Microorganismos Benéficos Asociados a Meloidogyne incognita (Kofoid y White) Chitwood en Guayabo (Psidium guajava L.) de Calvillo, Aguascalientes, México

Beneficent Microorganisms Associated to Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitwood in Guava (Psidium guajava L.) of Calvillo, Aguascalientes, México

Gabriel Gallegos–Morales¹, Melchor Cepeda–Siller¹, Francisco Daniel Hernández–Castillo¹, Ana María Acosta–Zamarripa², Rodolfo Velásquez–Valle³, Ernesto González–Gaona³ y Juan Manuel Sánchez–Yánez⁴

¹ Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Departamento de Parasitología Agrícola, Buenavista, Saltillo, Coahuila CP 25315. Correspondencia: ggalmor@uaaan.mx.

² SAGARPA, Sanidad Vegetal, Av. Convención de 1914 No. 2202, Colonia Buenos Aires, Aguascalientes, Ags. CP 20020.

⁴ Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Universidad Michoacana de San Nicolás Hidalgo, Ciudad Universitaria, Morelia, Michoacán, CP 58000.

Recibido: Noviembre 27, 2001
Aceptado: Septiembre 27, 2007

Resumen

Se identificó a Meloidogyne incognita como la especie del nematodo agallador que parásita al cultivo del guayabo, en la región de Calvillo (Aguascalientes, México). También se aisló hongos y bacterias benéficos asociados a suelo y raíces colectadas en las localidades de Cerro Blanco, Mesa Grande, La Labor y Malpaso. Veinte muestras distintas de Meloidogyne sp., fueron identificadas tomando en cuenta las características de patrones perineales de las hembras adultas así como por la observación de la región anterior de los machos. La especie Meloidogyne incognita fue identificada en todas las muestras. Los microorganismos benéficos aislados y asociados a la rizósfera del guayabo con uso potencial en control biológico, pertenecen a las especies de Bacillus cereus, B. subtilis B. megaterium y Paecilomyces farinosus. Además los nematodos edáficos Rhabditis y Mononchus fueron identificados en las muestras.

Palabras clave: Bacillus spp., Paecilomyces sp.

The root–knot nematode species Meloidogyne incognita was identified as the one species that parasites guava orchards in the Calvillo region (Aguascalientes, Mexico). Beneficent fungi and bacteria were isolated as well, associated to soil and roots collected from the Cerro Blanco, Mesa Grande, La Labor and Malpaso locations. Twenty different Meloidogyne sp., samples were identified taking adult female perinea pattern characteristics into account, as well as the male anterior region observation. The Meloidogyne incognita species was identified in all the samples. The isolated beneficent microorganisms and associated to guava rhizosphere with a potential use in biological control, belong to the Bacillus cereus, B. subtilis B. megaterium and Paecilomyces farinosus species. Furthermore, the Rhabditis and Mononchus soil nematodes were identified in the samples.

Key words: Bacillus spp., Paecilomyces sp.

INTRODUCCIÓN

En México, el cultivo del guayabo (Psidium guajava L.) ocupa una superficie aproximada de 22,489 ha, distribuidas en 22 estados. Las principales regiones productoras de guayaba del país se localizan en Aguascalientes, Michoacán y Zacatecas. En el Municipio de Calvillo, Aguascalientes, este frutal ocupa 6,643 ha que representan el 30% de la superficie plantada a nivel nacional, con un rendimiento promedio de 16 ton/ha (González, 2000; SIAP, 2008). En Aguascalientes se producen 98 mil toneladas anuales de fruta y se dedican a este cultivo alrededor de 3 mil productores que generan 1.4 millones de jornales al año, sin considerar los empleos en la industria, transporte y comercialización de la fruta (González et al., 2003). Los principales factores que limitan la productividad de las huertas de guayabo son de tipo agronómico: escasez y uso ineficiente del agua de riego, pobre fertilización, podas inadecuadas, presencia de plagas (picudo de la guayaba, Conotrachelus spp. Schonherr 1837; mosca de la fruta, Anastrepha striata Schiner, "temolillo", Cyclocephala lunulata Burmeister y la incidencia de enfermedades como clavo (Pestalotia sp. De Not); así como la presencia del nematodo agallador Meloidogyne spp., Goldi 1982, en el 90% de la superficie cultivada (Padilla et al., 2000). Este problema constituye uno de los factores limitantes de este cultivo debido a las grandes pérdidas en la producción, que fluctúan entre el 48 y 57% (González et al., 2003). Los primeros reportes sobre la presencia y daños del nematodo agallador de la región de Calvillo se realizaron a fines de la década de los 70's (Román, 1978; Ruiz, 1980; González y Rangel, 1985). Las especies del género Meloidogyne se encuentran ampliamente distribuidas en el mundo (Sasser, 1995) siendo, M. incognita (Kofoid y White, 1919) Chitwood, 1949, M. javanica (Treub, 1885) Chitwood, 1949, M. arenaria (Neal, 1889) Chitwood, 1949 y M. hapla Chitwood, 1949 las especies más comunes. Carrillo et al., reportaron en 1990 para el Cañón de Juchipila, Zacatecas, la presencia de algunos géneros de nematodos fitoparásitos como Helicotylenchus Steiner, 1945, Ditylenchus Filipjev, 1936, Aphelenchus Bastian 1865, Aphelenchoides Fischer, 1894, Criconemoides Taylor, 1936, Tylenchus sp., Bastian, 1865 y Dorylaimus Dujardin, 1845, pero consideraron a M. javanica como el causante de los mayores daños en el cultivo del guayabo. Los síntomas aéreos (Fig. 1) se manifiestan por presencia de manchones en el campo con zonas de clorosis, aún con fertilización adecuada; otros síntomas son: marchites de las hojas; reducción del crecimiento y del rendimiento de la planta. Los síntomas en las raíces se manifiestan por la adhesión de partículas de suelo (Fig. 1) en los lugares donde se encuentra alojada la hembra adulta (Suárez et al., 1995), necrosis externa e interna de las raíces, formación de agallas por multiplicación y aumento del tamaño de las células y proliferación del número de raíces por acumulación de sustancias de crecimiento (Avelar et al., 2001, 2005). Se ha pretendido regular las poblaciones de nematodos mediante el empleo de hongos (Tribe, 1980; Román y Rodríguez, 1985, Culbreath et al., 1986). Así, Freites et al. (1995) aislaron 19 cepas de Paecilomyces lilacinus Saccardo 1886 y observaron que esos aislamientos redujeron el número de agallas producidas por Meloidogyne spp. en el cultivo de tomate. En experimentos in vitro, Zavaleta y Van Gundy (1985) mostraron evidencias de que las sustancias volátiles producidas por la actividad de Serratia marcescensBizio 1823, B. subtilis Ehrenberg (1835) Cohn 1872, B. cereus Frankland y Frankland 1887, Micrococcus luteus (Schroeter) Cohn 1872, E. coli (Magula) Castellani y Chalmers 1919, y otras siete rizobacterias no identificadas estuvieron involucradas en la inactivación y muerte del segundo estadio juvenil de M. incognita. Los resultados experimentales indicaron que las bacterias fueron capaces de producir compuestos nematóxicos volátiles, solamente cuando la fuente de nitrógeno en su medio de crecimiento fue de origen orgánico. Dada la importancia de los microorganismos asociados a la rizosfera del guayabo como fuente de metabolitos activos para el control de nematodos, este trabajo planteo como objetivos: identificar las especies de hongos y bacterias asociados a las agallas de la raíz del guayabo así como las especies de Meloidogyne sp., presentes en la localidad de Calvillo, Aguascalientes, México.

MATERIALES Y MÉTODOS

Identificación de hembras y machos de Meloidogyne. De cada muestra de suelo se extrajo los nematodos en forma independiente, por medio de la técnica del Embudo de Baermann reportada por Thorne (1961). Para cada muestra se colocaron cinco embudos con 100 g de suelo por huerta; después de 48 h se obtuvieron los nematodos y se realizaron montajes, los cuales se identificaron de acuerdo al esquema de clasificación taxonómica propuesto por Thorne (1961), Jepson (1983) y Luc et al. (1988). Para confirmar la especie, de cada muestra de raíz se seleccionaron al azar veinte hembras de las cuales se obtuvo el patrón perineal, siguiendo la técnica de Taylor y Sasser (1978). Los cortes perineales se montaron en una gota de glicerina o lactofenol sellada con esmalte para uñas, se tomaron fotografías de los modelos perineales y se compararon con los presentados por Eisenback et al., 1983 y Harman y Sasser, 1985. La obtención de los nematodos edáficos se hizo mediante la técnica del embudo de Baermann a partir de muestras de suelo. De las cuales posteriormente se realizaron montajes y finalmente se identificaron mediante las claves pictóricas de Mai y Lyon (1975) y Cid del Prado (1995).

Obtención de bacterias del suelo y de hembras de Meloidogyne spp. Diez gramos de suelo se colocaron dentro de frascos conteniendo 90 mL de solución salina al 0.85 % y se agitaron durante 10 min. De esta suspensión se realizaron diluciones seriadas de 10^–1 hasta 10^–5 en tubos de ensaye; posteriormente, los tubos se colocaron en baño María durante 10 min a una temperatura de 60°C; de cada tubo se tomó 1.0 mL y se colocó en caja Petri con agar nutritivo, dispersándolo con una varilla de vidrio; enseguida las cajas se incubaron a 28°C durante 48 h. Pasado ese tiempo se seleccionaron y purificaron en el mismo medio de cultivo las colonias bacterianas que presentaron las características de forma y borde irregular, color blanco cremoso y seco, características del género Bacillus. De igual manera para el aislamiento de bacterias de hembras de Meloidogyne spp, se extrajeron directamente de agallas hembras que presentaron coloración amarilla a café obscura y se colocaron en placas del mismo medio de cultivo (agar nutritivo) para incubación y purificación.

Fueron seleccionados cinco aislamientos provenientes de suelo y cinco originadas a partir de hembras. A dichos aislados se les realizó pruebas de tinción Gram, presencia de flagelos, forma y posición de espora, oxidación y fermentación de glucosa, crecimiento a 50°C, crecimiento en NaCl al 7%, producción de ácido y gas, crecimiento a pH 5.7, utilización de citrato, hidrólisis de almidón y producción de acetoina para su identificación (Gordon et al., 1973; Schaad, 1980). Para identificar a B. cereus se utilizó el sistema de pruebas Biolog, para ello las colonias bacterianas obtenidas se sembraron en medio de Bug (Biological Universal Gram), adicionado con maltosa – tioglicolato de sodio y se incubaron 24 h. Este procedimiento se repitió dos días consecutivos para preparar finalmente una suspensión bacteriana a una turbidez del 28%. Se colocaron 150 μL de la suspensión anterior en cada pozo de la microplaca GP2, se incubaron a 35°C y se tomó la lectura después de 24 h. Con base en los resultados de coloración se conformó un patrón, el cual se interpreta a través de un programa computacional que confronta resultados positivos y negativos para identificación de las especies por similitud de pruebas (Biolog, 1999).

Obtención de hongos en hembras de Meloidogyne spp. De las agallas de las raíces se extrajeron 60 hembras aparentemente parasitadas, la superficie corporal de las cuales se desinfectó con una solución al 0.2% de hipoclorito de sodio durante 3 min. Se colocaron en placas de cultivo con papa dextrosa agar (PDA) y se incubaron a 24°C durante tres a siete días para permitir el crecimiento de colonias fungosas, las cuales se purificaron posteriormente en cajas de Petri con PDA. Las cepas puras se resembraron por duplicado para observación microscópica, mientras que la cepa madre se mantuvo en refrigeración para su mantenimiento.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En las cuatro huertas muestreadas, se obtuvieron hembras de Meloidogyne spp. de las agallas formadas en las raíces de los árboles infectados (Fig. 1A,B). Las características de la región cefálica anillada (dos anillos) y la parte anterior del estilete en forma de "remo" con punta roma, nódulos basales redondeados y la distancia de la base de los nódulos a la abertura de la glándula esofágica dorsal (DGED) corta, corresponden a M. incognita (Fig.1C). Además el patrón perineal con el arco dorsal alto, formado por estrías que variaron de lisas a onduladas que corresponden a la especie (Fig.1D). La presencia de M. incognita coincide con los reportes de Mata y Rodríguez (1985), al consignar una relación de 22 especies de nematodos que parasitan al guayabo en Hawai, dentro de ellos a M. incognita entre los más importantes. Cañizares (1968) reporta un trabajo realizado por Kühn, quien encontró cuando menos tres especies del género Meloidogyne parasitando las raíces de guayabo, datos similares a los de Avelar y colaboradores en 2001, quienes reportan a M. incognita (raza 2), M. javanica y M. arenaria con 65, 31 y 4 % de incidencia. En cuanto a los nematodos que se presentaron en las cuatro huertas en donde se llevaron a cabo los muestreos, se identificaron a los géneros Rhabditis sp. (Dujardín 1845, ) nematodo saprofito (Cepeda, 1996), así como Mononchus sp. (Bastian 1865,) depredador. La reportada anteriormente en el cultivo del guayabo en Aguascalientes.

Aislamiento y caracterización de bacterias. A partir de la suspensión del suelo y de las hembras de Meloidogyne sp. se lograron recuperar en agar nutritivo 18 colonias bacterianas, las que presentaron color blanco cremoso, crecimiento de colonial de forma irregular, superficie convexa y desarrollo abundante. Diez colonias bacterianas fueron positivas a la tinción de Gram, mostraron presencia de flagelos y espora central o subterminal (Fig. 1), lo cual corroboró que dichas colonias pertenecen al género Bacillus sp. (Schaad, 1980). Las pruebas bioquímicas citadas en la tabla 1 ubicaron a las bacterias com o B. megaterium, De Bary (1884) y B. subtilis , mientras que B. cereus correspondió a los aislamientos a partir de hembras de M. incognita (Cuadro 1); bacteria ya reportada por Zavaleta y Van Gundy (1985) con actividad para el control de M. incognita. En el cuadro comparativo 1, se muestra las propiedades de crecimiento de estas bacterias y las reportadas por Schaad (1980) confirmando con ello la similitud de la especie. La prueba de crecimiento a 50°C fue negativa en las tres especies, mientras que en NaCl al 7% fue positivo para las tres bacterias. En la producción de gas y ácido de glucosa oxidación–fermentación las tres bacterias presentaron reacción positiva. En la prueba de acetoina, las tres colonias de la especies de Bacillus mostraron una reacción positiva y el pH del medio se redujo a menos de seis. En la prueba de acetoina, las colonias de B. cereus y B. subtilis mostraron una reacción positiva, en tanto que en B. megaterium fue negativa. En la prueba de hidrólisis de almidón, las tres especies de Bacillus indicaron una reacción positiva. El hallazgo de las bacterias reportadas es importante ya que estas especies B. subtilis y B. cereus son las mismas que Zavaleta y Van Gundy (1985), reportan como involucradas en la inactivación y muerte del segundo estadio juvenil de M. incognita. Sin embargo, no se ha reportado que las tres especies se encuentren asociadas M. incognita, tal y como se encontró en este estudio, pues se logró aislar tanto del cultivo como de hembras de este nematodo. También, se aisló una colonia fúngica a partir de hembras de Meloidogyne. El hongo, identificado como Paecilomyces farinosus (Holmsk.) A. H. S. Br and G. Sm 1957, presentó colonias de color blanco–amarillo de crecimiento moderado; conidióforos erectos con hifas horizontales con fialides. Los conidióforos y ramificaciones fueron divergentes (Fig. 1F), conidios (fialosporas) en cadenas basipétalas secas, unicelulares, de ovoides a fusiformes, hialinas semejantes a las descritas taxonómicamente por Demach (1980). P. farinosus no se ha reportado previamente como parásito de hembras de Meloidogyne incognita o de nematodos, aunque se reporta como parásito de insectos (Demach, 1980), mientras que el único patógeno de Meloidogyne spp., reportado es P. lilacinus (Thom) Samson 1974 (Culbreath, 1986). Se concluye que la especie del nematodo agallador que se encontró parasitando al cultivo del guayabo en las cuatro localidades incluidas en el estudio (Cerro Blanco, Mesa Grande, La Labor y Malpaso) fue Meloidogyne incognita. Otros géneros de nematodos que se encontraron en suelo de árboles de guayabo parasitados por Meloidogyne spp. fueron: Rhabditis Dujardin 1845 y Mononchus Cobb, 1928. Las especies de bacterias B. subtilis y B. megaterum se encontraron asociadas a suelo del cultivo del guayabo, mientras que B. cereus se encontró frecuentemente asociada a suelo y a hembras de M. incognita, así como también el hongo Paecilomyces farinosus.

Rhabditis Dujardin 1845 and Mononchus Cobb, 1928. The B. subtilis and B. megaterum bacteria species were found associated to the guava cultivation soil, while B. cereus was frequently found associated to soil and M. incognita females, as well as the Paecilomyces farinosus fungi.

Agradecimientos. A Blanca Estela Mares Fermín y Cristina Sánchez Flores por su asistencia técnica en laboratorio.

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