Biocontrol in vitro e in vivo de Fusarium oxysporum Schlecht. f. sp. dianthi (Prill. y Delacr.) Snyder y Hans. con Hongos Antagonistas Nativos de la Zona Florícola de Villa Guerrero, Estado de México

In vitro and in vivo biocontrol of Fusarium oxysporum Schlecht. f. sp. dianthi (Prill. and Delacr.) Snyder and Hans. with native antagonist fungi from the flower–producing area in Villa Guerrero, State of Mexico

Jesús Gaudencio Aquino–Martínez¹, Luis Miguel Vázquez–García², y Basilio Gabriel Reyes–Reyes³

¹ Instituto de Investigación y Capacitación Agropecuaria, Acuícola y Forestal del Estado de México (ICAMEX), Laboratorio de Fitopatología, Conjunto Sedagro s/n, Metepec, Edo. México CP 52140. Correspondencia: jg_aquino@hotmail.com

² UAEM, Facultad de Ciencias Agrícolas, Campus Universitario El Cerrillo Piedras Blancas, Toluca, Edo. México CP 50200.

Recibido: Octubre 2, 2007
Aceptado: Noviembre 12, 2007

Resumen

Se obtuvieron 45 aislamientos de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi y 45 de hongos antagonistas (T01–T45): Trichoderma spp. (35) y Gliocladium spp. (10), de plantaciones comerciales de clavel en Villa Guerrero, México. La actividad antagónica de las cepas se evaluó in vitro, comparada con dos cepas comerciales: T. harzianum "PHC T–22" (T46), T. lignorum "Biotrol" (T47), y una cepa nativa de T. harzianum (T48). En invernadero, se valoró la actividad enzimática de los mejores aislamientos. Las cepas nativas T20, T22, T23, T24, T25, y comercial T47 de T. lignorum presentaron diferencias altamente significativas para: invasión de colonia del patógeno, crecimiento radial del antagonista y diferencia de crecimiento radial in vitro. La actividad celulolítica de las cepas T25 y T47 fue significativamente superior en suelo sin desinfección; T47 también la presentó en suelo desinfectado. Las cepas nativas son una alternativa para controlar la "dormilona" del clavel por F. oxysporum f. sp. dianthi, fomentar el biocontrol de patógenos y reducir la aplicación de plaguicidas en la zona florícola.

Palabras claves: Trichoderma lignorum, T. harzianum, hiperparasitismo.

Abstract

Keywords: Trichoderma lignorum, T. harzianum, hyperparasitism.

El clavel (Dianthus caryophyllus L.) es uno de los principales cultivos de la zona florícola del Estado de México, después del crisantemo (Dendranthema grandiflora Tzvelev, es la segunda flor de corte con mayor superficie cultivada en el municipio de Villa Guerrero con 470 ha (Secretaría de Desarrollo Agropecuario, 2007). El rendimiento y calidad de tallos florales son afectados por la enfermedad conocida regionalmente como "dormilona", causada principalmente por el hongo Fusarium oxysporum Schlecht. f. sp. dianthi (Prill. y Delacr.) Snyder y Hans., en campo e invernadero con incidencias entre 28 y 42% (Aquino y Sánchez, 2006). Se combate con fungicidas sistémicos del grupo de los benzimidazoles, pero su aplicación frecuente puede provocar contaminación del ambiente, favorecer la expresión de resistencia en el patógeno e incrementar los costos de cultivo (Núñez y Romero, 1980). Ello ha inducido la necesidad de probar otras estrategias de control del patógeno que no ocasionen disturbios ecológicos en el suelo, entre ellas el empleo de agentes de control biológico. El biocontrol por medio de microorganismos antagonistas representa una valiosa herramienta no química para la protección de los cultivos de clavel contra hongos patógenos del suelo (Ait–Lahsen et al., 2001). Los agentes de biocontrol utilizados actualmente para el combate de patógenos fungosos del suelo, incluyen especies de Trichoderma, Gliocladium y Fusarium no patogénico (Paulitz y Bélanger, 2001), que controlan los patógenos por antibiosis, competencia e hiperparasitismo (Graham y Mitchell, 1999; Weller et al., 2002). La antibiosis se expresa mediante la secreción de metabolitos secundarios que inhiben el desarrollo de hongos patogénicos, tales como la trichodermina (Dennis y Webster, 1971), gliovirina y gliotoxina (Howell y Stipanovic, 1995; Lumsden et al., 1992; Van Tilburg y Thomas, 1993), y compuestos furanónicos antimicrobiales como la 3–(1–hexanil)–5–hidroxi–5–metil–2,5(H) furanona (Paulitz et al., 2000), y la 6–pentil–a–pirona (Cooney et al., 2001). La competencia se da principalmente por espacio, nutrientes y factores de crecimiento (Elad et al., 1999; Graham y Mitchell, 1999; Weller et al., 2002). El hiperparasitismo se expresa vía la producción de enzimas líticas como las quitinasas, β 1–3 y β1–4 glucanasas (Graham y Mitchell, 1999; Lorito et al., 1996; Weller et al., 2002), y proteinasas (Ait–Lahsen et al., 2001), las cuales permiten la degradación de la pared celular del hospedante. Las celulasas son producidas en el suelo principalmente por hongos celulolíticos (Hayano, 1987; Rhee et al., 1987) y catalizan la hidrólisis de la celulosa a D–glucosa; consecuentemente, la producción de la D–glucosa indica la actividad de hongos antagonistas en el suelo. El uso de formulados biológicos comerciales presenta algunos inconvenientes con su persistencia en el suelo, debido por un lado a las características genéticas de las cepas y condiciones del medio ambiente como lo señalan González et al. (1999), por ser agentes introducidos a nuevos agroecosistemas, y por el otro, a los mecanismos de defensa de los patógenos (Duffy et al., 2003). Por lo anterior, se realizó un estudio con el propósito de colectar e identificar cepas nativas de hongos antagonistas en cultivos comerciales de clavel, evaluarlos in vitro como agentes de biocontrol de F. oxysporum f. sp. dianthi, y seleccionar los mejores aislamientos en el control del patógeno para probarlos en invernadero.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo de planta y suelo de la rizósfera. Durante la primavera y verano del 2005 se realizaron quince muestreos de planta y suelo en lotes comerciales de clavel, a cielo abierto y bajo cubierta plástica, distribuidos en cinco localidades de Villa Guerrero, México, región donde está presente el complejo "dormilona". Éstas se localizan entre las coordenadas 18°58'07'' a 19°00'44'' latitud norte y 99°39'06'' a 99°42'24'' longitud oeste, y altitudes de 2217 a 2445 msnm. Se caracterizan por su clima templado subhúmedo con lluvias en verano, con temperatura media de 18.8°C, máxima de 39.0°C y mínima de 2.0°C; el período de lluvias inicia en el mes de mayo y concluye en los primeros días de octubre (Guadarrama, 1999). Se muestrearon cultivos de clavel en etapa de floración con presencia de la enfermedad; de cada parcela se colectaron dos muestras de las camas o surcos centrales, una compuesta de tres plantas con síntomas iniciales de la enfermedad para obtener aislamientos del patógeno, y otra de tres plantas aparentemente sanas con suelo adherido a la raíz.

Aislamiento e identificación del hongo patógeno. De las plantas enfermas se hicieron siembras de raíz desinfectada en hipoclorito de sodio al 1% en medio de cultivo de papa–dextrosa–agar (PDA marca Bioxon); las placas se incubaron durante 5 a 8 días a 26 ± 1°C para lograr la esporulación del hongo. Se tomó un disco de crecimiento de 5 mm de la colonia con un sacabocados estéril y se transfirió a cajas de Petri con PDA para obtener cultivos uniformes. Se realizaron montajes temporales en lactofenol–azul de algodón y el patógeno se identificó empleando claves pictóricas para especies del género Fusarium (Seifert, 1996), tomando en cuenta la coloración de la colonia en PDA, presencia y tipo de estructuras reproductivas, así como la forma y dimensiones de los micro y macroconidios. Se tomó un disco de crecimiento de cada cultivo y se transfirió a placas de PDA para lograr 45 cepas de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod), éstas se etiquetaron para emplearlas en las pruebas de antagonismo in vitro.

Aislamiento e identificación de los hongos antagonistas. El suelo adherido a la raíz de las 45 plantas aparentemente sanas se limpió usando tamices sobrepuestos de 40 y 60 mallas/cm² para eliminar piedras y restos vegetales. Se hicieron diluciones, mezclando 10 g de suelo en 90 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 125 mL de capacidad. Se tomó 1 mL con una pipeta para sembrar tres cajas de Petri de PDA por muestra y se incubaron a 26 ± 1°C durante 5 a 8 días para lograr la esporulación de los hongos. Los crecimientos de color verde y amarillo se transfirieron a placas de PDA para obtener cultivos uniformes; los aislamientos de igual coloración se agruparon para su identificación. Se hicieron montajes temporales de estructuras reproductivas de los hongos en lactofenol–azul de algodón y se identificaron tomando en cuenta la coloración de la colonia, forma de los conidióforos, forma y dimensiones de los conidios, empleando claves taxonómicas para hongos imperfectos (Barnett y Hunter, 1978) y especies del género Trichoderma (Domsch et al., 1980). Se seleccionaron 45 cepas nativas de hongos antagonistas, correspondientes a igual número de muestras de suelo, se etiquetaron para usarse en pruebas de antagonismo in vitro.

Diseño experimental. Se probaron 48 tratamientos: las 45 cepas nativas de hongos antagonistas obtenidas de la zona florícola de Villa Guerrero (T01–T45), dos cepas comerciales, una de T. harzianum (PHC T–22) (T46) de la empresa Plant Health Care de México, S. de R.L. de C.V y otra de T. lignorum (Biotrol) (T47) de la empresa Biotropic, S.A. de C.V, y una cepa nativa de T. harzianum (T48) aislada de esclerocios de Rhizoctonia solani Kühn en Metepec, Edo. de México. Cada una de las 48 cepas antagonistas se confrontó con las 45 del patógeno, en cultivos duales, bajo un diseño experimental de bloques al azar con tres repeticiones, para un total de 6480 pruebas.

Eficiencia de biocontrol. Se determinó empleando la fórmula: EB = (CRA–CRP/CRA) x 100, adaptada de la fórmula de Abbot (Unterstenhofer, 1976); donde: EB = Eficiencia de biocontrol en porcentaje, CRA= Crecimiento radial del antagonista en cm y CRP = Crecimiento radial del patógeno en cm.

bservación en el microscopio electrónico. Los crecimientos fungosos de las zonas de invasión e inhibición de los cultivos duales, se observaron en un microscopio electrónico de barrido de bajo vacío JEOL JSM 59500LV, propiedad del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (ININ), con una capacidad de resolución de 20 a 200,000X, usado para analizar muestras biológicas sin preparación previa. Cada muestra se observó en aumentos de 500 y 1000X, empleando un voltaje de 20 KV, distancia de trabajo de 10 mm, señal de retrodispersos y Spotsize de 50.

Establecimiento del estudio en invernadero. Las cepas nativas T20, T22, T23, T24 y T25, y comercial de T. lignorum (T47) sobresalientes en laboratorio, así como las dos cepas de T. harzianum (T46) y (T48) se incrementaron en PDA a 26 ± 1°C durante ocho días. Con una suspensión de conidios de 5.66 x 10⁵ UFC mL^–1 se inoculó 1 kg de salvado de trigo, previamente esterilizado en autoclave durante 60 min a 120°C y 15 libras de presión, y se incubó en bolsas de polietileno negro por 21 días a temperatura ambiente en un sitio oscuro. De la misma forma, la cepa FO18 de Fod, de probada agresividad, se multiplicó en PDA para preparar una suspensión de conidios de 1.3 x 10⁴ UFC mL^–1. Un mes antes del establecimiento del estudio, se preparó el suelo de un invernadero rústico en el Centro de Investigación y Transferencia de Tecnología "El Islote", Villa Guerrero, México, con suelo de textura franca (51% arena, 32% limo y 17% arcilla), pH de 5.7, contenido de materia orgánica de 4.5%, fósforo, 79.22 ppm, potasio, 365 ppm, calcio, 1881.5 ppm, y magnesio, 181 ppm. La mitad de la superficie se desinfectó con metam sodio al 24% (Busan 1020) en dosis de 1 L por 10 m², y la otra se dejó sin desinfectar. Después de 21 días se conformaron cuatro camas de plantación de 32 m de largo por 1 m de ancho y pasillos de 60 cm de ancho. El experimento se realizó, tanto en suelo sin desinfectar como en suelo desinfectado, bajo un diseño experimental de bloques completos al azar con diez tratamientos: ocho cepas antagonistas (T20, T22, T23, T24, T25, T46, T47, T48), en dosis de 150 g de salvado inoculado por m², un fungicida (tiofanato metílico) como testigo comercial a razón de 1 mL por L de agua y un testigo absoluto, con cuatro repeticiones y 40 unidades experimentales de 1.5 m². Los tratamientos biológicos se aplicaron tres días antes de la plantación de acuerdo con Elad et al. (1981). Luego de un riego se plantaron esquejes de clavel cv. Red Lips en marcos de plantación de 20 x 20 cm, 35 plantas por unidad experimental. Una semana después se inocularon las plantas y el suelo adyacente con 7 L de la suspensión de conidios de Fod, mediante aspersión dirigida al cuello de éstas con una aspersora manual en suelo previamente humedecido. El fungicida se aplicó con una aspersora manual, cinco días después de la inoculación con el patógeno, en aspersión dirigida al cuello de las plantas.

Actividad enzimática de los antagonistas en el suelo. Se tomaron cuatro series de muestras de suelo de la rizósfera de las plantas de clavel cultivadas en suelo sin desinfectar y en suelo desinfectado a los 90, 120, 150 y 180 días de la plantación. Las muestras se procesaron en el Laboratorio de Análisis de Suelos del ICAMEX empleando la metodología propuesta por Schinner y Von Mersi (1990) y modificada por Alef y Nannipieri (1999). La D–glucosa producida se calculó empleando la siguiente ecuación: Glucosa equivalente (μg g dwt^–1 24h^–1) = C x v x f/sw x dwt; donde: C es la concentración de glucosa medida de glucosa filtrada mL^–1), v es el volumen de la suspensión de prueba (30 mL), f es el factor de dilución (20), sw es el peso de suelo húmedo usado (10 g), y dwt, es el peso de 1 g de suelo húmedo.

Análisis estadístico. Los resultados obtenidos de los estudios de laboratorio e invernadero se sometieron a un análisis de varianza empleando el Sistema de Análisis Estadístico SAS versión 8 (1999) y la comparación de promedios se hizo mediante la prueba de diferencia mínima significativa (DMS) (Steel y Torrie, 1986).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento e identificación de los hongos antagonistas. En las cinco localidades se obtuvieron aislamientos de hongos antagonistas asociados a la rizósfera de plantas de clavel. Las cepas correspondieron a Trichoderma spp. (24), Trichoderma lignorum (Tode) Harz (7), Trichoderma harzianum Rifai (4) y Gliocladium spp. (10) (Cuadro 1). Estos resultados están de acuerdo con lo encontrado por Núñez y Romero (1980), Guigón–López y González–González (2004), Michel–Aceves et al. (2006) y Sánchez et al. (2007), quienes obtuvieron cepas nativas de Trichoderma spp. de la rizósfera de clavel y de otros cultivos. Los ecosistemas agrícolas contienen gran cantidad y diversidad de microorganismos benéficos (Duffy et al., 2003), por lo que no es raro que se hayan aislado hongos antagonistas de todas las muestras colectadas. La especie más común T. harzianum (Samuels, 1996), sólo se encontró en una localidad, pero, el género Trichoderma está presente en todas las localidades, lo que resalta su amplia distribución (Woo et al., 2006). Las dos especies de Trichoderma identificadas en la zona han sido reportadas como agentes de biocontrol de diversos hongos patógenos del suelo (Cook y Baker, 1983; Graham y Mitchell, 1999; Mishra et al., 2000; Paulitz y Bélanger, 2001), como Fusarium spp. (Alabouvette, 1986; Alabouvette et al., 1993; Michel–Aceves et al., 2001, 2006; Núñez y Romero, 1980; Scher y Baker, 1980). A diferencia de Gliocladium spp., los hongos del género Trichoderma son los que más se han estudiado en el biocontrol de hongos patógenos del suelo, debido a su amplia distribución en los suelos del mundo (Harman, 2006; Samuels, 1996; Woo et al., 2006), y mayor rango de hospedantes (Paulitz y Bélanger, 2001).

Pruebas de antagonismo in vitro. Se observaron diferencias altamente significativas (P < 0.01) entre los tratamientos para todas las variables–respuesta evaluadas en las pruebas de antagonismo. De las 48 cepas probadas, seis de T. lignorum invadieron claramente la colonia del patógeno durante la confrontación: T47 (aislamiento comercial Biotrol), T20, T22, T23, T24 y T25 (Cuadro 2). Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Guigón–López y González–González (2004), Michel–Aceves et al. (2001 y 2006) y Sánchez et al. (2007), quienes observaron inhibición de crecimiento de micelio y sobreposición de las colonias de Phytophthora capsici Leonian, F. oxysporum y F. subglutinans (Wollenweb. y Reinking) Nelson, Toussoun y Marasas, y Thielaviopsis paradoxa (De Seynes) Hõhn. por el crecimiento de las cepas nativas de Trichoderma spp., respectivamente, atribuyendo este modo de acción al micoparasitismo; pero, difieren parcialmente de lo consignado por Guigón–López y González–González (2004), que encontraron invasiones totales de las colonias del patógeno por el antagonista, situación que no se dio en este estudio, ya que la invasión fue parcial en los tratamientos sobresalientes a los ocho días de la prueba (Fig. 1A), sólo en algunos casos se notó cubrimiento total de la colonia del patógeno a los 12 días de incubación. Dado que la observación microscópica de la zona de sobreposición únicamente mostró la presencia de micelio y conidios de T. lignorum (Fig. 1B), el crecimiento y la formación de estructuras reproductivas de Fod fueron suprimidos por el antagonista (Guigón–López y González–González, 2004), o bien, degradados por la acción de enzimas líticas de la pared celular como las quitinasas y celulasas (Graham y Mitchell, 1999; Lorito et al., 1996; Weller et al., 2002). Otro mecanismo de antagonismo fue la competencia por espacio y nutrientes en el medio de cultivo por la velocidad de crecimiento de la colonia de T. lignorum (Benhamou y Chet, 1993; Elad et al., 1999; Graham y Mitchell, 1999; Weller et al., 2002). Un comportamiento diferente se observó en algunas cepas nativas de Gliocladium spp., T. harzianum y T. harzianum Metepec y la cepa comercial PHC T–22, que promediaron pocas pruebas con esta respuesta (Cuadro 2). El aislamiento de T. harzianum Metepec (T48) fue significativamente mejor en la detención del crecimiento de las colonias del patógeno, seguido de T. harzianum (T41 y T42) y Gliocladium spp. (T10, T11 y T13). En éstos se observó un rápido crecimiento del micelio como consecuencia del mejor aprovechamiento de los nutrientes del medio de cultivo, ocupando mayor espacio en la placa, lo cual detuvo el crecimiento del patógeno; el mecanismo de antagonismo fue de competencia tal como lo mencionan Benhamou y Chet (1993), Elad et al. (1999), Graham y Mitchell (1999) y Weller et al. (2002). El tratamiento con mayor número de respuestas de antagonismo mutuo fue el aislamiento comercial de PHC T–22 (T46), seguido de Trichoderma spp. (T30, T01), y T. harzianum (T41, T43, T42) (Cuadro 2). El crecimiento de estas cepas fue menor que el de las sobresalientes en sobreposición y detención de crecimiento, dando origen a la formación de un halo de inhibición entre los crecimientos del antagonista y el patógeno, y degradación del micelio del primero (Fig. 1C). La observación microscópica mostró escasa producción de conidios de T. harzianum, y presencia de microconidios y clamidosporas de Fod en la periferia de la zona de inhibición (Fig. 1D). Esta respuesta pudo deberse al desarrollo de mecanismos de defensa del patógeno, el antagonista, o ambos (Dennis y Webster, 1971; Elad et al., 1999; Howell y Stipanovic, 1995). Aunque, la degradación del micelio del antagonista indicó actividad lítica de Fod, el cual tiene la capacidad de parasitar a T. harzianum liberando enzimas como quitinasas y celulasas; también libera toxinas como el ácido fusárico que inhiben el crecimiento micelial del antagonista (Duffy et al., 2003).

Actividad enzimática de los antagonistas en el suelo. El aislamiento de Biotrol mostró actividad celulolítica en la rizósfera de la planta de clavel con producción de D–glucosa significativamente mayor al testigo, tanto en suelo sin desinfección como en suelo desinfectado; la cepa nativa T25 de T. lignorum sobresalió únicamente en suelo sin desinfectar. La actividad celulolítica de las cepas restantes fue estadísticamente igual a la del testigo en ambas condiciones. En suelo desinfectado, la producción de D–glucosa en los tratamientos de T. harzianum Metepec y el fungicida tiofanato metílico fue estadísticamente menor a la producida por las cepas nativas y comerciales de T. lignorum y la cepa comercial PHC T–22 (Cuadro 4). Estos resultados se relacionan parcialmente con los reportados por Sánchez et al. (2007), quienes observaron la producción de glucanasas por las cepas nativas de Trichoderma longibrachiatum Rifai probadas contra el patógeno Thielaviopsis paradoxa; dicha producción contribuyó a la degradación de las hifas del hongo en condiciones de laboratorio. En nuestro estudio, existió actividad enzimática en el testigo y el tratamiento fungicida en las dos condiciones de suelo, lo cual puede atribuirse a la contaminación de las unidades experimentales de estos tratamientos con los propágulos de los antagonistas aplicados, a causa de la distribución aleatoria de los tratamientos; o bien, a la actividad celulolítica de otros microorganismos competidores en la rizósfera por el alto contenido de materia orgánica (4.5%) del suelo del invernadero, que puede soportar una abundante población microbiana lítica (Graham y Mitchell, 1999; Weller et al., 2002). Esto enmascara la verdadera producción extracelular de enzimas líticas por los antagonistas en el suelo del invernadero, condición que es más fácil de probar in vitro (Guigón–López y González–González, 2004; Sánchez et al., 2007). Sin embargo, los resultados obtenidos confirman la producción de enzimas líticas por las cepas nativas y comerciales de T. lignorum y T. harzianum en la rizósfera de las plantas de clavel, mecanismo importante para el biocontrol de Fod. Lo anterior demuestra que a pesar del uso indiscriminado de plaguicidas en la zona florícola de Villa Guerrero, los suelos cultivados con clavel contienen especies de hongos antagonistas, que pueden jugar un importante papel en la sanidad de las plantas y productividad de los cultivos. Los estudios de laboratorio e invernadero probaron la habilidad de las cepas nativas de T. lignorum: T20, T22, T23, T24 y T25, para desarrollar actividad antagónica y enzimática que les permitió actuar sobre Fod. La capacidad de estas cepas para invadir y sobrecrecer al patógeno es de importancia para nuevas investigaciones en el manejo de la "dormilona". La confirmación de la presencia de hongos antagonistas en el suelo y rizósfera de clavel y su capacidad de biocontrol del patógeno, abre la posibilidad del uso de las cepas sobresalientes en la protección del cultivo contra la enfermedad, así como fomentar el control biológico de los patógenos del suelo y contribuir en la reducción de la aplicación de plaguicidas en la zona. Pero, es necesario continuar con el estudio de estos agentes de biocontrol para conocer aspectos como sobrevivencia en suelo, colonización de la raíz y eficiencia de control de la enfermedad en invernadero, para asegurar su éxito en campo, ya que son microorganismos cuya actividad y eficiencia de control de los patógenos están sujetas a las condiciones físicas, químicas y biológicas del suelo.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación fue financiada por la Fundación Produce Estado de México y forma parte del proyecto interdisciplinario "Control biológico de la pudrición del tallo del clavel en el municipio de Villa Guerrero" con No. de Folio 15–2005–0650.

LITERATURA CITADA

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