Detección de Infecciones Mixtas Causadas por Begomovirus y Curtovirus en Plantas de Chile para Secado en San Luis Potosí, México

Detection of Mixed Infections Caused by Begomovirus and Curtovirus in Chili pepper for drying plants in San Luis Potosi, Mexico

Luis Roberto Reveles Torres¹, Rodolfo Velásquez Valle¹, Jorge Armando Mauricio Castillo² y Silvia Salas Muñoz³

¹ INIFAP-Campo Experimental Zacatecas, Km. 24.5 Carretera Zacatecas-Fresnillo. Apdo. Postal # 18. Calera de V. R., Zacatecas, México. CP 98500, México. Correspondencia: velasquez.rodolfo@inifap.gob.mx

³ Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, San Luis Potosí, S.L.P., México, CP 78216, México.

Recibido: Junio 08, 2012
Aceptado: Septiembre 24, 2012

Resumen

Las infecciones virales son una de las enfermedades más importantes del chile para secado en el Norte Centro de México. Las infecciones virales mixtas son comunes en plantas de chile a nivel mundial, sin embargo, en San Luis Potosí, México se carece de información acerca de curtovirus y begomovirus infectando plantas de chile, por lo que el objetivo del presente estudio fue obtener información sobre la presencia de geminivirus infectando plantas de chile para secado que mostraban una sintomatología común. Se colectaron diez plantas de chile (Capsicum annuum "Mirasol") que mostraban síntomas típicos de amarillamiento y se analizaron mediante técnicas moleculares para detectar la presencia de begomovirus y curtovirus. Con respecto a curtovirus, se encontró al Beet mild curly top virus (BMCTV) en todas las muestras analizadas, mientras que los begomovirus Pepper huasteco yellow vein virus (PHYVV) y Pepper golden mosaic virus (PepGMV) se encontraron en ocho y diez del total de muestras colectadas respectivamente. Cabe resaltar que en solo dos de las diez muestras la presencia de PepGMV no estuvo relacionada con PHYVV.

Palabras clave: Amarillamiento, Infeccion viral mixta, Geminivirus, Detección molecular.

Viral infections are one of the most important diseases of chili peppers for drying in north central Mexico. Mixed viral infections are common in chili plants worldwide, however, in San Luis Potosi, Mexico there is no information about curtovirus and begomovirus infecting chili pepper plants; therefore, the aim of this study was to obtain information on the presence of geminivirus infecting chili for drying with a common symptomatology. Ten chili pepper plants (Capsicum annuum "Mirasol") with typical yellowing symptoms were collected and analyzed using molecular techniques to detect the presence of begomovirus and curtovirus. As for curtovirus, Beet mild curly top virus (BMCTV) was found in all samples analyzed, while as for begomovirus, Pepper huasteco yellow vein virus (PHYVV) and Pepper golden mosaic virus (PepGMV) were found in eight and ten of the total samples collected, respectively. It is important to mention that in only two of the ten samples PepGMV was present and it was not related to PHYVV.

Keywords: Yellowing, mixed viral infection, geminivirus, molecular detection.

Uno de los principales problemas que afectan al cultivo de chile para secado (Capsicum annuum L.) en el Norte Centro de México, que incluye el altiplano del estado de San Luis Potosí, es la incidencia de enfermedades de origen viral. Desde un punto de vista epidemiológico el fenómeno de infecciones mixtas, causadas por virus pertenecientes a la misma familia, es de particular importancia ya que favorece la recombinación genética, la cual puede contribuir a la aparición de variantes y cepas con mayor virulencia o, en el caso de Geminivirus, nuevas especies (Ala-Poikela et al., 2005). En el caso del cultivo de chile existe abundante información acerca de infecciones producidas por dos o más especies de begomovirus o combinaciones de dos o más virus de ARN (Abdalla et al., 1991; Méndez-Lozano et al., 2002; Velásquez-Valle et al., 2012a). En el estado de Zacatecas, México, Fraire et al. (2011) reportaron la infección mixta de plantas de chile por los virus huasteco de la vena amarilla del chile (Pepper huasteco yellow vein virus: PHYVV), del mosaico dorado del chile (Pepper golden mosaic virus: PepGMV) y del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus: CMV). Es notoria la falta de información acerca de infecciones complejas donde intervengan tanto begomovirus como curtovirus, ambos pertenecientes a la familia Geminiviridae cuya frecuencia de detección es creciente en México (Velásquez-Valle et al., 2012b; Chen et al., 2011) por lo que el objetivo del presente trabajo consistió en identificar la presencia de begomovirus y curtovirus en plantas de chile para secado que mostraban una sintomatología similar.

A mediados de Junio de 2010 se colectaron muestras de tejido joven de diez plantas de chile para secado tipo Mirasol seleccionadas al azar y que mostraban síntomas conspicuos de la enfermedad denominada amarillamiento del chile (Velásquez-Valle et al., 2011) en una parcela comercial localizada en el altiplano del estado de San Luis Potosí, México.

Para la detección de begomovirus y curtovirus, las muestras se molieron en presencia de nitrógeno líquido en morteros preenfriados a -20 °C. El tejido molido se transfirió a tubos de microcentrífuga de 1.5 mL para extraer DNA total de cada muestra, a continuación se agregaron 600 (xL de solución amortiguadora de extracción (1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl ph 8.0, 2 % CTAB (bromuro de hexacetil trimetil amonio) p/v, 1 % de β (3-mercaptoetanol) agitando la mezcla hasta homogeneizar. Las muestras se incubaron por 20 min a 65 °C con una leve homogenización cada 3 min. Después de la incubación se agregaron 600 µL de la mezcla cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y se mezclaron con agitación por 15 min. Los tubos se centrifugaron a 13,000 rpm por 15 min y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo conteniendo 600 µL de isopropanol frío. A continuación las muestras se mezclaron y se dejaron a temperatura ambiente por 5 min y posteriormente se centrifugaron a 13,000 rpm por 15 min; se descartó el sobrenadante y los tubos se invirtieron por 5 min para secar el DNA precipitado. Posteriormente el DNA se resuspendió en 100 µL de buffer TE (Tris- EDTA 0.01 mM pH 8.0) y 100 µL de etanol al 100 %. El BMCTV fue detectado por PCR usando los oligonucleótidos BMCTV CP4f (5'-CAG TAT CGA CCA GTT GTT T-3') y BMCTV CP6r (5'-CTC TTC GAA TAC GAT AAG TAG-3') (Creamer et al., 2005), los cuales amplifican una porción del gen que codifica la proteína de la cápside del virus. Para la reacción se utilizaron 5-10 ng del templado y 20 µL de una reacción compuesta por 0,250 µM de cada iniciador, 3 unidades de Taq DNA polimerasa (Promega, Madison, USA), 250 µM de dNTPs, 2 µL de la solución amortiguadora para Taq 10X (15 mM Cl₂Mg; 100 mM Tris-HCl (pH 9); 500 mM KCl; 1,1 % de gelatina) y 3 mM Cl₂Mg. La reacción de PCR consistió en: 35 ciclos consistentes de 94 °C por 30 seg, 59 °C por 60 seg y 72 °C por 90 seg y una extensión final de 72 °C por 5 min. Los productos de amplificación se separaron en geles de agarosa al 2 %, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron mediante luz ultravioleta en un equipo SIGMA T1201. La presencia de un fragmento de 576 pares de bases se consideró como detección positiva para el BMCTV.

Se adoptó un protocolo de extracción de DNA genómico único basado en una modificación del método de Dellaporta et al. (1983) que utiliza nitrógeno líquido y el buffer de extracción "A" compuesto por Tris 100 mM pH8.0, NaCl 50 mM pH 8.0, EDTA 50mM pH-8.0 y agua destilada. La combinación de oligonucleótidos utilizada para identificar la presencia del genoma A de begomovirus fue pRep-DGR / pCP70-Mot (Ascencio-Ibañez et al., 2002); mientras que para el diagnóstico e identificación completa de curtovirus se utilizó la combinación de iniciadores RepQEW-for/CP450-rev (Velasquez-Valle et al., 2012), la composición de la mezcla de reacción para PCR fue la misma y consistió en lo siguiente: Buffer Taq DNA polimerasa 1X, MgCl₂ 1.5 mM, dNTPs 0.2mM, oligonucleótidos 1M, Taq polimerasa 2.5 UT, DNA 1g. Las condiciones para la amplificación del ADN viral fueron: desnaturalización inicial a 94C/2min, y 35 ciclos conformados por una temperatura inicial de 94C/1min, una temperatura de alineamiento de 55C/1 min y una extensión a 72C/1min, con una extensión final de 72C/5 min. Los productos de PCR obtenidos se clonaron directamente en el plásmido PGEM-TEasy (Promega, Madison, WI), según las indicaciones del proveedor. La transformación de células competentes de Escherichia coli Top 10 y la extracción del DNA plasmídico se realizó de acuerdo al procedimiento modificado de Birnboim (Sambrook y Russell, 2001). Los productos clonados fueron secuenciados, y la secuencia nucleotídica obtenida en cada caso se comparó con las secuencias disponibles en la base de datos del GenBank, utilizando los algoritmos BlastN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) y ClustalV (MegAlign, DNASTAR Madison, WI).

Las diez muestras analizadas resultaron positivas para la presencia de curtovirus, específicamente BMCTV (Cuadro 1), lo cual concuerda con la sintomatología observada localmente de enanismo, amarillamiento del follaje y ausencia de estructuras reproductivas, entre otros, reportada a nivel mundial para este tipo de infecciones (Creamer et al., 2003; Chen et al., 2011; Velásquez-Valle et al., 2011).

PHYVV se detectó en ocho de las diez muestras analizadas mientras que PepGMV fue detectado en todas las muestras analizadas (Cuadro 1). De acuerdo con Brown (2003 a) la infección mixta del Pep GMV y PHYVV es una de las más comunes y económicamente importantes en las parcelas de chile localizadas en los estados fronterizos de México y Estados Unidos de América. La sintomatología causada por la infección de estos virus incluye mosaico amarillo brillante, moteado clorótico, clorosis foliar marginal, enrollamiento foliar, abultamientos o ampollamientos foliares, enanismo, caída de flor, reducción del tamaño o ausencia de frutos (Fraire, 2010), sin embargo también se ha reconocido que la expresión de síntomas puede variar en función de la variedad de chile, condiciones ambientales, cepas o variantes de begomovirus (Khan et al., 2007), por lo que la sintomatología en las enfermedades virales es frecuentemente poco confiable como método de diagnóstico. No obstante lo anterior, se ha reconocido que uno de los síntomas más evidentes de la infección por PepGMV y PHYVV es el mosaico brillante que suelen tomar las hojas y venas de las plantas enfermas, respectivamente (Brown, 2003a; Brown, 2003b) ninguno de los cuales se manifestó en las plantas de chile Mirasol analizadas en el presente trabajo. En las condiciones del Norte Centro de México, la mayoría de las plantas de chile infectadas por BMCTV mueren antes de completar el ciclo de cultivo por lo que es posible que los síntomas más evidentes de enfermedad causadas por ambos begomovirus no alcanzarían a manifestarse en el follaje más joven de las plantas. Es necesario investigar si la co-infección reportada durante este trabajo ocurre simultáneamente como en el caso de PHYVV y PepGMV (Medina-Ramos et al., 2008) o si un patógeno específico al infectar inicialmente una planta es capaz de enmascarar los síntomas causados por otros virus ya que una de las características mas importantes desde el punto de vista fitopatológico es que las infecciones mixtas pueden alterar la severidad de los síntomas pues es bien sabido que en plantas de chile infectadas con PepGMV son mucho mas agresivos que los observados en plantas infectadas solo con PHYVV pero cuando ambos virus infectan una misma planta de chile se observa antagonismo que reduce los síntomas producidos por PepGMV favoreciendo la interacción con el insecto vector y su diseminación a otras plantas (Méndez-Lozano et al., 2002). Con base en lo anterior es necesario establecer metodologías que permitan evaluar y caracterizar infecciones mixtas como las que se reportan en este trabajo de tal forma que se pueda confirmar si la infección causada por BMCTV en plantas de chile interfiere con la aparición de los síntomas provocados por PHYVV y PepGMV o si dependiendo de la planta hospedera se pudieran producir un incremento en la severidad de los síntomas como consecuencia de la infección causada por BMCTV, PHYVV y PepGMV.

Las muestras analizadas provenían de plantas de chile que mostraban síntomas de la enfermedad denominada amarillamiento entre los que destacan: enanismo, follaje clorótico o amarillo en la planta completa, ausencia total o parcial de estructuras reproductivas (botones, flores o frutos), hojas alargadas y de consistencia gruesa, así como frutos pequeños y deformes; esta sintomatología ya había sido previamente asociada con la presencia del Beet mild curly top virus (BMCTV) en el área productora de esta hortaliza en el vecino estado de Zacatecas (Velásquez-Valle et al., 2008, Velásquez-Valle et al., 2011); las zonas productoras de chile para secado de ambos estados no se encuentran físicamente separadas sino que pertenecen a una misma región geográfica perteneciente al norte centro de México. Los reportes sobre la presencia de al menos tres variantes de BMCTV produciendo infecciones simples en cultivos de chile presentes en el Altiplano Potosino (Comunicación Personal Dr. Gerardo Argüello Astorga) por lo que parece probable que esta sintomatología sea producida por un mismo agente (s) causal (es) para ambos estados.

La información con la que se cuenta sobre la presencia de los vectores de estos virus en la región es parcial: la presencia del vector de begomovirus, la mosca blanca (Bemisia tabaci Genn.) no ha sido confirmada en la zona productora de chile en el Altiplano Potosino y es probable que esto se deba en gran parte a las bajas temperaturas y al clima semiárido característicos de la región lo cual conlleva a la presencia de bajas poblaciones de este insecto. Con respecto al vector del BMCTV, la chicharrita Circulifer tenellus Baker, existen reportes que indican que se distribuye ampliamente en el norte centro del país, incluyendo el área productora de chile para secado del Altiplano Potosino (Velásquez-Valle et al., 2008) ya que el clima semiárido favorece su reproducción y diseminación (Bennett, 1971). Durante este trabajo se logró detectar por primera vez la presencia de dos geminivirus pertenecientes el género de los begomovirus (PepGMV y PHYVV) y uno perteneciente al género de los curtovirus (BMCTV) infectando plantas de chile para secado en México. Es necesario llevar a cabo estudios que confirmen si los síntomas causados por BMCTV son capaces de atenuar a los producidos por PepGMV y PHYVV o si eventualmente y dependiendo del hospedero la presencia de estos tres virus puede producir nuevas sintomatologías cada vez más agresivas.

LITERATURA CITADA

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