Incidencia de Infecciones Virales Mezcladas en un Área de Producción de Fresa en Guanajuato, México

Incidence of Mixed Viral Infections in a Strawberry Producing Area in Guanajuato, Mexico

Carlos Alberto Contreras Paredes¹, Laura Silva Rosales¹, Violana Gallegos¹, M. Lucila Ortiz Castellanos¹, Alba Estela Jofre Garfias¹*, Pedro Antonio Dávalos González²

Departamento de Ingeniería Genética at Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN-Unidad Irapuato (Cinvestav Irapuato). Km 9.6, Libram. Nte. Irapuato, Guanajuato. CP 36821, México. *Corresponding author: ajofre@ira.cinvestav.mx

Recibido: Abril 10, 2014
Aceptado: Agosto 14, 2014

Resumen

Irapuato, en el estado de Guanajuato, fue el principal productor de fresa a nivel nacional. La pérdida de ese estatus fue debida a infecciones virales, entre otras causas. El virus del moteado de la fresa (SMoV), el del arrugamiento de la fresa (SCV) y el virus latente del anillo necrótico de la fresa (SLRSV) fueron encontrados previamente en Irapuato; sin embargo, la diversidad viral es aún desconocida. Este estudio se realizó en los municipios de Irapuato y Abasolo, en donde se había reportado su presencia. Detectamos siete especies virales en 57 muestras colectadas: SCV, SMoV, el virus críptico de Fragaria chiloensis (FClCV), el latente de Fragaria chiloensis (FClCLV), el asociado a la palidosis de la fresa (SPaV), el del choque necrótico de la fresa (SNSV) y el amarillamiento marginal tenue de la fresa (SMYEV). Éstos se encontraron en infecciones sencillas y en 24 mezclas, conformando el complejo viral local de fresa (LSVC). Los más abundantes fueron: SMoV, FClCV, SNSV y SMYEV. Se compararon las secuencias de nucleótidos de los aislamientos virales mexicanos con los de EE. UU.

Palabras clave adicionales: virus de fresa, infecciones virales mixtas.

Abstract

Additional keywords: strawberry viruses, mixed viral infections.

La fresa (Fragaria x ananassa Duch.) es una fruta pequeña de gran importancia en todo el mundo. México ha sido un importante productor de fresa durante muchos años (FAOSTAT, 2011). Aunque, existen 12 estados diferentes productores de fresa, sólo tres estados -Michoacán (Mich.), Baja California (BC) y Guanajuato (Gto.)- generan más del 90% de la producción nacional. Dentro de estos tres estados, las ciudades de Zamora en Mich., Ensenada en BC e Irapuato en Gto., son las más importantes. En la década de los 70's, Irapuato fue el principal productor, y ha sido históricamente una zona de producción de fresa en los últimos 100 años. Recientemente, la introducción de cultivos hortícolas nuevos y más rentables, tales como el brócoli y la coliflor, en la zona agrícola de Irapuato, han desplazado el cultivo de la fresa. Además, los problemas fitopatológicos, incluyendo las enfermedades virales, podrían haber desempeñado un papel importante influyendo en el desplazamineto de este cultivo.

En 1989 la incidencia de los virus dentro de los viveros de Irapuato varió del 10% - 67%. En los campos de producción, la incidencia fue aún mayor en las localidades (93% y 25%, respectivamente), según lo reportado por Teliz-Ortiz y Trejo-Reyes, (1989). En ese reporte, con el uso de injertos de plantas indicadoras se observaron dos virus en infecciones simples y mixtas: el virus del moteado (SMoV) y el del enrollamiento (SCV) de la fresa (Teliz-Ortiz y Trejo-Reyes, 1989). En otro estudio realizado en el 2004 en Irapuato, se detectó el virus de la mancha anular latente (SLRSV) mediante ELISA (Pérez-Moreno et al., 2004). Nuestro grupo ha reportado infecciones virales de la fresa con hasta seis especies diferentes en una muestra de una pequeña área de producción en el centro de México (SilvaRosales et al., 2013). Por último, existen resportes de infecciones virales mixtas en plantas de fresa en los EE.UU. (Martin y Tzanetakis, 2006) y en Europa (Fránová-Honetslegrová et al., 1999). En este estudio, se realizó una investigación en Irapuato utilizando 11 diferentes pares de cebadores (primers) diseñados para detectar varios virus encontrados en los EE.UU.: SLRSV (Postman et al., 2004), el del choque necrótico (SNSV) (Tzanetakis et al., 2001), el clorótico moteado de la fresa (SCFaV) (Tzanetakis and Martin, 2007), el virus del falso amarilleo de la remolacha (BPYV) (Tzanetakis et al., 2003), el latente de Fragaria chiloensis (FClLV) (Tzanetakis and Martin, 2005b), el de la palidosis asociada a la fresa (SpaV) (Tzanetakis et al., 2004), el críptico de Fragaria chiloensis (FClCV) (Tzanetakis and Martin, 2005a), SMoV (Martin et al., 2009), el virus de la rizadura (SVBV), SCV y el del amarillamiento marginal tenue (SMYEV) (Thompson et al., 2003). Algunos de estos virus fueron detectados en infecciones simples o mixtas conformando el "complejo local viral de la fresa en Irapuato" (LSVC). Con el fin de tener una valoración inicial de la diversidad viral y la variabilidad del LSVC en Irapuato, México, las secuencias de algunos segmentos virales amplificadas fueron obtenidas y se compararon con los reportados en EE.UU.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal. Se recolectaron un total de 57 muestras de fresas de las variedades "Camino Real", "Festival" y "Sweet Charlie", así como algunos clones resultantes de un programa local de mejoramiento desarrollado entre el INIFAP y el CIVESTAP-Irapuato. Todas las muestras se recolectaron en un área de 851 kilómetros cuadrados en la ciudad de Irapuato. Los clones UC-4 y UC-10 se cultivaron al mismo tiempo como indicadoras de las infecciones virales en una de las locaciones llamada "La Mocha". Se ha reportado previamente que estas líneas de cultivares mostraron los síntomas virales característicos cuando se infectaron con algunos patógenos, incluyendo algunos virus (Yoshikawa and Converse, 1990; Welsh-Assembly-Goverment, 2010). La UC-4 es susceptible a SCV, SMYEV y SMoV, y la UC-10 es susceptible a SPaV (Yoshikawa and Converse, 1990; Welsh-Assembly-Goverment, 2010).

Muestreo. Se recolectaron hojas de plantas con síntomas virales en plantaciones experimentales y comerciales de 13 lugares diferentes en áreas de Irapuato y Abasolo, en el estado de Guanajuato, durante las temporadas de cosecha 2007-2008, 2008-2009 y 2012-2013 (abril y diciembre de 2007, julio y diciembre de 2008 y julio del 2013), conformando cinco conjuntos diferentes de muestras (Cuadro 1). El número de áfidos (vectores de transmisión de virus) se registró en cada lugar de acuerdo con Holman et al., (1991), junto con una escala hedónica de vigor de la planta, con valores asignados de la 5, donde 1 corresponde al más débil y 5 al más fuerte.

Aislamiento de ARN total. La extracción del ARN total se realizó de acuerdo a lo descrito por Halgren et al., (2007), donde 150 mg de tejido foliar se molieron y homogeneizaron con 1 mL de amortiguador de extracción (200 mM Tris-HCl, 300 mM LiCl, 1.5% de litio-dodecil-sulfato, 10 mM EDTA, 1% de desoxicolato de sodio, 2% de polivinilpirrolidona, 1% Tergitol NP-40 y 1% de 2-mercapto-etanol) después de la centrifugación (16000 xg durante 20 min). Se recolectó el sobrenadante y se añadió un volumen igual de acetato de potasio 6 M, pH 6.5. La mezcla se incubó a -20°C durante 30 min y se centrifugó a 16000 xg durante 10 min. El ARN se precipitó con alcohol isopropílico frío por centrifugación a 16000 xg durante 20 min. El sedimento se resuspendió en 500 μL de solución de lavado (Tris 10 mM, EDTA 0.5 mM, NaCl 50 mM y etanol al 50%). El sedimento final que contenía el ARN se resuspendió mediante la adición de una solución de Tris-EDTA y 25 μL de leche de sílice/vidrio. Para finalizar, se realizó una centrifugación más a 2375 xg durante 10 seg, según lo sugerido por Rott and Jelkmann (2001), y modificado por Tzanetakis et al., (2005). La concentración de ARN se cuantificó por medición de absorbancia a 260 nm y su calidad se verificó por electroforesis en un gel de agarosa al 1%.

Las secuencias de nucleótidos de los fragmentos virales se obtuvieron después de la amplificación PCR y se clonaron en el pJET1.2/blunt CloneJET PCR Cloning Kit (Fermentas). Se curaron las secuencias y se depositaron en la base de datos GenBank con los siguientes números de acceso: FClLV (JQ629412), SCV (JQ629413), SMoV (JQ629414), SMYEV (JQ629417), SNSV (JQ629415) y SPaV (JQ629416). El fragmento obtenido después de la amplificación del FClCV fue de 152 pb de longitud y no cumplió con los requisitos de GenBank para ser incluido en la base de datos (por lo menos 200 pb).

RESULTADOS

Análisis de los síntomas. Se analizaron 57 muestras de fresas provenientes de Irapuato y Abasolo. Cuarenta correspondieron a las variedades comerciales 'Camino Real', 'Festival' y 'Sweet Charlie', y doce fueron clones desarrollados dentro de un programa local de mejoramiento de fresas locales. Las fresas UC-4 y UC-10 se cultivaron al mismo tiempo, como plantas indicadoras de infecciones virales, y sirvieron como un marcador indirecto para establecer cuales virus serían parte del LSVC. Durante el verano, las plantas UC-4 generalmente desarrollaron un enrojecimiento prematuro visible en los bordes de las hojas, el cual se extendió a lo largo de toda la hoja dándoles una apariencia de pseudo-latencia. Estas hojas infectadas murieron prematuramente y a la planta le crecieron hojas nuevas. Por lo general, estas hojas eran más pequeñas de lo normal, y en algunos casos, estaban arrugadas, deformadas, moteadas con manchas cloróticas o curvadas. Las plantas indicadoras infectadas UC-4 y/o UC-10, mostraron enfermedades crónicas durante tres o cuatro meses y luego murieron.

Se encontraron áfidos en casi la mitad de los sitios de muestreo y se identificaron utilizando una guía taxonómica para áfidos de la región (Holman et al., 1991). Las especies de áfidos predominantes fueron: Chaetosiphon fragaefolli (Cockerell), vector de SCV y SMYEV, y Aphis gossypii vector para la transmisión del SMoV (Tzanetakis and Martin, 2013).

Diversidad viral asociada a los cultivos de fresa mexicana. La diversidad viral asociada a los cultivos de fresa mexicana es poco conocida. En este estudio, se analizaron 57 muestras de fresas procedentes de 13 ubicaciones diferentes en Irapuato y Abasolo, dentro de la subregión geográfica conocida como "El Bajío" (Cuadro 1). El análisis fué realizado después de la amplificación de fragmentos virales presentes en las muestras analizadas por PCR. Los resultados revelaron la presencia de siete especies virales diferentes: SNSV, FClLV, SPaV, FClCV, SMoV, SCV y SMYEV, ya sea en infecciones simples o mixtas. Cuarenta y siete muestras fueron positivas para al menos uno de los siete virus presentes, y 10 no dieron lugar a ningún producto viral amplificado, y, por lo tanto, fueron negativas. La presencia de FClCV fue asignado basándose en la secuencia del fragmento amplificado por PCR de 151 nucleótidos (AAGTCCGTGAGCACTGCCATGCCCGTGACGAATTACTCTGCCTTCGAATGCTCAATTTCCAGAATACGTCGTAGAATCTGGCG CAATGTCAACTTTGCGTGCACATTCCATTCACCAAGACGCTGGAATCAATTCCCGTTACTTGTATTCA) el cual fue idéntico al mismo tramo del segmento de ARN1 del único aislado de Chile (DQ093961.2) disponible en el NCBI (Tzanetakis and Martin, 2005a).

El SMoV (Secoviridae) se detectó en 31 de las 57 muestras analizadas (54%), dos miembros de la familia Bromoviridae, FClLV y SNSV, en 25 muestras (44%), SMYEV (Alphaflexiviridae) en 15 muestras (26%), SCV (Rhabdoviridae) en 1 6 muestras (28%), SPaV (Closteviridae) en 9 muestras (16%) y el FClCV en 14 muestras (24%).

Se identificaron 14 muestras infectadas con sólo un virus: ocho tenían SMoV, cinco tenían SCV y uno tenía SPaV. (Cuadro 3). Las 29 muestras restantes tenían infecciones mixtas con dos o más virus presentes en 23 combinaciones (C) (Cuadro 3). De las 14 muestras con dos virus, cinco contenían la combinación SMoV + FClCV (C1), dos con SMoV + SMYEV (C2), dos con SMoV + SNSV (C6) y dos con SMYEV + SNSV (C7). Las otras tres muestras contenían una combinación no repetitiva de FClCV + FClLV (C3), FClLV + SCV (C4) y SMoV + SPaV (C5). Doce muestras tenían mezclas de tres virus: dos con SMoV + FClCV + FClLV (C9), dos con SMYEV+ SNSV + SPaV (C10) y dos con SMoV + SCV+ SMYEV (C16). Los seis restantes tenían las combinaciones SCV+ SNSV+ SPaV (C8), SMoV + FClCV + SCV (C11), SMoV+ SNVS+ SPaV (C12), SMoV+ SCV+ SNSV (C13), SMoV+ FClCV+ SNSV (C14) y SCV+ SMYEV+ SNSV (C15). Adicionalmente, se observaron cuatro muestras únicas con mezclas de cuatro virus FClCV+ FClLV+ SMYEV+ SNSV (C17), SMoV+ SCV+ SNSV+ SPaV (C18), SMoV+ SMYEV+ SNSV+ SPaV (C19) y SMoV+ SCV+ SMYEV+SNSV (C20). Las dos muestras con cinco virus mixtos fueron: FClCV+ FClLV+ SCV+ SMYEV+ SNSV (C21) y SMoV+ FCICV+ FClLV+ SMYEV+ SNSV (C22). Por último, únicamente se encontró una muestra con seis virus: FClCV+ FClLV+ SCV+ SMoV+ SMYEV+ SPaV (C23) (Cuadro 4).

Con la finalidad de determinar la relación de las cepas virales que se encontraron con aquellas reportadas en los EE.UU., de donde provenían la mayoría de las plántulas, se compararon las secuencias parciales de los diferentes segmentos de los nucleótidos de las siete especies virales detectadas (Figura 1). No se observaron diferencias entre la secuencia de nucleótidos de SPaV parecida a HSP70 del aislamiento de EE.UU. (Tzanetakis et al., 2004) y el aislamiento encontrado en éste trabajo. El FClCV de esta región geográfica mostró dos diferencias con la secuencia de referencia del Chile (Tzanetakis et al., 2008): un nucleótido cambió y otro fue escindido en el ORF de la RdRp (ARN polimerasa dependiente de ARN). Se encontraron más diferencias de nucleótidos en el SMoV mexicano con ocho diferencias de nucleótidos en comparación con el 3 'UTR de su par chileno más similar (Thompson and Jelkmann, 2003). Todas las otras especies virales detectadas e identificadas en este estudio, mostraron diferencias de nucleótidos que resultaron en cambios de aminoácidos en diferentes ORFs en cuatro de las siete especies de México, en comparación con sus homólogos más cercanos: una sustitución de una asparagina en la región carboxi de la proteína de la cápside (CP) en lugar de una glutamina en el SNSV de EE.UU. (Tzanetakis et al., 2010). Se encontró una serina en lugar de una prolina en la misma región (CP), del virus del amarillamiento marginal tenue de la fresa de Alemania (Jelkmann et al., 1990), y una arginina en lugar de un ácido glutámico en la región media de la ARN polimerasa dependiente de ARN del FCILV de EE.UU. (Tzanetakis et al., 2008). Finalmente, dos cambios de aminoácidos se infirieron en la región central de la proteína L (ARN polimerasa de ARN) del virus del arrugamiento de la fresa; una leucina por una isoleucina; y una prolina en lugar de una arginina, en comparación con el aislado de Holanda (Klerks et al., 2004).

DISCUSIÓN

Cerca de 30 virus de ADN y ARN se han asociado a la fresa en todo el mundo (Tzanetakis and Martin, 2013), sin embargo, la diversidad viral asociada al cultivo de fresa es desconocido. En este trabajo, se detectaron siete virus en parcelas de fresa en una pequeña área del central estado mexicano de Guanajuato, en la región "El Bajío". Las infecciones mixtas no son nuevas en los campos de fresa, tal como lo muestran los reportes de la década de los 30's donde se propone la coexistencia de mezclas virales conformadas principalmente por el SCV (Martin y Tzanetakis, 2006). También por el SMYEV, SMoV, SPaV, virus latente C (SLCV) y SVBV han sido sugeridos por estar presentes en infecciones mixtas (Martin and Tzanetakis, 2006), pero no hay muchos reportes fuera de los EE.UU. que aborden este tema. En el presente estudio se encontró al SMoV presente con frecuencia en las infecciones mixtas. De las 22 plantas detectadas con infecciones mixtas, 15 de ellas incluyeron al SMoV. Esto no es de sorprenderse, ya que esta especie viral, junto con el SCV fue reportada por primera vez hace más de 20 años en esta área (Teliz-Ortiz and Trejo-Reyes, 1989). La prevalencia de infecciones mixtas parece ser un sello distintivo de las infecciones virales de la fresa. Hay dos factores que podrían haber influido en la prevalencia del SMoV y del SCV en esta región. La primera de ellas es la persistencia de las poblaciones de áfidos que pueden transmitir ambas especies virales (Martin and Tzanetakis, 2006). La presencia de vectores áfidos podría haber facilitado la amplia propagación de infecciones mixtas en el área de estudio, ya que aproximadamente el 75% de las muestras analizadas presentó infecciones mixtas. La segunda, son las prácticas agronómicas del cultivo. A pesar de que la planta certificada es importada de los EE.UU., las plantas son infectadas ya que algunos de los productores de la región tienen viveros de plantas en las proximidades cercanos al primer o segundo año de producción, actuando como reservorios del LSVC.

La mayoría de las infecciones mixtas se componía de tres o más diferentes especies virales, como se muestra por las dieciséis combinaciones virales diferentes (C8 a C23 en el cuadro 4), independientemente del cultivar de fresa evaluado. Las infecciones mixtas podrían verse favorecidas por la presencia de afidos transmisores de SCV, SMYEV, SMoV y mosca blanca, transmitiendo el SPaV. Además, el FClLV y el SNSV se transmiten por el polen. Los trips, los cuales fueron observados pero no registrados en este trabajo, también pueden contribuir a la propagación del SNSV. La fresa se cultiva en esta región durante todo el año. La presencia de hospederos alternativos durante todo el año en muchos lugares donde se cultive la fresa, como especies de Chenopodium entre otras, en esta región (Vibrans, 2012), podría facilitar la presencia de las especies virales detectadas.

A pesar de tener pequeños productos amplificados por PCR, con el conjunto de oligonucleótidos utilizado, la secuenciación directa e inversa confirmó la fiabilidad de los cambios observados a nivel de nucleótidos o de aminoácidos. La falta de cambios en el SPaV en el gen HSP70 podría indicar que, o bien la misma cepa está presente en México y en los EE.UU., o las plántulas importadas ya estaban infectadas con el virus al entrar al país. Los cambios silenciosos de nucleótidos, ya sea en las regiones no codificantes, como en el caso de SMoV o el FClCV, así como los no-silenciosos, como en el caso de SNSV, SMYEV, FClLV y el SCV, sugieren la diversificación de virus ya sea desde los primeros años después de primera introducción del virus, si se introdujo primero en plantas contaminadas, o bien derivados de plantas silvestres y malas hierbas en las inmediaciones del área de siembra.

La frecuencia de infecciones virales mixtas en la fresa, ya sean de material importado contaminado o bien de cepas virales preexistentes, enfatiza la importancia de utilizar nuevos métodos y más rápidos para garantizar que las plántulas de fresa importadas estén libres de virus. Las regulaciones fitosanitarias mexicanas requieren la evaluación in situ de los productos importados. Sin embargo, aunque a veces con la ayuda de técnicas de ELISA para detectar la presencia de algunos virus, las inspecciones han sido en su mayoría visuales. Este estudio sugiere la necesidad de desarrollar métodos de detección molecular para detectar cepas virales en todas las regiones productoras de fresa.

Infecciones individuales o mixtas de plantas que tienen hasta seis especies virales de SMoV, SCV, FCILV, SPaV, FClCV, SNSV y SMYEV, fueron encontradas en un área muy pequeña en el centro de México (región del Bajío), en 23 combinaciones diferentes. Sin embargo, el número de combinaciones virales no parece ser equivalente a la diversidad de síntomas virales probablemente como un reflejo de las relaciones virales sinérgicas o antagonistas o con la planta en el campo. Diferentes combinaciones virales, así como su orden de llegada al hospedero, producen diferentes respuestas en la planta como se ha observado para otros sistemas. En el presente estudio, el SMoV fue virus más frecuente por lo que se podría especular que la combinación de este virus con los otros seis virus restantes podría ser el responsable de los síntomas en la planta (Figura 2). Actualmente están en marcha experimentos más controlados con las diferentes combinaciones de virus para comprobar esta hipótesis.

Se observaron algunas modificaciones virales tales como mutaciones no silentes en cuatro especies virales (SNSV, SMYEV, FClLV y SCV) en comparación con sus contrapartes más similares, esto sería una posible señal de la adaptación de los virus a un nuevo ambiente en caso de que hubieran sido introducidos del extranjero. Además, estos cambios presentes en cualquiera de las proteinas estructurales (proteína de la cápside o CP) o de replicación (ARN polimerasa dependiente de ARN o RdRp) podrían ser de beneficio para que los virus prevalezcan (compitieran) con otros virus en el LSVC.

CONCLUSIONES

Por otra parte, se observaron algunos cambios en las secuencias virales obtenidas lo cual podría llevar a entender la relación entre virus y la planta en un nicho ecológico.

Agradecimientos. Esta obra fue financiada con el apoyo financiero de los proyectos no. 07-03-K662-051 A02 del Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología del Estado de Guanajuato (CONCYTEG) a AEJG, el 330/04 de "Fundación Produce Guanajuato, AC" para PADV y AEJG y el 2012-06-190290 de SAGARPA-CONACYT a LSR, PADG y AEJG. Estamos muy agradecidos con el Dr. Ioannis Tzanetakis por proporcionar algunos de los cDNAs que se utilizaron como controles positivos de los experimentos, y por la metodología de aislamiento del ARN. A Nélida Vázquez y Jimena Carrillo Tripp por su asistencia técnica con parte de los experimentos de PCR y la clonación de los fragmentos virales.

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