corrientes oceanográficas de la región, durante octubre de 2004, excepto en el caso de Punta Betín, sitio para el que se obtuvieron capturas previas y posteriores.
Las capturas se hicieron durante inmersiones de buceo autónomo colocando una bolsa plástica de 80 × 60 cm2 encima del territorio de cada pez y provocando respuestas defensivas hasta introducirlos en la bolsa. De los individuos recolectados se tomó 1 cm2 de aleta caudal y/o músculo y se preservó en DMSO hasta la extracción de ADN en el laboratorio.
Análisis de microsatélites
El tejido preservado se lavó con agua destilada y se maceró, y el ADN se extrajo siguiendo el protocolo para aislamiento de ADN de mamífero de alto peso molecular descrito por Sambrook et al. (1989), con una modificación en la etapa de precipitación proteica en la cual se utilizó cloroformo: alcohol isoamílico (24:1, Merck, Darmstadt, Alemania, y JT Baker, Phillipsburg, EUA). La cuantificación se realizó con el kit Fluorescent DNA Quantitation (Bio-Rad, Filadelfia, EUA). Se utilizaron los 11 cebadores y condiciones de amplificación previamente publicados por Williams et al. (2003) con modificaciones en la temperatura de alineamiento y las concentraciones de MgCl2.
Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen final de 10 μL, con amortiguador PCR 1X (Tris-HCl 200 mM, pH 8.4 y KCl 500 mM), 3 mM de MgCl2, 0.1 mM de dNTPs (Invitrogen, California, EUA), 0.5 μM de cada uno de los cebadores, 2% de formamida (Amresco, Ohio, EUA), 0.04 U de Taq DNA polimerasa recombinante (Invitrogen, California, EUA) y 30 ng μL-1 de ADN molde. El cebador derecho de todos los pares de cebadores fue marcado fluorescentemente con Cy 5.0 o Cy 5.5 (MWG Biotech, Atlanta, EUA).
Las reacciones de amplificación fueron programadas en un termociclador Biometra T3 Thermoblock (Göttingen, Alemania) con una pendiente de dos segundos y un perfil térmico que consistió de un ciclo a 92°C por 60 segundos, seguido por 30 ciclos de 10 segundos a 92°C, 10 segundos de alineamiento a la temperatura específica de cada cebador (62°C para SpAAC41 y SpGATA40, 59°C para SpAAC42, SpAAT39 y SpAAT40, 58°C para SpGATA16, SpAAC33, SpAAT9 y SpAAC47, 57°C para SpAAT33 y 52°C para SpAAC46) y 10 segundos a 72°C antes de la extensión final a 72°C por 10 minutos.
La desnaturalización del amplificado se realizó incubando a 80°C por 3 min una mezcla 1:1 del producto PCR con amortiguador desnaturalizante (99% formamida, Amresco, Ohio, y 0.1% azul de bromofenol Sigma, San Luis, Missouri, EUA). Los fragmentos se separaron en un secuenciador automático de ADN (Susol et al. 2000), Long-Read Tower System de Visible Genetics, Microcell 500, empleando SureFill al 6%, 1400 V, 56°C de temperatura del gel, 50% de poder del láser, un segundo de lectura en una corrida de una hora y en presencia de TBE 1 X. El tamaño de cada amplificado se determinó con el software Gene Objects (versión 3.0 de Visible Genetics), utilizando dos controles internos (241 y 250 bp o 167 y 180 bp) que migraban con cada una de las muestras. La muestra se consideró heterocigota cuando la altura máxima del pico menor fue superior al 70% de la altura máxima del pico mayor, en caso contrario o cuando un solo pico estuvo presente se consideró homocigota (Butler 2001). La detección de posibles errores de genotipificación se realizó en el programa Micro Checker (Oosterhout et al. 2004).
Análisis de datos
]]> La diversidad genética se estimó en la población total y en cada una de las subpoblaciones mediante el cálculo del promedio de alelos por locus, el número de loci polimórficos, la heterocigosidad media observada, la esperada, y el índice de fijación, utilizando el programa GenAlEx versión 6.0 (Peakall y Smouse 2006). También se calcularon tres índices de diversidad: a (Fisher et al. 1943), H' (Shannon y Weaver 1964) y S (Simpson 1949) con el programa EstimateS versión 7.0 (Colwell 2005). Las desviaciones del equilibrio Hardy-Weinberg se estimaron con el programa Arlequín versión 2000 (Schneider et al. 1997) utilizando la prueba exacta de Guo y Thompson (1992), cadenas de Markov con 1000 replicaciones y ajustando los valores de significancia con la prueba de Bonferroni (Rice 1989).Para evaluar la diferenciación genética de la población total, entre pares de poblaciones y entre escenarios oceanográficos se utilizó el estadístico ΦST y el análisis de varianza molecular AMOVA (Excoffier et al. 1992) del programa GenAlEx versión 6.0 (Peakall y Smouse 2006). La diferenciación genética debida al aislamiento por distancia se evaluó mediante el cálculo del coeficiente de correlación de rangos de Spearman y la significancia se determinó con 999 permutaciones usando el procedimiento de Mantel (Mantel 1967), del programa GenAlEx versión 6.0 (Peakall y Smouse 2006).
Resultados
Todos los loci fueron polimórficos, presentaron un tamaño alélico que varió desde 71 hasta 337 bp y un promedio de 31 ± 6 alelos/locus (rango 21 a 42), de los cuales SpGATA40, SpAAT9, SpAAT39 y SpAAC41 presentaron el mayor nivel de polimorfismo (tabla 2). El promedio de alelos por locus por población fue de 16.25 (rango 15 a 17) (tabla 3). Todos los loci microsatélite evaluados presentaron déficit de heterocigosidad con la consecuente desviación del equilibrio Hardy-Weinberg (P < 0.001; tablas 2, 3). Las cuatro áreas examinadas presentaron similitud en el grado de polimorfismo, el déficit de heterocigosidad y en los valores de los tres índices de diversidad (α, H' y S), a pesar de que éstos ponderan de manera diferente la riqueza y la frecuencia alélica (tabla 3).
En la población total el estadístico ΦST = 0.001 no fue significativamente diferente de cero (P = 0.074), lo que indica ausencia de diferenciación genética entre las poblaciones de esta región. Este resultado fue similar a lo encontrado cuando se realizaron las comparaciones por pares de subpoblaciones distanciadas geográficamente y por escenarios oceanográficos (tabla 4). No se encontró correlación significativa entre la distancia genética y la distancia geográfica (Rxy = 0.019, P = 0.250).
Discusión
En este estudio se encontró evidencia de flujo genético entre poblaciones de S. partitus en el sur del Mar Caribe analizando 11 loci polimórficos de ADN microsatélite. La muestra probablemente fue representativa de la diversidad genética de la especie en esta región, teniendo en cuenta el número de individuos analizados y las áreas evaluadas. El rango de tamaño de alelos y el promedio de alelos por locus (tabla 3) fueron similares a los previamente reportados por Williams et al. (2003), los cuales fueron de 77-337 y 31 ± 9, respectivamente. Sin embargo, en el presente estudio se encontró déficit de heterocigosidad en todos los loci evaluados, mientras que en el trabajo de Williams et al. (2003) este comportamiento se presentó en cinco de los loci examinados.
El déficit de heterocigosidad ha sido reportado en otros trabajos donde se realizó genotipificación automatizada de micro-satélites (Butler 2001) y ha sido explicado por la subestimación de alelos como consecuencia de la omisión de picos considerados como fantasmas (Shinde et al. 2003), la dominancia de alelos pequeños (Wattier et al. 1998) o la presencia de alelos nulos (Shaw et al. 1999). Se ha propuesto que estos errores de genotipificación pueden ser detectados por programas de computador con diferentes aproximaciones. En el caso particular del programa Micro Checker (Oosterhout et al. 2004), el análisis de los datos de este estudio indica la presencia de alelos nulos en los 11 loci o la posibilidad de eliminar picos fantasmas en siete de estos loci. Sin embargo, la alternativa de presentar alelos nulos en 11 loci de 299 individuos parece poco probable porque esto implicaría que cerca del 40% de los heterocigotos presentaron una mutación en el sitio de anclaje de cebadores que fueron desarrollados específicamente para esta especie.
]]> La otra posibilidad es que el déficit de heterocigosidad se deba a procesos biológicos tales como el efecto Wahlund, endogamia o apareamiento asociativo. El efecto Wahlund probablemente no explica estos datos debido a que no se encontró diferenciación genética entre poblaciones que habitan en diferentes condiciones oceanográficas ni entre poblaciones geográficamente distanciadas entre 227 y 832 km (tabla 4). Sin embargo, estos resultados podrían ser consecuencia de procesos endogámicos aun cuando no puede descartarse la existencia de apareamiento asociativo debido al comportamiento sexual de la especie que involucra varios aspectos en la selección del macho por parte de la hembra tales como la producción de sonido (Myrberg et al. 1986, Kenyon 1994, Myrberg 1997, Mann y Lobel 1997), el cuidado parental (Knapp y Warner 1991), la tasa de cortejo y las reservas de energía (Knapp y Kovach 1991, Knapp 1995), la supervivencia de los huevos (Knapp 1993) y la presencia de parásitos (Robinson 2005); pero se requieren trabajos adicionales que permitan aclarar estas dos ultimas hipótesis.Se ha sugerido que la falta de estructuración genética entre poblaciones se debe a la insensibilidad de los marcadores aloenzimáticos utilizados (Shulman 1998). Sin embargo, en el presente estudio también se encontró evidencia de flujo genético utilizando marcadores moleculares neutros y altamente polimórficos, capaces de detectar eventos recientes de diversidad genética. Los resultados genéticos en conjunto sugieren que las poblaciones de S. partitus del Caribe probablemente conforman una población con flujo genético, en contraste con los estudios de modelación matemática que se han realizado para esta misma especie en otras regiones del Caribe, en donde se sugiere que las poblaciones probablemente son cerradas (Schultz y Cowen 1994; Cowen et al. 2000, 2002; Paris y Cowen 2004).
La discrepancia anterior podría sugerir que los patrones de conectividad son bastante complejos y probablemente no sólo involucran aspectos de la estrategia de vida de las especies (larva pelágica con gran capacidad de movimiento), sino también algunos factores como huracanes, movimientos oceanográficos u otros eventos raros de dispersión, que no han sido considerados en los estudios de modelación y pueden estar permitiendo la conectividad encontrada en los estudios genéticos.
El papel de la estrategia de vida en los patrones de conectividad está apoyado por la observación de que, en el mismo escenario oceanográfico, el análisis de microsatélites evidenció flujo genético en la especie territorial S. partitus examinada en el presente estudio y estructuración genética en la especie demersal Lutjanus synagris (Landínez-García 2007). La estructuración genética también se ha detectado en la especie pelágica Coryphaena hippurus usando RFLP del gen mitocondrial NADH1 (Rocha et al. 2006), sugiriendo que los resultados no son probablemente una consecuencia de los marcadores genéticos utilizados. Sin embargo, sería recomendable monitorear el flujo genético espacial y temporal para descartar la posibilidad de que los datos reflejen evidencias circunstanciales de conectividad.
A pesar de las diferencias en la extensión coralina, el sistema de corrientes, las descargas hídricas continentales y las categorías de protección (tabla 2), las cuatro áreas coralinas evaluadas presentaron niveles semejantes de diversidad genética, por lo que sería conveniente realizar esfuerzos por mantener los niveles de conectividad actual. También sería recomendable adelantar estudios que permitan estimar el tamaño efectivo poblacional para detectar poblaciones que no podrían contrarrestar los efectos de la deriva en ausencia de flujo genético (Lacy 1987) y no perder de vista factores adversos como enfermedades (Schmale et al. 2002) o eventos catastróficos (Lacson y Morizot 1991) que podrían convertirse en una amenaza para estas poblaciones del Caribe por el efecto sinérgico.
Agradecimientos
La presente investigación fue financiada por el Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología "Francisco José de Caldas" (proyecto 1118-09-13537, contrato 181/2003) y la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín. Los autores agradecen a los buzos, los pescadores, el Instituto Colombiano de Desarrollo Rural, seccional San Andrés y la Unidad Administrativa Especial del Sistema de Parques Nacionales Naturales, territorial Caribe, los cuales colaboraron en la recolección de las muestras biológicas.
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