Caracterización de Grupos de Compatibilidad Vegetativa de Fusarium mexicanum Causante de la Malformación del Mango en Jalisco, México

Vegetative Compatibility Groups Characterization of Fusarium mexicanum Causing Mango Malformation in Jalisco, Mexico

Gerardo Rodríguez Alvarado¹, Isai Betancourt Resendes¹, Rodrigo Rodríguez Fernández¹, José Joaquín Velázquez Monreal², Sylvia Patricia Fernández Pavía³ y Nuria Gómez Dorantes³

¹ Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo (UMSNH), Laboratorio de Patología Vegetal, IIAF, Tarímbaro, Michoacán, CP 58880, México.

³ UMSNH, Laboratorio de Patología Vegetal. Correspondencia: gra.labpv@gmail.com

Recibido: Octubre 05, 2012
Aceptado: Junio 06, 2013

Resumen

Aislados de Fusarium mexicanum obtenidos de árboles de mango con la enfermedad malformación en Jalisco, fueron caracterizados de acuerdo a grupos de compatibilidad vegetativa (GCVs). F. mexicanum ha sido detectado causando malformación del mango en varias regiones de México. Los aislados fueron cultivados en medio mínimo suplementado con clorato de potasio (KClO₃), NO₃^- y L-asparagina, para generar mutantes (nit). Los mutantes son detectados como sectores de micelio resistente al clorato, incapaces de utilizar nitrato como fuente de nitrógeno debido a mutaciones en loci asociados con la ruta metabólica del nitrato. Aislados de F. mexicanum generaron 239 sectores de micelio resistentes al clorato, siendo 62.3 % mutantes nit. La caracterización fenotípica detectó 36.91 % de mutantes nit1, 28.18 % de mutantes nit3, 19.46 % de mutantes NitM y 14.76 % de mutantes nnu. Pruebas de compatibilidad detectaron dos GCVs. Los aislados en un GCV de Jalisco fueron compatibles con aislados de un GCV previamente identificado de F. mexicanum de Michoacán. Un total de tres GCVs fueron detectados en la región Pacífico centro de México.

Palabras clave: Mutantes nit, heterocarión, anastomosis, GCV, frutales, enfermedades.

Fusarium mexicanum has been described as the causal agent of mango malformation in several producing areas in Mexico. Isolates of F. mexicanum obtained from mango trees with malformation disease in Jalisco were characterized according to vegetative compatibility groups (VCGs). Isolates were cultured on minimal medium supplemented with potassium chlorate (KClO₃), NO₃^-, and L-asparagine, to generate spontaneous nitrate nonutilizing (nit) mutants. Mutants are detected as mycelia sectors chlorate-resistant, which are not able to utilize nitrate as a nitrogen source due to mutations at loci associated with the nitrate-assimilation pathway. F. mexicanum isolates generated 239 chlorate-resistant sectors of mycelia, out of 62.3 % were nit mutants. Phenotypic characterization detected 36.91 % mutants nit1, 28.18 % mutants nit3, 19.46 % mutants NitM and 14.76 % mutants nnu. Compatibility pairing tests amongst the mutants detected two VCGs in isolates of F. mexicanum from Jalisco. Isolates in one VCG from Jalisco were compatible with isolates of a previously identified VCG of F. mexicanum from Michoacan. A total of three VCGs were detected in the central Pacific region of Mexico.

Keywords: Mutants nit, heterocaryon, anastomosis, VCG, fruit crops, diseases.

La malformación del mango es una de las enfermedades más destructivas de este cultivo (Kumar and Beniwal, 1992). La sintomatología incluye un desarrollo anormal de los brotes florales y vegetativos, lo cual resulta en inflorescencias y hojas malformadas (Ploetz y Freeman, 2009). La malformación del mango es un problema severo en los estados de Guerrero y Michoacán (Noriega, 1996; Noriega-Cantú et al., 1999; Vega-Piña y Miranda-Salcedo, 1993; Mora-Aguilera et al., 2003). F. oxysporum ha sido reportado como el patógeno causante de la malformación en Michoacán y Morelos, y F. subglutinans en Guerrero y Michoacán (Díaz y Romero-Cova, 1980; Vega-Piña y Miranda-Salcedo, 1993; Noriega, 1996; Noriega-Cantú et al., 1999). Recientemente, F. mexicanum Aoki, Freeman, Otero-Colina, Rodríguez-Alvarado, Fernández-Pavía, Ploetz y O'Donnell, sp. nov., ha sido descrito causando malformación del mango en Colima, Guerrero, Michoacán y Morelos, México (Rodríguez-Alvarado et al., 2008; Otero-Colina et al., 2010; Rodríguez-Alvarado et al., 2013). Varias especies del género Fusarium han sido reportadas como agentes causales de esta enfermedad (Marasas et al., 2006). En India, Summanwar et al. (1966) y Varma et al. (1974) fueron los primeros investigadores en reportar un hongo, Fusarium moniliforme (posteriormente llamado F. subglutinans), como el agente causal de la malformación floral y vegetativa, respectivamente. Steenkamp et al. (2000) usaron secuencias de los genes histona H3 y beta-tubulina, para detectar dos grupos filogenéticamente distintos de aislados de Fusarium obtenidos de tejidos malformados de mango. Un grupo fue establecido como conespecífico con cepas de F. subglutinans cuya patogenicidad en mango había sido previamente demostrada (Freeman et al., 1999; Ibrahim et al., 1975; Manicom, 1989; Ploetz and Gregory, 1993). El segundo grupo de cepas constituyó un linaje único en el complejo G. fujikuroi. Britz et al. (2002) llevaron a cabo una caracterización morfológica de las cepas del primer grupo las cuales habían sido obtenidas en Egipto, Florida (E.E.U.U.), Israel, Malasia y África del Sur. El nombre de Fusarium mangiferae fue propuesto para este grupo de cepas por Britz et al. (2002). El segundo grupo de cepas había sido obtenido en Brasil y África del Sur y fue llamado F. sterihilyphosum. F. proliferatum ha sido detectado causando malformación del mango en China (Zhan et al., 2010). F. mangiferae también ha sido reportado en China (Zhan et al., 2012) y España (Crespo et al., 2012). F. tupiense ha sido reportado causando malformación del mango en Brasil y Senegal (Lima et al., 2009, 2012; Senghor et al., 2012). Los aislados analizados en este estudio fueron obtenidos de árboles malformados de mango en Jalisco, México, en 2007, y fueron identificados como F. mexicanum (Betancourt-Resendes et al., 2012).

El análisis de Grupos de Compatibilidad Vegetativa (GCV) en una población de aislados de hongos es útil para determinar la diversidad presente en esa población (Leslie and Summerell, 2006). Puhala (1979) llevó a cabo los primeros estudios en GCVs en hongos patógenos de plantas. Encontró 16 GCVs entre 86 aislados de Verticillium dahliae usando ensayos de complementación con mutantes (nit) que no utilizan nitrato. GCVs también han sido determinados en F. oxysporum (Puhalla, 1985), Colletotrichum spp. (Brooker et al., 1991), aislados tipo F. subglutinans de mango (Zheng y Ploetz, 2002) [esos aislados fueron posteriormente llamados F. mangiferae (Britz et al., 2002)], Cercospora kikuchii (Cai y Schneider, 2004), F. mangiferae, F. sterihilyphosum y Fusarium tipo subglutinans (Lima et al., 2009a). Leslie and Summerell (2006) mencionaron 49 géneros de hongos en los cuales hay evidencia reportada de que un sistema de compatibilidad vegetativa está presente. Si las hifas de dos cepas de la misma especie, pueden anastomosarse y formar un heterocarión estable, se dice que esas cepas son compatibles vegetativamente y pertenecen al mismo GCV. Si esas cepas no pueden fusionar las hifas de sus micelios, son incompatibles vegetativamente y pertenecen a diferentes GCVs (Puhalla, 1985; Leslie and Summerell, 2006). Los estudios sobre la compatibilidad vegetativa usan mutantes auxótrofos, llamados mutantes nit, de la ruta metabólica del nitrato, los cuales presentan lesiones que bloquean el uso de nitrato como una fuente de nitrógeno (Klittich and Leslie, 1988). Los mutantes auxótrofos son generados espontáneamente como sectores de rápido crecimiento en medio suplementado con análogos tóxicos del nitrato como clorato de potasio (Puhalla, 1985; Correll et al., 1987).

El análisis de GCVs en estudios previos ha detectado dos GCVs en aislados de F. mexicanum de Michoacán, México (Betancourt-Resendes et al., 2010). Esto indica que una diversidad baja fue detectada en esa población. El objetivo de este trabajo fue determinar la diversidad presente en aislados de F. mexicanum de huertas de mango con malformación en Jalisco, México.

MATERIALES Y METODOS

Aislados. Los aislados de F. mexicanum utilizados en este estudio fueron caracterizados previamente (Betancourt-Resendes et al., 2012) y fueron obtenidos de tejidos de mango malformados, colectados en una huerta localizada en el municipio de La Huerta, Jalisco, durante mayo del 2007. Estos aislados fueron identificados como F. mexicanum en base a las características morfológicas y genéticas, y están almacenados como suspensiones de conidios en glicerol al 15 % a -70 °C en la Colección de Hongos en el Laboratorio de Patología Vegetal (UMSNH). La patogenicidad de estos aislados de plantas de mango fue previamente confirmada (Betancourt-Resendes et al., 2012).

Inóculo. El inóculo de cada aislado para los experimentos fue preparado tomado alícuotas de una suspensión congelada de esporas mantenida en glicerol, sembrando 15 (J.L en cajas Petri 60 x 15 mm con PDA. Los cultivos fueron incubados bajo luz blanca a 25 °C por 7 a 10 d. ₃

Generación de mutantes. Tres discos (2-mm³) de medio conteniendo hifas de la orilla de la colonia de cada aislado fueron transferidas a una caja Petri (100 x 15 mm) conteniendo medio de clorato. Los discos fueron colocados separados uno del otro formando un triángulo equilátero. Once cajas Petri con la concentración 1.5 % de clorato fueron usadas para un total de 33 discos para cada aislado. Mientras que seis cajas Petri de la concentración 2.0 % de clorato fueron usadas para un total de 18 discos para cada aislado. Las cajas Petri fueron colocadas a 25 °C bajo luz fluorescente blanca continua y revisadas cada día para detectar sectores. Cuando los discos desarrollaron sectores de micelio, una punta de hifa fue transferida a cajas Petri 60 x 15 mm con medio MM e incubadas como se mencionó. Los cultivos que generaban colonias con un micelio escaso y adherido a la superficie del medio, fueron considerados mutantes nit y mantenidos a 4 °C. Los cultivos que presentaban colonias con micelio aéreo y denso fueron considerados resistentes al clorato, no mutantes nit y fueron descartados (Correll et al., 1987; Leslie and Summerell, 2006).

Caracterización fenotípica de mutantes nit. Los mutantes nit fueron transferidos a cajas Petri 60 x 15 mm conteniendo medio MM suplementado con una de cuatro diferentes fuentes de nitrógeno como se mencionó. Un disco de 2-mm³ de medio conteniendo hifas de cada mutante nit fue colocado en el centro de cada una de dos cajas Petri. Los cultivos fueron incubados a 25 °C por 4 a 7 d. Las colonias con micelio aéreo abundante fueron consideradas como formadoras de "micelio denso"; mientras que las colonias con micelio escaso y hialino fueron consideradas como formadoras de "micelio no denso". Los mutantes tipo nit1 no son capaces de utilizar nitrato, los mutantes tipo nit3 no pueden utilizar nitrato o nitrito, los mutantes tipo NitM son incapaces de utilizar nitrato o hipoxantina, los mutantes tipo nnu no pueden utilizar nitrato, nitrito o hipoxantina. Los mutantes nnu fueron generados espontáneamente cuando la concentración de clorato fue incrementada a 2.0 % en el medio CM; con una concentración de clorato de 1.5 %o no se generaron estos mutantes. En medio MM más tartrato de amonio todos los mutantes nit crecen con micelio denso. Este medio es considerado como un control positivo porque el amonio (NH₄) es el producto final en la ruta metabólica del NO₃, y puede ser usado directamente por los mutantes nit al igual que por los aislados de tipo silvestre. MM más nitrato es considerado como un control negativo porque todos los mutantes nit deben producir micelio no denso (Figura 2) (Leslie and Summerell, 2006).

Pruebas de auto compatibilidad vegetativa. Las cepas obtenidas en campo que no son capaces de formar heterocariones son llamadas heterocariones auto-incompatibles o HSI (Correll et al., 1989). Esas cepas son identificadas usando mutantes nit generados de cada aislado que está siendo analizado para GCVs, en pruebas de complementación entre ellas mismas. Debido a que los mutantes son obtenidos del mismo aislado, todos deben estar en el mismo GCV y deben de producir un heterocarión protótrofo, si se asume que el cultivo original es puro. Si los mutantes fallan en producir un heterocarión, esto indica que el aislado tipo silvestre del cual fueron generados es una cepa HIS y será incompatible vegetativamente con todas las otras cepas. Las cepas HSI son eliminadas de las pruebas posteriores (Leslie and Summerell, 2006).

Los mutantes nit1/nit3 y NitM/nnu de cada aislado fueron apareados en pruebas de complementación. Todas las pruebas de complementación se llevaron a cabo en cajas Petri 100 x 15 mm con medio MM suplementado con NO₃^-como la única fuente de nitrógeno disponible para los cultivos. Los cultivos de los mutantes usados como inóculo para las pruebas de complementación fueron crecidos en medio MM más NO₃. Un disco de 2-m m de medio y micelio de los mutantes NitM o nnu fue colocado en el centro de la caja. Cuatro discos de los mutantes nit1 o nit3 fueron colocados en la caja formando un cuadro, con el mutante NitM o nnu en el centro. Los cultivos fueron incubados en la oscuridad a 25 °C por 7 a 14 d. Una vez que las colonias hacen contacto, se observa la formación inicial del micelio heterocarión en uno o dos días. Micelio completamente denso y aéreo puede ser observado de 5 a 14 d. Las cepas que son capaces de formar un heterocarión entre sus mutantes son llamadas heterocarión auto-compatible o HSC (Leslie and Summerell, 2006).

Pruebas de compatibilidad vegetativa. Para determinar los GCVs presentes en el grupo de aislados de F. mexicanum analizados, se llevaron a cabo apareamientos entre los mutantes nit derivados de cada aislado. Dos mutantes nit1 o nit3 fueron seleccionados para cada aislado. El protocolo de apareamiento es similar al descrito en la sección previa. Sin embargo, en este caso dos cepas fueron probadas en su compatibilidad en cada caja. Un disco de la cepa A de un mutante nit1 o nit3 es colocado en la parte superior izquierda, un disco de la cepa B de un mutante NitM o nnu es colocado en la parte superior derecha, un disco de la cepa A de un mutante NitM o nnu es colocado en la parte inferior izquierda, y un disco de la cepa B de un mutante nit1 o nit3 es colocado en la parte inferior derecha. Esta disposición resulta en un control positivo apareándose para cada cepa. Si un heterocarión se forma entre cada una de los cuatro pares de colonias entonces las cepas A y B están en el mismo GCV. Si un heterocarión se forma solamente entre los controles positivos de ambas cepas, entonces cada cepa esta en un GCV diferente (Leslie and Summerell, 2006).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Generación de mutantes nit. Un total de 128 sectores de micelio resistentes al clorato fueron producidos cuando se utilizó clorato al 1.5 % en el medio CM (Cuadro 1). Dos aislados fueron incapaces de producir sectores en esta concentración de clorato, MXJAL-5 y MXJAL-17. Sectores de micelio fueron inicialmente detectados entre 4 y 6 d después de que las cajas fueron inoculadas con los discos (Figura 1). La frecuencia de generación de sectores entre los aislados varió de 15 % (MXJAL-13) a 46 % (MXJAL-19) (Cuadro 1). Cuando los sectores fueron transferidos a MM con nitrato, 48 % desarrollaron micelio no denso lo cual indicó que eran mutantes nit incapaces de utilizar nitrato como una fuente de nitrógeno (128 sectores transferidos / 62 mutantes nit) (Cuadro 1). Los sectores que desarrollaron micelio denso fueron considerados como aislados resistentes al clorato que utilizan nitrato y descartados de pruebas posteriores. Un segundo experimento usando 2 % de clorato de potasio en el medio para generar mutantes produjo 111 sectores de micelio resistentes al clorato (Cuadro 1). Todos los aislados fueron capaces de generar sectores usando esta concentración de clorato. La frecuencia de generación de sectores resistentes al clorato varió entre los aislados de 11 % (MXJAL-13) a 77 % (MXJAL-3) (Cuadro 1). En medio MM con nitrato, 78 % de los sectores desarrolló mutantes nit (111 sectores transferidos / 87 mutantes nit) (Cuadro 1).

Medio CM suplementado con 2 % de clorato de potasio fue útil para obtener mutantes en todos los aislados. En seis aislados todos los sectores generados resultaron en mutantes nit. La frecuencia promedio entre los aislados de F. mexicanum para la generación de sectores espontáneos resistentes al clorato para esta concentración de clorato de potasio fue de 40.6 % (Cuadro 1). Mientras que el promedio de la frecuencia cuando el medio CM fue suplementado con 1.5 % clorato de potasio fue de 26.7 % (Cuadro 1). El incremento en la frecuencia de generación de sectores debido a la concentración más alta de clorato en el medio CM ha sido reportado por Leslie y Summerell (2006). La variación observada entre los aislados de F. mexicanum en la frecuencia y rapidez para generar sectores de micelio resistentes al clorato ha sido también detectada en F. oxysporum y otras especies de Fusarium en el complejo de especies de Gibberellafujukuroi (Puhallla, 1985; Leslie and Summerell, 2006).

Caracterización fenotípica. Un total de 149 mutantes generados de quince aislados de F. mexicanum fueron caracterizados en su uso de fuentes de nitrógeno diferentes (Figura 2). La frecuencia del fenotipo nit1 fue 36.91 %, fenotipo nit3 tuvo una frecuencia de 28.18 %, y para el fenotipo NitM fue 19.46 %. Estos resultados son similares a los reportados para otros hongos filamentosos (Chun y Fenn, 2000). Los mutantes nnu no son capaces de utilizar nitrato, nitrito e hipoxantina, tuvieron una frecuencia de 14.76 % (Cuadro 2). El aislado MXJAL-2 mostró la más alta frecuencia de los mutantes nit1 con 56.2 %, el aislado MXJAL-3 presentó la más alta frecuencia para los mutantes nit3 con 64.7 %, y el aislado MXJAL-7 generó la más alta frecuencia de los mutantes NitM con 40 % (Cuadro 2).

La variación en la frecuencia de los fenotipos obtenida para los aislados de F. mexicanum de Jalisco es similar a la reportada para otras especies de Fusarium (Leslie y Summerell, 2006). En este estudio, el medio CM fue suplementado con L-asparagina como una fuente de nitrógeno. La adición de este aminoácido al medio induce una mayor generación de mutantes nit1 y una menor proporción de mutantes NitM (Leslie and Summerell, 2006).

Leslie y Summerell (2006) reportaron que hay dos loci involucrados en la utilización de nitrato en Fusarium. Uno es un regulador global del nitrógeno llamado nnu (Kinzel y Leslie, 1985; Leslie, 1987). Reguladores de nitrógeno similares han sido descritos en Neurospora crassa (nit-2) y Aspergillus nidulans (areA) (Dickman y Leslie, 1992). Los genes nit-2 y areA codifican una proteína regulatoria que actúa positivamente y es un miembro de la familia GATA de factores de transcripción (Feng y Marzulf, 1998). Esta proteína activa los genes cuyos productos catabolizan y asimilan muchas fuentes secundarias de nitrógeno (Feng y Marzluf, 1990). Cuando ocurren lesiones en estos loci, los mutantes pierden la función de areA y nit-2 y son incapaces de utilizar cualquier fuente de nitrógeno diferente de glutamina y amonio (Arst y Cove, 1973; Marzluf, 1997). Usualmente, los mutantes en el gen que codifica el regulador global de nitrógeno no son obtenidos en medio mínimo suplementado con clorato (Leslie y Summerell, 2006).

Un grupo de 22 mutantes, representando el 14.7 % del total de los mutantes nit generados en este estudio, no fueron capaces de crecer en MM suplementado con nitrato, nitrito o hipoxantina (Cuadro 2). Ocho aislados MXJAL generaron de 1 a 3 mutantes de este tipo, mientras que los aislados MXJAL-14 y MXJAL-17 generaron 5 y 6 mutantes, respectivamente (Cuadro 2). Estos mutantes fueron usados en pruebas complementarias con mutantes nit1 y nit3, en los casos donde algunos aislados no fueron capaces de generar mutantes NitM. Es necesario caracterizar en más detalle estos mutantes para entender mejor si F. mexicanum es más susceptible de mutaciones en un gene regulador global del nitrógeno, cuando se suplementa al medio CM con concentraciones altas de clorato.

Compatibilidad vegetativa. Las pruebas de auto compatibilidad mostraron que los mutantes nit1 o nit3 fueron capaces de complementar mutantes NitM o nnu en el mismo aislado, para todos los quince aislados MXJAL estudiados. Cinco aislados, MXJAL-1, MXJAL-2, MXJAL-7, MXJAL-8 y MXJAL-10, produjeron una línea densa de crecimiento donde las colonias hicieron contacto en la superficie del agar, 10 d después de inocular las cajas con los discos de micelio, lo que indicó auto-complementación. El resto de los aislados requirió de 15 d para completar las pruebas. Los mutantes nnu tuvieron una respuesta similar en cuanto a la formación de micelio denso, protótrofo, heterocarión, con respecto a los mutantes NitM, en las pruebas de complementación con mutantes nit1 o nit3. Este es el primer reporte de mutantes nnu siendo usados como cepas complementarias en la identificación de GCVs en Fusarium.

Pruebas de GCV se han realizado en otros tres taxones de Fusarium asociados con la malformación del mango. Steenkamp et al. (2000) analizaron aislados de F. subglutinans sensu lato, los cuales fueron posteriormente identificados como F. mangiferae y F. sterilihyphosum (Britz et al., 2002), reportando tres GCVs (GCV 1, GCV 2 y GCV 3) para aislados de F. mangiferae obtenidos de mango malformado en Israel, Florida (E.E.U.U.) y África del Sur. Adicionalmente, Steenkamp et al. (2000) reportaron un GCV 4 para aislados de F. sterilihyphosum obtenidos en África del Sur. Zheng and Ploetz (2002) examinaron la diversidad genética de 74 aislados de F. subglutinans sensu lato de mango malformado en Brasil, Egipto, Florida (E.E.U.U.), India, Israel y África del Sur. Estos autores identificaron siete GCVs, en Egipto y E.E.U.U. presentando la mayor diversidad con cuatro y tres GCVs, respectivamente. Brasil, India y África del Sur mostraron solamente un GCV. Los aislados Brasileños (GCV 7) fueron posteriormente confirmados como F. sterilihyphosum (Marasas et al., 2006). Recientemente, Lima et al. (2009a) evaluaron la diversidad genotípica en aislados de Fusarium 'subglutinans' (F. tupiense) reportado como agente causal de la malformación del mango en Brasil (Lima et al., 2009b, 2012). Seis GCV fueron identificados entre los aislados colectados en 13 sitios en Brasil, los cuales se correlacionaban con seis grupos genéticos detectados con AFLPs. El GCV 17/AFLP 1 fue detectado en siete sitios, mientras que un GCV fue detectado en tres y el resto de los GCVs fueron identificados en localidades individuales.

Los resultados obtenidos en este estudio son similares a los reportados por Steenkamp et al. (2000), Zheng y Ploetz (2002) y Lima et al. (2009a). Esos autores indicaron sobre la presencia de varios GCVs entre los aislados de fusaria causantes de la malformación del mango de regiones geográficas diversas, lo cual sugería cierto grado de variación genética y que esas poblaciones estaban reproduciéndose clonalmente (Lima et al., 2009a). También es posible que un número mayor de aislados analizados pudiera producir GCVs adicionales. La presencia de un GCV en dos estados (Jalisco y Michoacán) sugiere que el patógeno se está reproduciendo clonalmente y está probablemente siendo diseminado a través del transporte de material vegetal infectado.

El uso del análisis de GCV es una herramienta útil para determinar la diversidad genética de fusaria causante de la malformación del mango en áreas productoras en México. Esta es la principal enfermedad afectando este cultivo en la región centro occidente (Fernández-Pavía et al., 2006; Rodríguez-Alvarado et al., 2008). La ausencia de regulaciones sanitarias en el tránsito de material vegetativo de viveros de mango a regiones distantes en un país, podría contribuir a diseminar este patógeno (Zheng and Ploetz, 2002). Muestreo adicionales que incluyan otras regiones, cultivares y etapas fenológicas es requerido para confirmar el numero de GCVs detectados en este estudio.

CONCLUSIONES

AGRADECIMIENTOS. Este trabajo fue financiado con un apoyo para Investigación en Ciencia Básica de CONACYT, México por medio del Proyecto No. 84578 a G. Rodríguez-Alvarado.

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