Identificación Molecular de Cepas Nativas de Trichoderma spp. su Tasa de Crecimiento in vitro y Antagonismo contra Hongos Fitopatógenos
Molecular Identification of Trichoderma spp. Strains, in vitro Growth Rate and Antagonism against Plant Pathogen Fungi
César Guigón–López1, Víctor Guerrero–Prieto1, Francisco Vargas–Albores2, Elizabeth Carvajal–Millán2, Graciela Dolores Ávila–Quezada3, Leticia Bravo–Luna4, Michelina Ruocco5, Stefania Lanzuise5, Sheridan Woo5 y Matteo Lorito5
1 Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A. C. Unidad Cuauhtémoc. Av. Río Conchos S/N. Parque Industrial. Apdo. Postal 781. Cd. Cuauhtémoc, Chihuahua, México. CP 31570.
2 Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A. C. Unidad Hermosillo. Carretera a la Victoria Km. 0.6, Apdo. Postal 1735. Hermosillo, Sonora, México. CP 83304.
]]> 3 Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A. C. Unidad Delicias. Ave. Cuarta sur No. 3820, Fracc. Vencedores del Desierto, Delicias, Chihuahua, México. CP 33089 México.4 Centro de Desarrollo de Productos Bióticos, IPN. Yautepec, Morelos, México. CP 62731.
5 Dipartimento Ar.Bo.Pa. Ve.–sez. Patologia Vegetale, University of Napoli "Federico II", via Università" 100, Portici, Italia. 80055. Correspondencia: vguerrero51@ciad.mx.
Recibido: Febrero 18, 2010
Aceptado: Septiembre 07, 2010
Resumen
Seis cepas nativas de Trichoderma spp. se identificaron a especie y se determinó su tasa de crecimiento y antagonismo contra diferentes hongos fitopatógenos. Sus características morfológicas y tasa de crecimiento se determinaron cultivándolas en Papa Dextrosa Agar y mediante un análisis molecular se identificó la especie. El antagonismo fue evaluado mediante confrontación por cultivos duales. Morfológicamente las cepas fueron similares a T. harzianum y a T. viride; sin embargo, el análisis molecular identificó a TC74, TC74M, T341, T359 y T479, como T.asperellum y a T397 como T. longibrachiatum. La tasa de crecimiento promedio de las cepas a 25 °C varió de 12 a 17 mmd–1. La inhibición del crecimiento de B. cinerea varió 60% a 75% y el sobrecrecimiento sobre su micelio 25% a 100%. La inhibición de R. solani varió 34% a 52% y el sobrecrecimiento 15% a 100%. La actividad antagónica de T. asperellum TC74, T341 y T359 fue similar a las cepas de referencia T22 y Th. Estas tres cepas también inhibieron 44% a 64% el crecimiento de M. phaseolina, 51% a 59% el de R. solani, 28% a 37% el de P. omnivora y 5% a 14% el de Fusarium sp.
Palabras clave: Adicionales: Biocontrol, T. asperellum, T. longibrachiatum, patógenos de la raíz.
]]>Abstract
Six Trichoderma spp. native strains were identified to specie and studied to determine their growth rate and antagonism against plant pathogen fungi. The strains were cultivated on Potato Dextrose Agar to determine their morphological characteristics and growth rate. Molecular analysis was carried out to identify their species. The antagonistic activity was tested by the dual cultures confrontation method. Although morphological characteristics of strains were similar to T. harzianum and T. viride, the molecular analysis showed that strains TC74, TC74M, T341, T359 and T479, were T. asperellum and T397 was T. longibrachiatum. Trichoderma strains mean growth rate at 25 °C ranged from 12 to 17 mmd–1. Inhibition of the B. cinerea growth ranged from 60% to 75% and mycelium overgrown from 25% to 100%. Inhibition of R. solani growth ranged from 34% to 52% and overgrown from 15% to 100%. Antagonistic activity of T. asperellum TC74, T341 and T359 was similar to reference strains T22 and Th. The same three strains inhibited the M. phaseolina growth from 44% to 64%, R. solani from 51% to 59%, P. omnivora 28% to 37% and Fusarium sp. 5%to 14%.
Key Words: Biocontrol, T. asperellum, T longibrachiatum, soil borne plant pathogens.
INTRODUCCIÓN
Las pudriciones de raíz se encuentran entre las más importantes enfermedades que mundialmente causan significativas pérdidas económicas en diferentes cultivos agrícolas. Aunque los productos químicos sintéticos son aún la principal herramienta de control para estas enfermedades, los agentes biológicos son una manera efectiva para proporcionar un control más rápido y más seguro, además de que pueden ser incluidos dentro del control integrado de plagas y enfermedades (Verma et al., 2007). El suelo es una importante fuente de microorganismos que han sido ampliamente estudiados para procesos biotecnológicos, contándose entre estos el control biológico de enfermedades en plantas por medio de procesos naturales como la antibiosis y el parasitismo (Fravel, 2005). La principal estrategia para el biocontrol ha sido la identificación de microorganismos del suelo que sean antagonistas efectivos y que su uso biológico sea seguro, estrategia que ya cuenta con resultados exitosos (Alabouvette y Steinberg, 2006; Sánchez et al., 2008). Entre los microorganismos nativos del suelo, Trichoderma spp. ha sido ampliamente estudiado y se ha propuesto como agente de control biológico, especialmente contra fitopatógenos nativos del suelo (Howell, 2003; Verma et al., 2007). Los factores clave que contribuyen al efecto antagónico de estos organismos son su rápido crecimiento, producción de metabolitos antimicrobianos y sus características fisiológicas, sin embargo para una adecuada comprensión de las propiedades bioquímicas, genéticas y fisiológicas se requiere de la acertada ubicación taxonómica de estos organismos (Kullnig et al., 2001). La variabilidad de las características morfológicas de las especies de Trichoderma hace que su clasificación sea difícil, no obstante con el desarrollo de técnicas moleculares la sistemática de este género ha avanzado sustantivamente en los últimos años y es debido a este avance que la importancia de métodos morfológicos ha disminuido paulatinamente (Kullnig et al., 2001; Druzhinina et al., 2006). La descripción de las diferencias en las regiones 5.8S del rRNA, ITS1 e ITS2 y otras técnicas han ocasionado que en años recientes, diferentes cepas de T. harzianum, se reubicaran en especies como T. asperellum, T. atroviride y T. longibrachiatum (Lieckfeldt et al., 1999; Hermosa et al., 2000; Kullnig et al., 2001). Del mismo modo, cepas de T. atroviride o T. viride se han reubicado como T. asperellum (Watanabe et al., 2005). El análisis de secuencias genéticas permitió a Tondje et al., (2007) identificar como T. asperellum diferentes aislamientos capaces de actuar como micoparasitos. Por otra parte, los modos de acción más comúnmente reportados para Trichoderma spp. son: micoparasitismo, competencia por nutrientes y espacio, antibiosis por medio de enzimas o la producción de metabolitos secundarios, e inducción de los sistemas de defensa en la planta (Howell, 2003; Harman, 2006). Una herramienta útil y confiable para conocer el potencial como agente de biocontrol de cepas de Trichoderma son los ensayos in vitro para determinar antagonismo (Larralde et al., 2008), los cuales se utilizan principalmente como herramienta predictiva para determinar la capacidad de inhibición del crecimiento, antes de efectuar estudios que requieren más tiempo y costo económico (Lo et al., 1998). Bajo estas premisas, seis cepas nativas de Trichoderma spp. fueron identificadas a nivel de especie y caracterizadas en cuanto a su tasa de crecimiento y actividad antagónica in vitro contra Botrytis cinerea Pers.:Fr, Macrophominaphaseolina (Tassi) Goidanich, Rhizoctonia solani Kuhn, Phymatotrichopsis omnivora (Dugg) Hennebert y Fusarium sp. Link.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismos. Las cepas de Trichoderma TC74 y TC74M, fueron aisladas de suelo de la rizosfera en un cultivo de chile (Capsicum annuum L.) cultivado en Chihuahua, México. Las cepas T341, T359, T397 y T479 fueron asiladas del suelo de huertas comerciales de mango (Mangifera indica L.) en los Estados de Colima y Guerrero, México y fueron proporcionadas por el Dr. Alejandro Michel–Aceves (Colegio Superior Agropecuario del Estado de Guerrero, México). La cepa comercial Trichoderma harzianum Rifai (Th) (ProSelective TM 'Naturalmente Pureza', Durango, México), fue utilizada como testigo. La cepa T22 de T. harzianum (ATCC 20847) fue utilizada como referencia en las pruebas de antagonismo. Las cepas italianas de B. cinerea y R. solani se obtuvieron en el cepario del laboratorio de control biológico de la Universidad de Nápoles "Federico II" en Nápoles, Italia. Las cepas de M. phaseolina Mp1, Mp2, Mp3 y Mp4, R. solani (cepa mexicana) y Fusarium sp. fueron aisladas de raíces enfermas de chile en Chihuahua, México. P. omnivora fue aislada del suelo de una huerta de nogal pecanero (Carya illinoensis Wangenh. (Koch) y fue proporcionada por el Dr. José Antonio Samaniego–Gaxiola, Campo Experimental La Laguna, del INIFAP, en Coahuila, México.
]]> Identificación morfológica y molecular de las cepas. Los estudios se realizaron durante el año 2009. Las cepas de Trichoderma fueron crecidas en cajas petri con PDA para determinar las características de la colonia como; tamaño, morfología y conidiacion (cómo se desarrollan y distribuyen las conidias, su maduración y color en el medio de cultivo) (Fig. 1). Adicionalmente, una suspensión de esporas fue inoculada en discos de PDA de 0.5 cm de diámetro, bajo un cubreobjetos, para ser incubada a 25 °C en una cámara húmeda durante 3–5 días. La morfología y patrón de distribución de los conidióforos, forma y color de las conidias, así como también la presencia de clamidosporas, fueron observados bajo el microscopio y comparados con la descripción hecha por Bisset (1991). La extracción de ADN, la PCR y la secuenciación para el análisis molecular fueron desarrollados de acuerdo a Komon–Zelazowska et al., (2007). Conidias de cada cepa (106 100 ml–1) fueron inoculadas en papa dextrosa agar y después de 3 días de crecimiento a 25 °C y agitadas a 150 rpm, el micelio fue recuperado, para después liofilizarlo y molerlo hasta obtener un polvo fino para el aislamiento del ADN. El ADN genómico fue aislado utilizando un mini juego (kit) QIAGEN DNeasy Plant. La amplificación de las regiones ITS1, ITS2 y 5.8 del ARN ribosomal, se realizó utilizando los iniciadores SR6R (5'–AAGTAGAAGTCGTAACAAGG–3') y LR1 (5'–GGTTGGTTTCTTTTCCT–3'). El procedimiento para la PCR consistió en los siguientes ciclos: 1 de 94 °C por 2 min, 30 ciclos de 94 °C por 30 seg, 30 ciclos de 50 °C por 45 seg, 30 ciclos de 72 °C por 1 min y 1 ciclo de 72 °C por 15 min. Los productos de la PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para la cuantificación y medida de la especificidad.
Finalmente, los productos fueron enviados a secuenciar al Laboratorio POMOGEN de la Universidad de Nápoles "Federico II" en Nápoles, Italia. Las secuencias fueron alineadas con el software MEGA 3.1 y analizadas por medio del programa Blast.
Caracterización de la tasa de crecimiento y antagonismo. Para la determinación de la tasa de crecimiento (TC), discos de PDA de 8 mm de diámetro conteniendo micelio de cada cepa fueron inoculados en el centro de cajas petri de 90 mm de diámetro, las cuales fueron incubadas a 25 °C hasta que el micelio de los hongos cubrió completamente la superficie de la caja petri. El crecimiento radial fue medido diariamente para calcular, al final del experimento, la tasa de crecimiento; TC= (Crecimiento final– Crecimiento inicial)/tiempo de incubación. El efecto antagónico de Trichoderma sobre los hongos patógenos fue determinado utilizando el método de cultivos duales (Larralde et al., 2008), para ello en cajas petri con PDA se confrontaron antagonistas contra patógenos colocando frente a frente un disco de 8 mm de diámetro de micelio de cada uno de ellos separados 5 cm aproximadamente e incubándose a 25±1 °C. El crecimiento de ambos hongos fue medido diariamente hasta que la confrontación fue terminada a las 120 h después de la inoculación, entonces la TC y el porcentaje de inhibición del crecimiento de los patógenos (IC) fue calculado, considerando como un 100% de crecimiento el diámetro de la colonia del hongo patógeno cuando creció en ausencia de Trichoderma. En un primer ensayo, todas las cepas de Trichoderma fueron confrontadas contra las cepas italianas de B. cinerea y R. solani. Las cepas nativas que mostraron un antagonismo sobresaliente y mayor tasa de crecimiento fueron seleccionadas para un segundo ensayo en el que su antagonismo fue confirmado confrontándolas contra otros microorganismos: R. solani (cepa mexicana), P. omnivora, Fusarium sp. y cuatro cepas de M. phaseolina Mp1, Mp2, Mp3 y Mp4. En todos los casos, los experimentos fueron realizados por duplicado y los datos analizados bajo un diseño completamente al azar, con tres repeticiones. Los porcentajes fueron transformados a arcoseno/raíz cuadrada antes de su análisis estadístico. Las medias fueron comparadas por la prueba de Tukey (P=0.05). Para el segundo ensayo, los tratamientos para evaluar el antagonismo contra las cepas de M. phaseolina fueron analizados bajo un diseño factorial 5X4 y las medias fueron comparadas por Tukey (P=0.05).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Identificación de las cepas. Las cepas, TC74, TC74M y T341 desarrollaron colonias cuyas características, en conjunto con el patrón de ramificación y morfología de los conidióforos, color y forma de las conidias, fueron similares a las características de T. harzianum. Las cepas T359 y T479 mostraron características similares a las descritas para T. viride. Sin embargo, para las cepas TC74, TC74M, T341, T359 y T479, se obtuvieron mediante PCR productos amplificados de 605 bp, (Fig. 2), y el análisis de las secuencias de nucleótidos realizado mediante Blastn muestra una homología del 99 a 100% con diversas secuencias correspondientes a cepas de T. asperellum; el análisis de la secuencia de nucleótidos de los productos amplificados de la cepa T397 presentó una homología del 99% al 100% con diferentes secuencias reportadas para T. longibrachiatum. En el Cuadro 1 se presentan estos resultados, así como cepas de referencia en cada caso. Debido a la alta homología obtenida, 99–100%, con la secuenciación genética, se considera que T. asperellum y T. longibrachiatum son las especies utilizadas en este trabajo. El secuenciamiento del ADN ha resuelto diversas interrogantes sobre la identidad de las especies de Trichoderma y predecir su actividad biológica (Druzhinina et al., 2006). La caracterización de este género, tradicionalmente basada en aspectos morfológicos, ha cambiado al uso de datos moleculares, dentro de los cuales la amplificación de las regiones ITS 1, ITS 2 y 5.8S del ARN ribosomal han sido ampliamente utilizados (Maymon et al., 2004; Watanabe et al., 2005). La ubicación taxonómica de las cepas en estudio es importante ya que representa el punto de partida que permitirá un mejor diseño de experimentos posteriores a fin de evaluar su actividad biológica bajo diferentes condiciones de crecimiento y determinar los mecanismos de acción que desarrollan. Esta información en conjunto permitirá una mejor selección de los organismos que pueden ser susceptibles de un mejor aprovechamiento en el biocontrol de patógenos de las plantas. Tanto T. asperellum como T. longibrachiatum han sido reportadas como agentes de biocontrol contra diferentes hongos fitopatógenos (Howell, 2003; Verma et al., 2007), sin ambargo la importancia de T. longibraquiatum ha sido cuestionada ya que su uso puede representar un serio peligro para la salud humana (Chouaki et al., 2002; Sánchez et al., 2007). T. asperellum fue propuesto como nueva especie por Samuels et al., (1999) ubicada en el subgrupo II de T. viride, y fue confirmada molecularm ente por Lieckfeldt et al., (1999); no tiene reportes como agente fitopatogeno y es un antagonista versátil (Watanabe, 2005), reconocido por su potencial antagonista sobre patógenos de las plantas (Sanz et al., 2004; Segarra et al, 2010). Su temperatura optima de crecimiento se encuentra entre 27–30°C con una maxima de 35 °C (Lieckfeldt et al., 1999; Hermosa et al., 2000; Watanabe et al., 2005), lo cual coincide con estudios previos en que mediante técnicas microcalorimétricas se determinó que la temperatura óptima para estas cepas es 30°C y que también mostraron capacidad de crecer a 35 °C (Guigón et al., 2010). Su actividad comúnmente se ha relacionado con la producción de enzimas quitinolíticas (Viterbo et al., 2002), β1,3–glucanasa y β1,6–glucanasa (Bara et al., 2003; Marcello et al., 2010) celulasas y proteasas (Sanz et al., 2004). También puede inducir resistencia sistémica contra patógenos foliares (Yeridia et al., 2003) y colonizar endofiticamente epidermis y corteza exterior de las radículas (Shoresh et al., 2005) o de tallos y hojas (Samuels, 2006). Futuros estudios deberán encaminarse a establecer el perfil de enzimas hidroliticas que sintetizan estas cepas y determinar su participación en el desarrollo del antagonismo contra hongos fitopatógenos.
CONCLUSIONES
De las seis cepas evaluadas de Trichoderma spp., cinco de ellas corresponden a T asperellum y la restante a T. longibraquiatum. Las cepas de T. asperellum, TC74, T341 y T359, desarrollaron la mayor tasa de crecimiento in vitro y mostraron la mayor capacidad antagónica in vitro contra los hongos fitopatógenos B. cinerea, R. solani, M. phaseolina y P. omnivora.
LITERATURA CITADA
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