La Producción de Especies Reactivas de Oxígeno Durante la Expresión de la Resistencia a Enfermedades en Plantas
Production of reactive oxygen species during the resistance expression of plants to diseases
Micaela Benezer–Benezer, Elda Castro–Mercado y Ernesto García–Pineda
Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Lab. de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, Edif. B1, Ciudad Universitaria, Morelia, Michoacán, México CP 58040. Correspondencia: egpineda@zeus.umich.mx
]]> Recibido: Septiembre 10, 2007
Resumen
Las plantas responden a la infección por patógenos, al daño mecánico o herida inducida por herbívoros con una producción localizada de especies reactivas de oxígeno (ERO), un fenómeno referido con frecuencia como "explosión oxidativa". Si bien se han identificado algunas fuentes potenciales de ERO, no es claro cuales mecanismos predominan durante las interacciones planta patógeno. Las ERO tienen una función importante en el inicio de la respuesta hipersensible, una forma de muerte celular programada inducida por patógenos incompatibles (avirulentos), y efectos directos sobre el patógeno, el entrecruzamiento oxidativo incrementando los polímeros de pared celular y la inducción de expresión de genes que responden a patógeno. En este artículo se revisa la química y la función de estos compuestos durante una interacción planta–patógeno.
Palabras clave: Antioxidantes, respuestas de defensa.
Abstract
Plants respond to pathogen infection and mechanical or herbivore–induced wounding by localized production of reactive oxygen species (ROS), a phenomenon often referred to as the "oxidative burst". Although some potential sources of ROS in plant cells have been identified, it is still unclear which mechanisms predominate during plant–pathogen interactions. ROS have a role in initiating the hypersensitive response, a form of programmed cell death induced by incompatible (avirulent) pathogens, and direct effects on the pathogen, increased oxidative cross–linking of cell wall polymers and induction of pathogen response gene expression. In this paper we focus on the chemistry and the role of these compounds during a plant–pathogen interaction.
Key words: Antioxidants, defense responses.
]]>INTRODUCCIÓN
Cuando una célula vegetal detecta la presencia de un patógeno se activa una reacción de defensa inducida. Esta reacción es más severa a nivel local, en el tejido que está directamente en contacto con el patógeno, y más débil a nivel sistémico, en los tejidos no infectados de la planta. Este tipo de reacción permite potenciar las barreras de defensa, tanto químicas como estructurales en el tejido que está siendo atacado. A la reacción local se le llama respuesta de hipersensibilidad (HR) y puede conducir a la necrosis del tejido infectado. La necrosis se produce fundamentalmente por la acumulación abundante de compuestos químicos, entre los cuales se encuentran la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) y las fitoalexinas. Específicamente, el término "especies reactivas de oxígeno" incluye a todas las moléculas derivadas del oxígeno, a los radicales y a los no radicales. El término también incluye al óxido nítrico (ON), una molécula de señalización importante en animales y plantas (Halliwell et al., 1999). Un radical libre es cualquier especie capaz de tener una existencia independiente que contiene uno o más electrones no apareados (Halliwell y Gutteridge, 2006). Existen diversos tipos de radicales libres en sistemas biológicos, pero esta revisión se enfocará específicamente a los radicales libres derivados del oxígeno, debido a su importancia durante la patogénesis. ¿Cómo se producen las especies reactivas de oxígeno?, ¿Qué daños provocan a las células?, ¿Cuál es su función durante la patogénesis?, y ¿Cómo se regula su producción?, son algunas de las preguntas cuyo análisis es el objetivo de esta revisión.
La química del oxígeno activo. El oxígeno molecular en su forma más estable (O2, en esta forma se encuentra en el aire que nos rodea) se puede considerar como un radical libre pues tiene dos electrones no apareados, con giros paralelos, y es un potente agente oxidante, sin embargo, para oxidar una molécula no radical y aceptar un par de electrones estos electrones deben de tener el mismo giro (paralelo) para ocupar los orbitales vacantes en el O2. Los electrones de un átomo o de una molécula no cumplen con este criterio puesto que tienen giro antiparalelo. Esta restricción de giro hace que el O2 acepte sólo un electrón a la vez y explica porqué reacciona lentamente con la mayoría de las moléculas no radicales. Por el contrario, reacciona notablemente rápido con radicales por transferencia de un solo electrón (Halliwell y Gutteridge, 2006).
Así, aunque el oxígeno molecular en su estado basal es poco reactivo, su reducción parcial genera ERO, incluyendo el anión superóxido (O2–), el peróxido de hidrógeno (H2O2), y el radical hidroxilo (OH). La primera reacción en la reducción parcial del oxígeno molecular es la adición de un electrón para formar O2–. Este puede ser protonado a pH bajo (pKa = 4.8) para formar el radical perhidroxilo (HO2). El O2– y HO2 sufren una dismutación espontánea para producir H2O2 (Fig. 1). El H2O2 es estable y menos reactivo que el O2–. Sin embargo, en la presencia de metales de transición reducidos como el Fe2+, que pueden estar libres o formando complejos con agentes quelantes o proteínas, puede ocurrir la formación del OH dependiente de H2O2, y el O2– puede actuar como el agente reductor inicial para el metal. El OH' es un oxidante muy fuerte y puede iniciar reacciones en cadena de radicales con una gran variedad de moléculas orgánicas, esto puede llevar a la peroxidación de lípidos, inactivación de enzimas, y degradación de ácidos nucléicos. La mayoría de las moléculas biológicas no son radicales y cuando un radical libre reacciona con un no radical, se forma un nuevo radical y sucede una reacción en cadena (Halliwell y Gutteridge, 2006).
Óxido nítrico (ON). La importancia del ON durante la patogénesis y las respuestas de defensa se han reportado en diversas investigaciones. El ON es una molécula gaseosa considerablemente móvil y es capaz de atravesar libremente las membranas biológicas. Está formada por dos átomos, un átomo de oxígeno (O) y otro de nitrógeno (N), cuando estos dos átomos se encuentran sus electrones se aparean para formar una molécula de ON, que contiene un electrón desapareado. La presencia del electrón desapareado permite al ON interactuar rápidamente con otros átomos que son abundantes en los sistemas biológicos, tal como el N y el azufre (S), que forman parte de las proteínas. La unión del ON a las proteínas, u otras moléculas, se llama nitrosación, y este proceso es la base química que permite al ON ejercer diversas funciones en los organismos. El ON también interactúa con átomos metálicos como el hierro (Fe), el cual forma parte de proteínas que se conocen como ferroproteínas o hemoproteínas. Estas proteínas son fundamentales en la regulación de un gran número de funciones biológicas como la producción de energía, el transporte y almacenamiento del oxígeno y la transducción de señales (Gow y Ischiropoulos, 2001). Por otro lado, el ON reacciona rápidamente con el oxígeno molecular (O2) y sus diferentes formas altamente reactivas, como los radicales superóxido (O2–.) e hidroxilo (OH'), los cuales son sumamente tóxicos. La interacción del NO con el O2– genera peroxinitrito y otras formas reactivas del N que también son tóxicas, por lo tanto, la combinación del ON con las formas reactivas del O2 constituye el principal mecanismo mediante el cual el ON daña a las células. El óxido nítrico regula las defensas antimicrobianas en mamíferos, particularmente la muerte celular programada, debido a lo cual ha generado un interés considerable en los biólogos vegetales. Esta molécula emerge como una señal importante durante las interacciones planta–patógeno (Delledonne, 2005; Romero–Puertas et al., 2004; Wendehenne et al., 2004). Además de su papel en la respuesta hipersensible tiene otras funciones durante la defensa de la planta y puede influenciar la virulencia de los patógenos (Greenberg y Yao, 2004). El ON en sistemas biológicos puede ser producido por mecanismos enzimáticos o no enzimáticos. Las enzimas descritas para producirlo son la óxido nítrico sintasa (ONS) y la nitrato reductasa (NR). La ONS cataliza la oxidación en dos pasos de la L–arginina para producir ON y citrulina (Boucher et al., 1992). La NR genera ON de nitrito utlizando NADPH como donador de electrones (Kaiser et al., 2002; Yamasaki y Sakihama, 2000).
Formación de las especies reactivas de oxígeno. Las ERO generadas durante la patogénesis son producidas de manera característica fuera de la membrana plasmática de las células vegetales (apoplasto) (Doke y Ohashi, 1988; Levine et al., 1994). Mediante el uso de inhibidores específicos, se han postulado dos mecanismos enzimáticos como los responsables más probables de esta producción en el apoplasto. El primero involucra a la enzima NADPH oxidasa localizada en la membrana plasmática, la cual se considera como la principal fuente de ERO en respuesta a varios patógenos (Torres et al., 2002; Yoshioka et al., 2003). Esta enzima es similar al sistema enzimático que produce superóxido en las células fagocíticas animales (Lambeth, 2004). En plantas, lo mismo que en animales, existe una familia génica de estas oxidasas (llamadas Rboh, Respiratory burst oxidase homologs), al igual que una familia génica de GTPasas rac/ rop reguladoras de la actividad de la enzima (Torres y Dangl, 2005). Ello sugiere que diferentes miembros de esta familia de oxidasas puedan mediar la producción de ROS en diferentes situaciones, no sólo ante la acción de patógenos sino también en otras respuestas al entorno, así como en procesos del desarrollo. El segundo mecanismo está formado por las peroxidasas de la pared celular, las cuales pueden contribuir a la producción apoplástica de ERO en algunas interacciones planta patógeno (Bolwell et al., 1998). Ambos mecanismos enzimáticos pueden producir ERO en diferentes contextos espacio/temporales (Soylu et al., 2005), lo cual sugiere una diferencia funcional entre las ERO producidas fuera de la célula vegetal.
ERO en la interacción planta/patógeno. En1983 Doke reportó la generación de anión superóxido y peróxido de hidrógeno como una nueva respuesta distinta a las defensas clásicas en plantas. Demostró la producción de O2– después de la inoculación con una raza incompatible de Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, pero no después del tratamiento con una raza compatible. Desde entonces la generación rápida de oxidantes ha sido descrita en varias interacciones planta/ patógeno, y como una característica de la RH. Con la clonación de genes R surgió un gran interés en la explosión oxidativa como una de las primeras respuestas al ataque por patógenos (Alvarez y Lamb, 1996; Baker y Orlandi, 1995; Dixon et al., 1994; Mehdy, 1994). Las ERO desempeñan un papel importante durante la defensa de las plantas en contra de patógenos. Como resultado de la respuesta de la planta, se producen ERO por un incremento en la actividad de las enzimas NADPH oxidasa, ubicada en la membrana plasmática, peroxidasas unidas a la pared celular y aminooxidasa ubicadas en el apoplasto. A diferencia del anión superóxido, el peróxido de hidrógeno puede difundirse al interior de la célula y activar los genes de defensa, conduciendo a la muerte celular programada (MCP) (Davison et al., 2002; Grant y Loake, 2000; Hammond–Kosack y Jones, 2000). Además, la actividad de las enzimas que destoxifican a las ERO, tales como catalasa y ascorbato peroxidasa son suprimidas por ácido salicílico y óxido nítrico (Klessig et al., 2000.), como resultado se crea un balance en favor de la acumulación de ERO. La inducción de la MCP eventualmente limita el avance del patógeno más allá del sitio de infección. Durante reacciones incompatibles, cuando un patógeno es detectado como un enemigo y las respuestas de defensa se activan, la producción de H2O2 muestra un comportamiento bifásico. Una acumulación inicial rápida de H2O2 (fase I) es seguida por una segunda y más prolongada producción de H2O2 (fase II). En las interacciones compatibles, cuando un patógeno vence los sistemas de defensa de la planta y provoca una enfermedad, solamente se observa el primer pico de producción de H2O2. Se ha observado que la fase I es una reacción biológicamente inespecífica, mientras que la fase II requiere de la acción de los genes avr del patógeno durante una interacción raza–cultivar específica y correlaciona con la resistencia de la planta (Baker y Orlandi, 1995).
]]> Función de las ERO en la respuesta contra patógenos. La correlación entre la acumulación de ERO y el establecimiento de las defensas sugiere que las ERO podrían tener una función tóxica directa sobre los patógenos, o sobre las células en donde se producen. Las evidencias además indican que las ERO actúan como señales regulando el establecimiento de la reacción de defensa a nivel de la expresión génica o el fortalecimiento de la pared celular vía entrecruzamiento de proteínas de la pared (Apostol et al., 1989; Babior, 1992; Blechert et al., 1995). También se ha postulado que las ERO participan en la inducción de la muerte celular programada en el sitio de infección, lo que contribuye a limitar la invasión de los potenciales patógenos (Bokoch, 1994). Las ERO pueden tener funciones opuestas en diferentes interacciones planta/ patógeno siendo en algunos casos reguladores positivos de las reacciónes de defensa y muerte celular, mientras que en otros casos actúan como reguladores negativos (Montillet et al., 2005). En rutas de transducción de señales inducidas por patógenos o estimuladores, las ERO participan en la activación de proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAPK; Mitogen Activated Protein Kinases), en el cambio en los niveles de Ca2+, y en la modificación del estado redox celular (Rentel y Knight, 2004). En plantas el estado redox regula a NPR1, un activador esencial de las respuestas de defensa que dependen del acido salicílico. NPR1 se acumula en el citosol como un oligomero inactivo mantenido así por enlaces disulfuro, después de la estimulación su reducción libera unidades monoméricas que migran hacia el núcleo e interactúan con el factor de trascripción reducido TGA1, el cual en turno activa la expresión de genes de defensa dependientes de acido salicílico (Mou et al., 2003). Así, la cascada de señalización activada por ERO inicia un cambio global en el transcriptoma para ejecutar programas genéticos apropiados. En células de Arabidopsis tratadas con H2O2 se observaron cambios en el perfil de expresión de 175 genes (de 11,000 analizados). Estos genes codifican para enzimas antioxidantes, proteínas asociadas con la defensa o con funciones de señalización tales como cinasas o factores de transcripción (Desikan et al., 2001) (Fig. 2). Se ha propuesto que las ERO, en combinación con el ácido salicílico, puedan ser moléculas reguladoras del establecimiento de las defensas sistémicas en contra de patógenos (Bolwell et al., 1995). La rápida producción de ERO y la capacidad de difusión del H2O2 a través de membranas ha hecho pensar que esta molécula puede actuar como segundo mensajero intra o intercelular (Pitzschke y Hirt, 2006; Van Breusegem y Dat, 2006). Aunque la acumulación de ERO correlaciona normalmente con el establecimiento de las respuestas de resistencia a la enfermedad, algunos organismos patógenos pueden salir beneficiados con su acumulación e incluso se postula que inducen su producción con este propósito. Es, por ejemplo, el caso de algunos necrótrofos que estimulan la acumulación de ERO para inducir mayor muerte celular, lo que favorece la diseminación de la infección (Chamnongpol et al., 1996; Chandra y Low. 1995).Defensas en contra de la producción de las ERO. Para disminuir el daño provocado por la producción de ERO los organismos aeróbicos han evolucionado mecanismos antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos. Los antioxidantes no enzimáticos incluyen al ascorbato, glutatión, tocoferol, flavonoides, alcaloides y carotenoides. Estos eliminan directamente al anión superóxido y al peróxido de hidrógeno por su capacidad antioxidante intrínseca (Halliwell, 2006). Los mecanismos enzimáticos incluyen a las enzimas superóxido dismutasa (SOD), ascorbato peroxidasa (AP), glutatión peroxidasa (GP) y catalasa (CAT). SOD actúa como la primera línea de defensa en contra de las ERO transformando el O2.–en H2O2. Las enzimas AP, GP y CAT subsecuentemente lo destoxifican reduciendolo a H2O. A diferencia de la mayoría de los organismos, las plantas tienen múltiples genes que codifican para SOD y AP, las cuales están específicamente localizadas en los cloroplastos, la mitocondria, peroxisomas, citosol y apoplasto (Asada, 2006). La extensión del estrés oxidativo en una célula está determinada por la cantidad de superóxido, H2O2 y radicales hidroxilo. Por lo tanto, el balance de las actividades de SOD, AP y CAT es crucial para suprimir los niveles tóxicos de ERO en la célula. Si cambia el balance de estas enzimas se inducen mecanismos compensatorios que involucran a otras enzimas, por ejemplo, cuando se reduce la actividad de CAT otras enzimas como ascorbato peroxidasa (APX) y glutation peroxidasa (GPX) son inducidas.
CONCLUSIÓN
La producción de ERO en plantas es esencial para la defensa en contra de la infección por patógenos.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo financiero otorgado por el CONACYT para la realización de esta investigación (P43438–Z).
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