Crecimiento, consumo de nutrientes y composición próximal de Rhodomonas sp. cultivada con medio f/2 y fertilizantes agrícolas

Growth, nutrient uptake and proximate composition of Rhodomonas sp. cultured using f/2 medium and agricultural fertilizers

Enrique Valenzuela-Espinoza¹*, Fabiola Lafarga-De la Cruz², Roberto Millán-Núñez² and Filiberto Núñez-Cebrero¹

¹ Instituto de Investigaciones Oceanológicas

Recibido en marzo de 2004;
aceptado en septiembre de 2004.

Resumen

Se evaluaron el crecimiento, el consumo de nutrientes (PO₄^3-, NO₃^-, NH₄+) y la composición proximal de Rhodomonas sp. cultivada durante siete días en cultivos estáticos con medio f/2 y con fertilizantes agrícolas. El crecimiento resultó similar en ambos medios, con tasas medias de crecimiento de 0.37 y 0.38 día^-1. El contenido de proteínas de Rhodomonas sp. fue mayor en los cultivos con medio f/2 que en los cultivos con fertilizantes agrícolas, presentando valores medios de 10.7 y 8.96 pg célula^-1, respectivamente. Los carbohidratos y los lípidos disminuyeron durante la fase de crecimiento exponencial y no hubo diferencias (P = 0.027 y 0.08, respectivamente) entre tratamientos, mientras que en la fase de crecimiento lento los carbohidratos aumentaron resultaron mayores en las células cultivadas con medio f/2. Los lípidos presentaron poca variación durante la fase estacionaria, pero resultaron ser mayores en las células cultivadas con fertilizantes agrícolas. Durante los primeros cinco días de cultivo, el consumo total de fosfato por Rhodomonas sp. fue de 39.9 µM (94.3%) en medio f/2 y 40 µM (99%) en medio con fertilizantes. En los primeros cuatro días de cultivo en medio f/2 se consumió un total de 677.3 µM de nitrato (72.2%), mientras que en los primeros tres días en el medio con fertilizantes que contenía nitrato de amonio, el consumo de amonio (418.1 µM; 78.7%) fue mayor que el consumo de nitrato (37.7 µM; 7.3%). Sin embargo, cuando la concentración de amonio se redujo aproximadamente a 1.83 µM, el consumo de nitrato se incrementó. En ambos medios de cultivo la cantidad y calidad celular de Rhodomonas sp. obtenida fue similar, por lo que se concluye que los fertilizantes agrícolas pueden ser usados en programas de acuacultura marina.

Palabras clave: fertilizantes, consumo de nutrientes, composición proximal, Rhodomonas sp.

Abstract

Key words: agricultural fertilizers, proximate composition, nutrient uptake, Rhodomonas sp.

Introducción

Rhodomonas sp. es un alga unicelular flagelada perteneciente a las criptofítas, cuyo diámetro celular varia entre 9.2 y 9.9 µm. Esta microalga marina es utilizada para alimentar larvas de erizo (Rogers-Bennett et al., 1994), copépodos (Jónasdóttir, 1994), gasterópodos (Aldana-Aranda y Patiño-Suárez, 1998), larvas y juveniles de diferentes especies de ostión (Ferreiro et al., 1990; Brown et al., 1998; McCausland et al., 1999), y larvas de camarones peneidos (Stettrup y McEvoy, 2003). Para su cultivo se usa comúnmente alguna variante del medio f/2 (Guillard, 1975) que, en general, se prepara con sales de grado industrial o con fertilizantes, los cuales pudiera modificar el crecimiento y la composición bioquímica de las microalgas. Por esta razón, es necesario verificar el efecto de estas formulaciones de menor costo.

Existen estudios que han examinado el crecimiento de microalgas en medios de cultivo preparados con fertilizantes agrícolas (López-Elías y Voltolina, 1993; López-Ruiz et al., 1995; Nieves et al., 1996, 1998, 2000; Valenzuela-Espinoza et al., 1999; Simental-Trinidad y Sánchez-Saavedra, 2003). Otros han investigado como varía la composición bioquímica de diferentes especies de microalgas al cultivarlas en medios preparados con fertilizantes agrícolas (Simental-Trinidad et al., 2001; Valenzuela-Espinoza et al., 2002). También se han llevado a cabo estudios sobre el efecto de diferentes fuentes de nitrógeno en el crecimiento y la composición bioquímica del fitoplancton en cultivo (Lourenco et al., 2002). Estos estudios mencionan que la cantidad y calidad de la biomasa producida no se afecta por el uso de esta fuente de nutrientes. Sin embargo, pocos investigadores han considerado el uso de estos medios para el mantenimiento de los primeros niveles de cultivo, desconociéndose, además, su efecto en el cultivo de Rhodomonas sp. Por esta razón es necesario verificar de qué manera se pueden ver modificados el crecimiento, la composición bioquímica y el consumo de nutrientes de estas microalgas en distintos medios de cultivo, con la finalidad de aplicar esta información para eficientizar los programas de acuacultura marina comercial.

En este trabajo se presenta un estudio comparativo entre dos medios de cultivo para evaluar los cambios diarios en el crecimiento, consumo de nutrientes y contenido bioquímico de Rhodomonas sp. cultivadas en medio f/2 y con fertilizantes agrícolas, considerando la hipótesis de que la fuente de nutrientes puede originar cambios en el crecimiento y contenido bioquímico de estas microalgas marinas.

Materiales y métodos

Cultivo de microalgas

El crecimiento se verificó durante siete días en cultivos realizados en niveles de 0.15, 1.7 y 18 L de volumen, en todos los casos por triplicado. Para los dos primeros niveles de cultivo (Erlenmeyer y Fernbach) el medio y los recipientes se esterilizaron en autoclave a 121°C y 1.05 kg cm^-2 de presión por 10 min. Se utilizaron inóculos de 6, 156 y 1.856 mL para cada nivel, y para el tercero, antes de la inoculación el agua de mar se irradió con lámparas de luz UV y se trató químicamente (Pruder y Bolton, 1978). La irradiancia en cada nivel de cultivo, medida con un irradiómetro escalar PAR modelo QSL-100 (4π sensor, Biospherical Instruments) fue de 72.2, 99.3 y 110 ^mol quanta m^-2 s^-1. Las condiciones de cultivo en el caso del último nivel fueron: 4.5 L min^-1 de flujo de aire, pH de 7.99.0 y salinidad de 32.5 ± 0.5%o. Estas condiciones de cultivo se mantuvieron por siete días, en los cuales se cuantificó, diariamente y por duplicado para cada tratamiento (n = 3), la densidad celular con una cámara Neubauer de 0.1 mm de profundidad, observando mediante un microscopio compuesto (Bausch and Lomb). El pH se midió diariamente con un potenciómetro (Chemcadet Jr.), la temperatura con un termómetro (Ertco) y la salinidad con un refractómetro (Reichert-Jung). De los resultados de densidad celular se calculó la tasa de crecimiento específica (µ) mediante las ecuaciones descritas por Guillard (1973).

Métodos analíticos

Para determinar proteínas, carbohidratos, lípidos (peso fresco) y consumo de fosfato, nitrato y amonio, se recolectaron muestras diarias (250 mL) de microalgas, de densidad celular conocida, durante los primeros dos días de cada condición experimental (n = 3). De aquí en adelante, sólo se recolectaron muestras de 150 mL en el tercer día, de 100 mL del cuarto al sexto día y de 80 mL en el séptimo día. El filtrado fue a través de filtros de fibra de vidrio GF/C de 1.2 y 47 mm de diámetro, previamente incinerados a 450°C durante 24 h. La biomasa retenida en los filtros se enjuagó con formato de amonio (2%) y se colocó en tubos de ensayo con rosca de 20 mL y el agua del filtrado se recolectó en botellas de plástico de 250 mL. Las muestras fueron almacenadas inmediatamente a -60°C para su posterior análisis.

Previamente, se obtuvieron curvas de calibración para cada uno de los constituyentes celulares y los nutrientes. Fosfato y nitrato se analizaron de acuerdo con los métodos descritos por Parsons et al. (1985), mientras que el amonio se determinó de acuerdo con el procedimiento descrito por Grasshoff et al. (1983). Para los constituyentes celulares se usaron: albúmina bovina como estándar para proteínas, D-glucosa para carbohidratos y ácido esteárico para lípidos. La determinación se realizó en un espectrofotómetro Spectronic 21. Las proteínas fueron extraídas de acuerdo con el procedimiento descrito en Raush (1981) y cuantificadas por el método Bradford (1976). Los carbohidratos fueron cuantificados como glucosa por el método fenol-ácido sulfúrico (Kochert, 1978). Los lípidos fueron extraídos siguiendo el método de Bligh y Dyer (1959), y cuantificados por el método de Pande et al. (1963).

Análisis estadístico

Dado que los datos no presentaron una distribución normal ni igualdad de varianzas, se aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (α = 0.5).

Resultados

El crecimiento medio de Rhodomonas sp. cultivada con medio f/2 y fertilizantes agrícolas a nivel Erlenmeyer se observa en la figura 1. En ambos medios la densidad celular inicial fue 4.5 x 10⁴ células mL^-1. A partir de ese momento inició el crecimiento exponencial, con una duración de cuatro días para ambos tratamientos, presentando tasas de crecimiento de 0.72 y 0.75 día^-1 en el medio f/2 y con fertilizante agrícola, respectivamente. Al quinto día inició la fase de crecimiento lento en ambos tratamientos. La máxima densidad celular se obtuvo al séptimo día con 1.33 x 10⁶ y 1.43 x 10⁶ células mL^-1 en el medio f/2 y con fertilizante agrícola, respectivamente. Los cultivos a nivel Fernbach iniciaron con 1.17 x 10⁵ células mL^-1. El tratamiento con fertilizantes agrícolas presentó una fase de retardo de 24 h y, posteriormente, presentó crecimiento exponencial (µ = 0.72 día^-1), mientras que en el medio f/2 el crecimiento exponencial se produjo desde su inicio hasta el tercer día (µ = 0.53 día^-1). En ambos medios, la fase de crecimiento lento duró del tercero al sexto día, y a partir de este momento la densidad celular disminuyó (fig. 1). Las densidades máximas obtenidas en medio f/2 y con fertilizante agrícola fueron de 9.89 x 10⁵ y 1.05 x 10⁶ células mL^-1 respectivamente. Aunque las fases de crecimiento difirieron entre los niveles Erlenmeyer y Fernbach, no hubo diferencias significativas (P = 0.12) en la producción de biomasa entre los tratamientos en cada nivel.

En el nivel de 18 L los cultivos iniciaron con 1.08 x 10⁵ células mL^-1 (fig. 1). En él, las fases de crecimiento coincidieron en tiempo y duración entre tratamientos. Sin embargo, el cultivo con fertilizantes presentó fase de retardo. Al final de la fase exponencial (día 4) la densidad celular en el medio con fertilizantes fue significativamente mayor (P = 0.04) respecto a la obtenida en medio f/2. En esta fase, las tasas de crecimiento fueron 0.71 día^-1 con fertilizante agrícola y 0.63 día^-1 en medio f/2. Se obtuvieron densidades máximas de 1.49 x 10⁶ y 1.57 x 10⁶ células mL^-1 en medio f/2 y con fertilizantes agrícolas, respectivamente.

Consumo de fosfato (PO₄^3-)

En ambos tratamientos se observó un rápido consumo de fosfato durante los primeros cuatro días, el cual se relaciona directamente con el incremento en la densidad celular. Al cuarto día, el consumo acumulado de fosfato en el medio f/2 fue de 38.6 µM (91.4%), restando 3.66 µM de fosfato residual (8.6%). Asimismo, el consumo acumulado de fosfato en el medio con fertilizantes agrícolas fue de 40 µM (98.9%), quedando sólo 0.41 µM (1.1%) de fosfato residual. Durante el resto del cultivo (fase de crecimiento lento), debido a la diferencia en la concentración residual del fosfato en el medio entre tratamientos, el consumo resultó ser mayor en el medio f/ 2 respecto al medio con fertilizantes agrícolas (3.05 vs. 0.21 µM, respectivamente). La concentración residual final (día 7) de fosfato en los medios de cultivo fue 0.66 µM en el medio f/2 y 0.24 µM en el medio con fertilizantes agrícolas (fig. 2).

Consumo de nitrato y amonio (NO₃^- y NH₄⁺)

En el medio f/2 el nitrato disminuyó conforme transcurrió el tiempo de cultivo (fig. 3a), y para el quinto día sólo quedaba disponible 46.7 µM, lo que indica que durante el crecimiento exponencial hubo un consumo total de 891.3 µM (95%) de nitrato. En los cultivos con fertilizantes agrícolas, el amonio se consumió primero (fig. 3b). Así, mientras el amonio disminuyó durante los primeros tres días de cultivo (fase exponencial), la concentración residual de nitrato permaneció casi constante. Durante este tiempo, el consumo acumulado de amonio fue 418 µM (78.8%) y sólo se consumió 37.7 µM (7.3%) de nitrato. Una vez que la concentración de amonio en el medio disminuyó a 1.83 µM, el consumo de nitrato incrementó (fig. 3b). Durante el resto del cultivo, nitrato y amonio fueron consumidos simultáneamente, hasta alcanzar una concentración residual final de 12.7 y 1.1 µM, respectivamente.

En el medio f/2 el consumo total acumulado de nitrato para el séptimo día fue de 927.7 µM (98.9%), mientras que en el medio con fertilizantes agrícolas la población microalgal consumió 1032.9 µM (98.7%) de nitrato de amonio.

Contenido de proteínas

Al inicio del experimento se observaron valores máximos de 19.1 y 16.9 pg célula^-1 de proteína en el medio f/2 y con fertilizantes, respectivamente. En las primeras 24 h el contenido de proteínas permaneció constante y a partir de este momento su concentración disminuyó (fig. 4a). Después de 48 h y durante los siguientes cuatro días de cultivo no existió una variación significativa en la concentración de proteína, registrándose valores mínimos de 7.6 y 6.5 pg célula^-1 para el sexto día de cultivo en el medio f/2 y en el medio con fertilizantes. El contenido de proteínas por célula en el medio f/2 fue significativamente mayor (P = 0.04) que el obtenido con fertilizantes agrícolas.

Contenido de carbohidratos

El contenido de carbohidratos mostró una tendencia similar entre tratamientos respecto al tiempo de cultivo. Durante las primeras 24 h, que corresponden a la fase de inducción, se observó un incremento significativo de estos constituyentes (fig. 4b). En cambio, durante la fase de crecimiento exponencial, los carbohidratos disminuyeron de 38.6 a 10.4 pg célula^-1 en el medio f/2 y de 34.7 a 9.1 pg célula^-1 en el medio con fertilizantes. Sin embargo, durante la fase de crecimiento lento los carbohidratos en ambos tratamientos se incrementaron de nuevo, hasta valores de 28 y 23.3 pg célula^-1, respectivamente. Los contenidos de carbohidratos obtenidos en medio f/2 y con fertilizantes agrícolas mostraron diferencias significativas (P = 0.04) durante la fase de crecimiento lento (día 4-7), obteniéndose los mejores resultados en medio f/2 (fig. 4b).

Contenido de lípidos

En el cultivo en medio f/2 se observó un alto contenido de lípidos en las células utilizadas como inóculo (27.9 pg célula^-1; fig. 4c). Durante la fase de retardo y el crecimiento exponencial este constituyente había disminuido a 6.8 pg célula^-1 para el cuarto día. En la fase de crecimiento lento, el contenido de lípidos en células cultivadas con medio f/2 aumentó a 13.7 pg célula^-1.

En el medio con fertilizantes agrícolas (fig. 4c) el contenido inicial de lípidos fue 20.6 pg célula^-1. En el primer día la concentración celular de lípidos fue de 29.2 pg célula^-1, disminuyendo posteriormente a 12.4 pg célula^-1 en el segundo día de cultivo. A partir de ese momento el contenido de lípidos en las células cultivadas con fertilizantes se mantuvo casi constante, cuyo valor final fue 13.3 pg célula^-1. El análisis estadístico no mostró diferencias en el contenido de lípidos entre los tratamientos (P = 0.12).

Crecimiento microalgal

El crecimiento de Rhodomonas sp. obtenido en los dos primeros niveles de cultivo (Erlenmeyer y Fernbach) comprueba que el uso de fertilizantes agrícolas es una alternativa viable para el mantenimiento de cepas y la obtención de inóculos para volúmenes mayores de producción, debido a que la densidad celular obtenida con ambos tratamientos durante siete días de cultivo no presentó diferencias significativas.

En al nivel de 18 L se observó que, durante la fase de crecimiento exponencial, la densidad celular obtenida en medio con fertilizantes agrícolas fue significativamente mayor que con el medio f/2. Esto se tradujo en una tasa de crecimiento específica mayor en fase exponencial, lo cual se relaciona con el rápido consumo de amonio en el cultivo con fertilizantes (fig. 3b). Sin embargo, este efecto es parcial dado que la tasa media de crecimiento y el rendimiento final en biomasa de Rhodomonas sp. fue similar entre tratamientos (fig. 1). Este comportamiento en el crecimiento, cuando el nitrógeno está disponible en forma de nitrato de amonio, ha sido observado también en otras especies de microalgas como en Dunaliella tertiolecta (Syrett, 1981) y en el clon T-ISO de Isochrysis aff. galbana (Valenzuela-Espinoza et al., 1999).

Consumo de fosfatos (PO₄^3-)

El consumo de fosfato por Rhodomonas sp. en los primeros cuatro días de cultivo fue similar entre tratamientos. Además, en ese tiempo hubo un consumo superior al 90% del total en los cultivos (fig. 2). Lo anterior indica que esta microalga tiene la capacidad de utilizar indistintamente el fosfato monobásico de sodio (medio f/2) o el pentóxido de fosforo (del fertilizante agrícola) para su crecimiento y reproducción. A partir del cuarto día, cuando el fosfato residual del medio disminuyó a 3.66 µM en el medio f/2 y a 0.45 µM en el medio con fertilizantes, se presentó la fase de crecimiento lento, durante la cual se registraron tasas de crecimiento de 0.16 y 0.11 día^-1, respectivamente. Sin embargo, a pesar de que Rhodomonas sp. se encontraba en fase de crecimiento lento y la concentración de fosfato en el medio era baja, la división celular continuó hasta alcanzar su máxima densidad celular al séptimo día (fig. 1). El crecimiento de Rhodomonas sp. durante este periodo puede atribuirse a la existencia de fuentes endógenas de fosfato. Darley (1987) y Fogg y Thake (1987) señalan que cuando la concentración de fósforo en el medio de cultivo es alta, existe un consumo en exceso del nutriente, el cual es almacenado en la célula dentro de gránulos citoplasmáticos en forma de polifosfatos y puede ser utilizado posteriormente por el organismo cuando las concentraciones en el medio son limitantes.

Consumo de NO₃^- y NH₄⁺

Durante la fase de crecimiento exponencial la densidad celular se relaciona inversamente con la concentración de nutrientes en el medio, lo que ocasiona que la disponibilidad de nitrato por célula disminuya respecto al tiempo (fig. 3a). Valenzuela-Espinoza et al. (1999) han obtenido resultados similares para otra especie.

En el cultivo mantenido en medio con fertilizantes agrícolas no se observó un consumo significativo de nitrato durante los primeros tres días (fig. 3b). Estudios sobre el consumo de amonio y nitrato por diferentes microalgas demuestran que cuando estas dos fuentes de nitrógeno están presentes en el mismo medio de cultivo, el amonio es consumido preferentemente debido al menor costo energético que implica su consumo (Wheeler, 1983; Thompson et al., 1989; Dortch et al., 1991). También existe evidencia de que en muchas microalgas el consumo de nitrato es reducido e incluso inhibido en presencia de amonio, debido a que las enzimas requeridas para la reducción del nitrato son desactivadas por el proceso de asimilación del amonio (McCarthy, 1981; Syrett, 1981). Los resultados obtenidos en esta investigación muestran que a partir del tercer día, cuando la concentración de amonio en el medio disminuyó, el consumo de nitrato aumentó. Posteriormente, conforme transcurre el tiempo de cultivo, el amonio y el nitrato son consumidos simultáneamente (fig. 3b). Dortch et al. (1991) obtuvieron resultados similares a los de este estudio, e indicaron que a concentraciones menores de 1 µM de amonio en el medio se produce la forma activa de la nitrato reductasa y el consumo de nitrato comienza a ser importante.

Al comparar el consumo total de nitrógeno en ambos tratamientos se encontró un mayor consumo en el medio con fertilizantes. Sin embargo, esta diferencia no influyó en la densidad celular final ni en el contenido de proteínas de los cultivos. Debido a lo anterior, la diferencia en el nitrógeno consumido en el medio constituído con fertilizantes podría ser atribuída a la pérdida de amonio al disociarse en función de los cambios de pH en el cultivo (Conn et al., 1996) o a que las células hayan almacenado este nitrógeno en reservorios internos (Dortch et al., 1984), o a ambos.

Con respecto a la composición bioquímica de Rhodomonas sp., los contenidos de carbohidratos y lípidos fueron más elevados que los de proteínas al inicio del periodo de cultivo con ambos tratamientos. La elevada proporción de productos de reserva se debió a que la población algal usada como inóculo provenía de un cultivo en fase de decaimiento, durante la cual las células viables continúan fijando carbono, produciendo acumulación de carbohidratos y lípidos. Brown et al. (1993, 1997) consideran ques estos cambios se relacionan con la fase de cosecha y las condiciones de cultivo. En el primer día de cultivo en el nivel de 18 L no se observaron cambios en la densidad celular quizá porque el inóculo usado (Fernbach) no estaba en condiciones para dividirse debido a que el cultivo se encontraba en fase de decaimiento (fig. 1). Tampoco hubo cambios en el contenido de proteínas en ninguno de los tratamientos, pero los contenidos de carbohidratos aumentaron y los de lípidos pidos fueron mayores con los fertilizantes agrícolas (fig. 4).

Después de 24 h de cultivo inició el crecimiento exponencial en ambos medios, y las concentraciones de proteínas, carbohidratos y lípidos disminuyeron producto de la división celular de Rhodomonas sp. (fig. 4). Se encontraron diferencias significativas (P = 0.04) en el contenido de proteínas entre tratamientos. Los resultados de este estudio son comparables con los obtenidos por Gracida-Valdepeña (1999), Simental-Trinidad et al. (2001) y Valenzuela-Espinoza et al. (2002), quienes no encuentraron diferencias entre las tasas de crecimiento y las composiciones bioquímicas de microalgas cultivadas en medio f/2 y en medio con fertilizantes agrícolas. Nuestros resultados confirman la hipótesis de que el cultivo de Rhodomonas sp. con fertilizantes agrícolas produce biomasa y contenido de proteínas similares a los obtenidos con medio f/2. Lo anterior se apoya en los resultados de consumo de nitrógeno cuya concentración final residual en el medio f/2 y en el medio con fertilizantes fue similar.

Por otra parte, los carbohidratos y los lípidos disminuyeron durante la fase de crecimiento exponencial hasta el cuarto día de cultivo. En la fase de crecimiento lento se encontró un incremento en el contenido de carbohidratos, mientras que los lípidos presentaron poca variación. Esto se debe a que los carbohidratos actúan como productos intermedios de reserva, mientras que la síntesis de reservas lipídicas es una ruta metabólica que se activa a largo plazo. No obstante, se encontraron diferencias significativas (P = 0.04) en el contenido de carbohidratos entre tratamientos del cuarto al séptimo día de cultivo, tiempo en el cual la concentración celular de estos constituyentes fue mayor en las células cultivadas en medio f/2. Además, los resultados indican claramente que la composición bioquímica de Rhodomonas sp. está relacionada con la fase de crecimiento del cultivo o con el medio de cultivo (Valenzuela-Espinoza et al., 1999). Asimismo, los datos muestran que no existe una relación directa entre el consumo de nutrientes y el contenido de constituyentes bioquímicos, lo cual se atribuye a que la velocidad de incorporación de nutrientes es mayor que la velocidad de síntesis de los componentes bioquímicos. Por lo tanto, el consumo de nitrógeno y fósforo no necesariamente denotan necesidades metabólicas de las microalgas y es por ello que las células tienen reservas internas de nutrientes que son utilizados de acuerdo a sus necesidades fisiológicas. Se concluye que la cantidad y calidad celular de Rhodomonas sp. fue similar en ambos medios de cultivo y que, como con otras especies, los fertilizantes agrícolas pueden ser usados para el cultivo de esta microalga.

Referencias

Aldana-Aranda, D. and Patiño-Suárez, V. (1998). Overview of diets used in larviculture of three Caribbean conchs: Queen conch Strombus gigas, milk conch Strombus costatus and fighting conch Strombuspugilis. Aquaculture, 167: 163-178.         [ Links ]

Bradford, M. (1976). A rapid method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye-binding. Anal. Biochem., 72: 248-254.         [ Links ]

Bligh, E.G. and Dyer, W.J. (1959).). A rapid and sensitive method of total lipid extraction and purification. Can. Biochem. Physiol., 37: 911-917.         [ Links ]

Brown, M.R., Dunstan, G.A., Jeffrey, S.W., Volkman, J.K., Barrett, S.M. and Le Roi, J.M. (1993). The influence of irradiance on the biochemical composition of the prymnesiophyta Isochrysis sp. (clone T.ISO), Pavlova lutheri and Nannochloropsis oculata. J. Appl. Phycol., 5: 285-296.         [ Links ]

Brown, M.R., Jeffrey, S.W., Volkman, J.K. and Dunstan, G.A. (1997). Nutritional properties of microalgae for mariculture. Aquaculture, 151: 315-331.         [ Links ]

Brown, M.R., McCausland, M.A. and Kowalski, K. (1998). The nutritional value of four Australian microalgae strains fed to Pacific oyster Crassostrea gigas spat. Aquaculture, 165: 281-293.         [ Links ]

Conn, E.E., Stumf, P.K., Bruening, G. and Doi, R.H. (1996). Bioquímica Fundamental. Ed. Limusa, México, D.F., 736 pp.         [ Links ]

Darley, W.M. (1987). Biología de las algas: Enfoque fisiológico. Ed. Limusa, México, D.F., 236 pp.         [ Links ]

Dortch, Q., Clayton, J.R., Thoresen, S.S. and Ahmed, S.I. (1984). Species differences in accumulation of nitrogen pools in phytoplankton. Mar. Biol., 81: 237-250.         [ Links ]

Dortch, Q., Thompson, P.A. and Harrison, P.J. (1991). Short-term interaction between nitrate and ammonium uptake in Thalassiosira pseudonana: Effect of preconditioning, nitrogen source and growth rate. Mar. Biol., 110: 183-193.         [ Links ]

Ferreiro, M.J., Pérez-Camacho, A., Labarta, U., Beiras, R., Planas, M. and Fernández-Reiriz, M.J. (1990). Changes in the biochemical composition of Ostrea edulis larvae fed on different food regimes. Mar. Biol., 106: 395-401.         [ Links ]

Fogg, G.E. and Thake, B. (1987). Algal cultures and phytoplankton ecology. Univ. Wisconsin Press, 259 pp.         [ Links ]

Gracida-Valdepeña, M.L. (1999). Producción de tres especies de diatomeas utilizando una mezcla de fertilizantes agrícolas. Tesis de maestría, Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California, México, 108 pp.         [ Links ]

Grasshoff, K., Ehrhardt, M. and Kremling, K. (1983). Methods of Seawater Analysis. Verlag Chemie, 419 pp.         [ Links ]

Guillard, R.R.L. (1973). Division rates. In: J.R. Stein (ed.), Handbook of Phycological Methods. Culture Methods and Growth Measurements. Cambridge Univ. Press, Cambridge, pp. 289-313.         [ Links ]

Guillard, R.R.L. (1975). Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrate animals. In: W.L. Smith and M.H. Chanley (eds.), Culture of Marine Invertebrate Animals. Plenum Publishing Corp., New York, pp. 29-60.         [ Links ]

Jónasdóttir, S.H. (1994). Effects of food quality on the reproductive success of Acartia tonsa and Acartia hudsonica: Laboratory observations. Mar. Biol., 121: 67-81.         [ Links ]

Kochert, G. (1978). Carbohydrate determination by phenol-sulfuric acid method. In: J.A. Hellebust and J.S. Craigie (eds.), Handbook of Physiological and Biochemical Methods, Cambridge Univ. Press, Cambridge, pp. 96-97.         [ Links ]

López-Elías, J. y Voltolina, D. (1993). Cultivos semicontinuos de cuatro especies de microalgas con un medio no convencional. Cienc. Mar., 19(2): 169-180.         [ Links ]

López-Ruiz, J.L., García-García, R. and Ferreiro-Almeda, M.S. (1995). Marine microalgae culture: Chaetoceros gracilis with zeolitic product Zestec-56 and a commercial fertilizer as a nutrient. Aquacult. Eng., 14(4): 367-372.         [ Links ]

Lourenco, S.O., Barbarno, E., Mancini-Filho, J., Schinke, K.P. and Aidar, E. (2002). Effects of different nitrogen sources on the growth and biochemical profile of 10 marine microalgae in batch culture: An evaluation for aquaculture. Phycologia, 41(2): 158-162.         [ Links ]

McCarthy, J.J. (1981). The kinetics of nutrient utilization. In: T. Platt (ed.), Physiological Bases of Phytoplankton Ecology. Can. Bull. Fish. Aquat. Sci., 210: 211-233.         [ Links ]

McCausland, M.A., Brown, M.R., Barrett, S.M., Diemar, J.A. and Heasman, M.P. (1999). Evaluation of live microalgae and microalgal pastes as supplementary food for juvenile Pacific oyster (Crassostrea gigas). Aquaculture, 174: 323-342.         [ Links ]

Nieves, M., Voltolina, D., Sapién, M.T., Gerhardus, H., Robles, A.I. and Villa, M.A. (1996). Coltivazione di microalghe con fertilizzanti agricoli. Riv. Ital. Acquacolt., 31: 81-84.         [ Links ]

Nieves, M., Voltolina, D. and Barrrera, A. (1998). Un nuovo parametro per paragonare la crescita delle microalghe. Riv. Ital. Acquacolt., 33: 177-184.         [ Links ]

Nieves, M., Voltolina, D., López-Ruiz, J., Cisneros, M.A. y Piña, P. (2000). Cultivo de microalgas marinas con medios enriquecidos con productos de naturaleza zeolítica. Hidrobiológica, 10(1): 1-6.         [ Links ]

Pande, S.V., Parvin, R. and Venkitasubramanian, T. (1963). Microdetermination of lipids and serum total fatty acids. Anal. Biochem., 6: 415-425.         [ Links ]

Parsons, T.R., Maita, Y. and Lalli, C.M. (1985). A Manual of Chemical and Biological Methods for Seawater Analysis. 1st ed. Pergamon Press, 173 pp.         [ Links ]

Pruder, G.D. and Bolton, E.T. (1978). System configuration and performance: Bivalve molluscan mariculture. Proc. Ninth Annual Meeting World Mariculture Society, pp. 747-759.         [ Links ]

Raush, T. (1981). The estimation of micro-algal protein content and its meaning to the evaluation of algal biomass. I. Hidrobiología, 78: 237-251.         [ Links ]

Rogers-Bennett, L., Fasteneau, H.C., Hibbard-Robbins, T., Cain, Z. and Dewees, C.M. (1994). Culturing red sea urchin of experimental outplanting in Northern California. Final Report of Bodega Marine Laboratory, Santa Cruz University, USA.         [ Links ]

Simental-Trinidad, J.A. and Sánchez-Saavedra, M.P. (2003).The effect of agricultural fertilizer on growth rate of benthic diatoms. Aquacult. Eng., 27: 265-272.         [ Links ]

Simental-Trinidad, J.A., Sánchez-Saavedra, M.P. and Correa-Reyes, J.G. (2001). Biochemical composition of benthic marine diatoms using as culture medium a common agricultural fertilizer. J. Shellfish Res., 20(2): 611-617.         [ Links ]

Støttrup, J.G. and McEvoy, L.A. (2003). Live Feeds in Marine Aquaculture. Blackwell Science, 336 pp.         [ Links ]

Syrett, P.J. (1981). Nitrogen metabolism of microalgae. In: T. Platt (ed.), Physiological Bases of Phytoplankton Ecology. Can. Bull. Fish. Aquat. Sci., 210: 182-204.         [ Links ]

Thompson, P.A., Levasseur, E.L. and Harrison, P. J. (1989). Light-limited growth on ammonium vs. nitrate: What is the advantage for marine phytoplankton? Limnol. Oceanogr., 34(6): 1014-1024.         [ Links ]

Valenzuela-Espinoza, E., Millán-Núñez, R. and Núñez-Cebrero, F. (1999). Biomass production and nutrient uptake by Isochrysis aff. galbana (Clone T-Iso) cultured with a low cost alternative to the f/2 medium. Aquacult. Eng., 20: 135-147.         [ Links ]

Valenzuela-Espinoza, E., Millán-Núñez, R. and Núñez-Cebrero, F. (2002). Protein, carbohydrate, lipid and chlorophyll a content in Isochrysis aff. galbana (clone T-Iso) cultured with a low cost alternative to the f/2 medium. Aquacult. Eng., 25: 207-216.         [ Links ]

Wheeler, P.A. (1983). Phytoplankton nitrogen metabolism. In: E.J. Carpenter and D.G. Capone (eds.), Nitrogen in the Marine Environment. Academic Press, New York, pp. 309-346.         [ Links ]