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Introducción
El glaucoma se caracteriza por una serie de neuropatías progresivas y crónicas que dañan las células ganglionares retinianas del nervio óptico1 y provocan una progresiva pérdida del campo visual que, si no se trata, termina en ceguera2. El glaucoma afecta a más de 70 millones de personas y es la principal causa de ceguera irreversible2. También es importante mencionar que esta enfermedad es más prevalente entre la población hispana y de raza negra. Existen varios factores de riesgo asociados al glaucoma, siendo el principal la presión intraocular (PIO)2.
El glaucoma se clasifica como glaucoma de ángulo abierto o cerrado. Esta clasificación se puede, a su vez, subdividir en primario (idiopático) o secundario (si está asociado a una comorbilidad detectable)3. El glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA) es el tipo más común de glaucoma que existe y corresponde al 40% de los casos de glaucoma descritos en México4. A finales de 2020 se llevó a cabo una estimación en virtud de la cual el glaucoma de ángulo abierto era causa de 5.9 millones de casos de ceguera bilateral.
El GPAA se caracteriza por un deterioro del drenaje del humor acuoso en la malla trabecular (MT) que provoca un aumento de la PIO, que a su vez genera estrés mecánico en la cabeza del nervio óptico y en la capa de fibras nerviosas retinianas2. Ha quedado demostrado que la gravedad del daño que ocasiona el GPAA a la cabeza del nervio óptico está asociado a cambios de la MT2. Los factores de riesgo asociados al GPAA son la edad avanzada, el sexo masculino, los antecedentes familiares de glaucoma, la raza, la miopía, la diabetes, el síndrome de pseudoexfoliación y el espesor corneal central, entre otros6. Los principales criterios diagnósticos para el GPAA son una PIO alta (> 21 mmHg), cambios en la cabeza del nervio óptico, defectos del campo visual, el ángulo de la cámara anterior, la excavación del nervio óptico y la presencia de uno o más de los factores de riesgo antes citados7.
Son muchos los estudios que han aludido a la herencia genética del GPAA. Se han observado mutaciones en algunos genes identificados que pueden provocar GPAA por sí solos (el 5% de los casos) y que se transmiten como rasgos mendelianos8. Algunos ejemplos de estos genes son MYOC, OPTN y WDR369. Concurrentemente, también se han identificado alelos de riesgo. Estos alelos no provocan GPAA por sí solos, pero sí pueden aumentar el riesgo de desarrollarlo, precisando para ello factores medioambientales u otros alelos de riesgo8. En lo referente a estos alelos de riesgo, se han hallado polimorfismos en diferentes genes (TLR4, SOD2, SRBD1, ELOVL5, CAV1/CAV2 y TGF-β2, entre otros) que aumentan el riesgo de GPAA10-14.
La patogénesis del GPAA no termina de estar clara, aunque se ha postulado que un mal drenaje del humor acuoso a la MT podría estar detrás del aumento de la PIO y provocar glaucoma15. Un mecanismo propuesto que enturbia el drenaje a la MT es la sobreproducción de la matriz extracelular (MEC) y la inhibición de la proliferación celular en la MT que está regulada por la familia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β, transforming growth factor beta)16.
La familia del TGF-β es una superfamilia citoquínica compuesta por proteínas morfogenéticas óseas, activinas, inhibinas y factores de crecimiento y diferenciación17. Varios estudios han asociado el TGF-β1 y el TGF-β2 a la fisiopatología del glaucoma. Los valores altos de TGF-β2 se asocian a un mayor riesgo de desarrollar GPAA, mientras que los del factor TGF-β1 se han asociado a otras formas de glaucoma18. El TGF-β se produce predominantemente en los ojos a través del epitelio ciliar y el cristalino, y se secreta en el humor acuoso19.
El gen TGF-β1 se localiza en el cromosoma 19q13.2, tiene una longitud de 52,3 kb y codifica la proteína del TGF-β1 como un precursor del aminoácido 390 que, tras diversas modificaciones postranslacionales, queda reducido a 112 aminoácidos20-22. Esta proteína forma un homodímero de aproximadamente 25.000 kDa21. Se ha demostrado que existen ocho polimorfismos de nucleótido único (PNU) que influyen en la expresión del TGF-β123. No obstante, pocos de estos polimorfismos funcionales están asociados a patología oftálmica, incluido el GPAA; entre ellos se encuentran los PNU en la región promotora de -509C/T (rs1800469) y -800G/A (rs1800468), y el polimorfismo del exón 1 +915G/C (rs1800471)14,24-28.
El polimorfismo -509C/T (rs1800469) se localiza en la primera región reguladora negativa del gen del TGF-β1 en la posición del cromosoma 4536 (RefSeqGene NG_013364.1) y está asociado a una mayor expresión de la proteína del TGF-β123. Se ha propuesto que el alelo T potencia el sitio de unión del gen YY1 sobre el promotor del TGF-β1, lo cual a su vez provoca una sobreexpresión29. El polimorfismo -800G/A (rs1800468) se localiza en la región del potenciador del gen del TGF-β1 en la posición del cromosoma 4245 (RefSeqGene NG_013364.1). Se ha demostrado que el PNU reduce la afinidad de la proteína de unión al elemento de respuesta a AMP cíclico (CREB) con respecto a la región del potenciador 1, un importante factor de transcripción para la expresión del gen del TGF-β1 que provoca la infraexpresión del TGF-β123. Por último, en el PNU del exón 1 +915G/C (rs1800471), en la posición del cromosoma 5956 (RefSeqGene NG_013364.1), la transición G/C sobreviene en el nucleótido 74 y provoca la sustitución de arginina por prolina en el aminoácido que se encuentra en la posición 2523, un aminoácido localizado en la región del péptido señal de la proteína del TGF-β1 que reduce su secreción23. La portabilidad del alelo C se asocia a niveles más bajos de plasma del gen TGF-β1 que la portabilidad del alelo G30.
El objetivo de este estudio fue hallar una posible relación entre el PNU del TGF-β1 y el GPAA.
Método
Diseño
Estudio de casos y controles realizado en el Tecnológico de Monterrey, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Zapopan, Jalisco (México).
Pacientes
Los sujetos fueron reclutados del Instituto Mexicano del Seguro Social, Centro Médico Nacional de Occidente, en Jalisco (México). Los criterios de inclusión fueron una PIO > 22 mmHg en ambos ojos, la determinación de los defectos del campo visual según perimetría automatizada estándar de Humphrey 24.2, una excavación papilar glaucomatosa y una relación copa-disco > 0.70 en los dos ojos. Los criterios de exclusión fueron el cierre angular, la opacidad corneal, el trauma ocular, la iridotomía láser, la enfermedad inflamatoria del ojo, la neuropatía óptica no glaucomatosa y cualquier otra patología neurooftálmica. Los criterios de inclusión para el grupo de control fueron una PIO < 22 mmHg en ambos ojos, la ausencia de antecedentes familiares de glaucoma y unos discos ópticos normales. Se obtuvo el consentimiento informado para el cribado genético de todos los sujetos casos y controles. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto Mexicano del Seguro Social. Esta investigación ha seguido los preceptos establecidos por la Declaración de Helsinki.
Preparación de la muestra y procedimiento de genotipado
El ADN genómico se extrajo de muestras de sangre congeladas empleando el PureLink™ Genomic DNA Mini Kit. Los PNU -509C/T (rs1800469), -800G/A (rs1800468) y +915G/C (rs1800471) del TGF-β1 fueron genotipados mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real con el sistema StepOnePlus™ Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, Estados Unidos) para la realización de pruebas de genotipado de PNU mediante sondas TaqMan® y Taqman® TaqPath™ ProAmp™ Master Mix. Para el volumen final por pocillo se siguieron las recomendaciones de la guía del usuario de Thermo Fisher Scientific TaqPath ProAmp Master Mixes: 12,5 ml (Master Mix), 1,25 μl [prueba de genotipado de PNU TaqMan® PNU (20X)] y 11,25 μl (DNA genómico molde) más agua sin DNA-asa para una concentración final de ADN de 40 ng.
Análisis estadísticos
Se empleó el equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) para ver si los genotipos presentaban o no una distribución estándar. Se analizaron las relaciones alélicas, genotípicas, haplotípicas y por modelo (dominante, recesivo, codominante y sobredominante) entre los PNU y el GPAA empleando PNUStats (https://www.PNUstats.net/start.htm), que busca diferencias entre frecuencias con la prueba de χ2 y obtiene odds ratios (OR) mediante análisis de regresión logística. Las diferencias en las frecuencias alélicas y genotípicas entre casos y controles se analizaron mediante la prueba de χ2. Las OR para las diferencias alélicas se obtuvieron mediante tablas de contingencia. Para realizar todos estos análisis se empleó el software The GraphPad Prism versión 8.4.3. La significación estadística se definió como un valor p < 0.05.
Resultados
El estudio incluyó 237 sujetos no mexicanos, 135 de los cuales (63 hombres y 72 mujeres; edad: 66.37 ± 10.13 años) fueron diagnosticados de GPAA. El grupo de control incluyó 102 sujetos (42 hombres y 60 mujeres; edad: 67.38 ± 5.84 años). No se observaron diferencias estadísticamente significativas en cuanto al sexo ni la edad entre los dos grupos (p > 0.05).
Los tres polimorfismos fueron genotipados en todos los sujetos. El EHW se analizó en todos los polimorfismos y en todos los grupos; los TGF-β1 -800G/A (rs1800468) y -509C/T (rs1800469) mantuvieron el EHW en el grupo de control, pero no así en el grupo GPAA; el TGF-β1 +915 G/C (rs1800471) mantuvo el EHW en los dos grupos.
Como se aprecia en la tabla 1, la frecuencia del alelo menor del TGF-β1 -800G/A (rs1800468) fue mucho mayor en el grupo GPAA que en el grupo de control, confiriendo, por tanto, un mayor riesgo de GPAA. Los demás alelos menores no se asociaron a un riesgo de falta de protección.
Tabla 1 Frecuencias del alelo menor en el grupo con glaucoma primario de ángulo abierto y en el grupo de control
| PNU | GPAA n (%) | Control n (%) | OR (IC) | p |
|---|---|---|---|---|
| -800G/A (rs1800468) | 29 (11) | 7 (3) | 3.38 (1.46-8.23) | 0.0051* |
| -509C/T (rs1800469) | 122 (45) | 92 (45) | 1.00 (0.69-1.44) | 0.98 |
| +915G/C (rs1800471) | 255 (94) | 196 (96) | 1.44 (0.61-3.29) | 0.41 |
GPAA: glaucoma primario de ángulo abierto; IC: intervalo de confianza; OR: odds ratio; PNU: polimorfismo de nucleótido único.
*Valor significativo.
Se observa la proporción de alelo menor, así como una estimación de la relación que existe entre el alelo menor y el GPAA.
Las frecuencias de genotipado se muestran en la tabla 2. No se observaron diferencias significativas entre los genotipos del PNU -509C/T (rs1800469) del TGF-β1. En lo que respecta a otros PNU, el análisis de la prueba de χ2 no fue posible por la condición de que, como mínimo, el 20% de los valores que cabía esperar debían ser > 5 (lo cual no se logró con las frecuencias de genotipado obtenidas).
Tabla 2 Frecuencias del genotipo
| PNU | Genotipo | GPAA n (%) | Control n (%) | p |
|---|---|---|---|---|
| -800G/A (rs1800468) | A/A | 5 (4) | 1 (1) | NA |
| G/A | 19 (14) | 5 (5) | ||
| G/G | 111 (82) | 96 (94) | ||
| -509C/T (rs1800469) | C/C | 53 (39) | 33 (32) | 0.08 |
| C/T | 42 (31) | 46 (45) | ||
| T/T | 40 (30) | 23 (23) | ||
| +915G/C (rs1800471) | C/C | 121 (90) | 94 (92) | NA |
| C/G | 13 (10) | 8 (8) | ||
| G/G | 1 (1) | 0 (0) |
GPAA: glaucoma primario de ángulo abierto; NA: no aplicable; PNU: polimorfismo de nucleótido único. Diferencias del genotipado entre el GPAA y el grupo de control.
El análisis basado en modelos se muestra en la tabla 3. El PNU -800G/A (rs1800468) del TGF-β1 aumentó el riesgo de desarrollar GPAA con el genotipo GA en el modelo codominante, con los genotipos GA y AA en el modelo dominante y, por último, con el genotipo GA en el modelo sobredominante. Concurrentemente, el PNU -509C/T (rs1800469) del TGF-β1 mostró un efecto protector con el genotipo CT en el modelo sobredominante. El análisis basado en modelos para el TGF-β1 +915G/C (rs1800471) no fue estadísticamente significativo.
Tabla 3 Análisis basado en modelos
| PNU | Modelo | Genotipo | GPAA n (%) | Control n (%) | OR (IC) | p |
|---|---|---|---|---|---|---|
| -800G/A (rs1800468) | Codominante | G/G | 111 (82.2) | 96 (94.1) | 3.29 (1.18-9.14) | 0.018* |
| G/A | 19 (14.1) | 5 (4.9) | ||||
| A/A | 5 (3.7) | 1 (1) | ||||
| Dominante | G/G | 111 (82.2) | 96 (94.1) | 3.46 (1.36-8.82) | 0.0046* | |
| G/A-A/A | 24 (17.8) | 6 (5.9) | ||||
| Sobredominante | G/G-A/A | 116 (85.9) | 97 (95.1) | 3.18 (1.14-8.82) | 0.016* | |
| G/A | 19 (14.1) | 5 (4.9) | ||||
| -509C/T (rs1800469) | Codominante | C/C | 53 (39.3) | 33 (32.4) | 0.57 (0.31-1.04) | 0.086 |
| C/T | 42 (31.1) | 46 (45.1) | ||||
| T/T | 40 (29.6) | 23 (22.6) | ||||
| Dominante | C/C | 53 (39.3) | 33 (32.4) | 0.74 (0.43-1.27) | 0.27 | |
| C/T-T/T | 82 (60.7) | 69 (67.7) | ||||
| Sobredominante | C/C-T/T | 93 (68.9) | 56 (54.9) | 0.55 (0.32-0.94) | 0.028* | |
| C/T | 42 (31.1) | 46 (45.1) | ||||
| +915G/C (rs1800471) | Codominante | C/C | 121 (89.6) | 94 (92.2) | 1.26 (0.50-3.17) | 0.5 |
| G/C | 13 (9.6) | 8 (7.8) | ||||
| G/G | 1 (0.7) | 0 (0) | ||||
| Dominante | C/C | 121 (89.6) | 94 (92.2) | 1.36 (0.55-3.17) | 0.5 | |
| G/C-G/G | 14 (10.4) | 8 (7.8) | ||||
| Sobredominante | C/C-G/G | 122 (90.4) | 94 (92.2) | 1.25 (0.50-3.14) | 0.63 | |
| G/C | 13 (9.6) | 8 (7.8) |
GPAA: glaucoma primario de ángulo abierto; IC: intervalo de confianza; OR: odds ratio; PNU: polimorfismo de nucleótido único.
*Valor significativo.
Modelo basado en el análisis del PNU del TGF-β1.
El análisis de los haplotipos se muestra en la tabla 4 y vino a confirmar que la portabilidad de los alelos C del PNU -509C/T (rs1800469), A del -800G/A (rs1800468) y C del +915G/C (rs1800471) confirieron un mayor riesgo de GPAA. Los demás análisis de haplotipos no fueron estadísticamente significativos.
Tabla 4 Análisis del haplotipo
| -509C/T (rs1800469) | -800G/A (rs1800468) | +915G/C (rs1800471) | Frecuencia | OR (IC) | p | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Alelos | C | G | C | 0.439 | 1.00 | - |
| T | G | C | 0.435 | 1.11 (0.78-1.57) | 0.57 | |
| C | A | C | 0.070 | 2.74 (1.20-6.25) | 0.018* | |
| C | G | G | 0.037 | 1.11 (0.37-3.32) | 0.85 |
IC: intervalo de confianza; OR: odds ratio.
*Valor significativo.
Discusión
Como ya se ha mencionado, el glaucoma es la principal causa de ceguera irreversible en todo el mundo2 y el GPAA es el tipo más común de glaucoma3. Aunque su fisiopatología todavía no se conoce del todo, uno de los mecanismos propuestos es el endurecimiento de la MT debido a la sobreproducción de TGF-β, sobre todo TGF-β2, que reduce el drenaje de humor acuoso y provoca un aumento de la PIO, con el progresivo e irreversible daño al nervio óptico16.
La vía de señalización del TGF-β es compleja e implica una serie de serina/treonina proteína cinasas que fosforilan en diferentes pasos para regular la expresión de los genes. Existen muchos miembros de la familia del TGF-β y hay tres isoformas del TGF-β: 1, 2 y 3. El primer paso de la vía consiste en la fijación del TGF-β a su complejo receptor, que está formado por dos componentes del receptor de tipo I (TGF-βRI) y por dos componentes del receptor de tipo II (TGF-βRII)31,32. Hay diferentes tipos de receptores TGF-βRI y TGF-βRII con afinidades distintas con respecto a los diversos miembros de las proteínas de la familia del TGF-β (por ejemplo, el TGF-β2 tiene una baja afinidad por el TGF-βRII)33. Ambos son receptores de serina/treonina proteína cinasas. Este último transfosforila a la primera que, a su vez, propaga la señal fosforilando las proteínas SMAD mediante una vía convencional32,33. El siguiente proceso consiste en la fosforilación dependiente del receptor de TGF-β de proteínas Smad3 y Smad2, las cuales forman, a su vez, un complejo en el dominio citoplasmático del receptor; las proteínas Smad4 se fijan al complejo activado Smad2/3, permitiéndole translocarse al núcleo e iniciar la transcripción de los genes diana del TGF-β34. También se debe mencionar que existe una vía no convencional de fosforilación de MAP cinasas a través del receptor TGF-βR1, y que ambas vías contribuyen a los cambios que experimenta la MT en el GPAA35.
Se ha demostrado, in vitro, que la MT secreta tanto TGF-β1 como TGF-β2, aunque solo el primero se ha hallado in situ. Esta expresión es mínima en ojos normales, pero mayor en pacientes con GPAA36. En cualquier caso, las principales fuentes de TGF-β2 son probablemente el cuerpo ciliar y el cristalino, que aumentan notablemente los niveles de humor acuoso del TGF-β2, un hallazgo característico del GPAA36-38. Se ha documentado que este aumento de los niveles de humor acuoso del TGF-β2 induce la degradación de la MEC de la MT. Los principales genes de la MEC que están sobreexpresados son los del colágeno I, III, IV y VI, la laminina, la elastina, la fibronectina, la trombospondina 1, la miocilina, la cochlina, la fibulina y el versicán, todos ellos presentes en la MT normal36. No obstante, el TGF-β no solo induce la expresión de las proteínas de la MEC; tanto la transglutaminasa como el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 son buenos ejemplos de ello. La primera es una enzima que se entrecruza-enlaza irreversiblemente con la fibronectina de la MT; el segundo inhibe la activación de metaloproteinasas de la matriz. Ambos contribuyen al endurecimiento de la MT que sobreviene en el GPAA36,39,40. Concurrentemente, el TGF-β2 induce la diferenciación de células de la MT fibroblásticas en un fenotipo miofibroblástico que tiene una potente actividad contráctil y contribuye, más si cabe, al endurecimiento de la MT35,36.
Aunque la participación del TGF-β en la fisiopatología del GPAA se ha estudiado extensamente, no ha sido hasta hace poco que se ha incluido el TGF-β2. En cualquier caso, parece que el TGF-β1 desempeña un papel en el desarrollo del GPAA. Nuestros hallazgos sugieren que existe una relación entre los polimorfismos en la región promotora de TGF-β1, -800G/A (rs1800468) y -509C/T (rs1800469) y el GPAA. El primero aumenta enormemente el riesgo de GPAA con los genotipos portadores del alelo menor (GA y AA) (OR: 3.46; intervalo de confianza [IC]: 1.36-8.82; p = 0.0046), mientras que el último confiere protección. El genotipo portador del alelo menor (CT) en el PNU-509C/T (rs1800469) tuvo una OR estimada de 0.55 (IC= 0.32-0.94; p = 0.028). Estos hallazgos podrían ser relevantes porque sugieren que el TGF-β1 estaría implicado en el microambiente de la MT, porque mientras el PNU -800G/A (rs1800468) del TGF-β1 reduce la expresión del TGF-β1, el -509C/T (rs1800469) la aumenta.
A primera vista, estos resultados parecen controvertidos, aunque un análisis puntual de anteriores estudios podría explicar nuestros resultados. Se ha documentado que los pacientes con GPAA presentan concentraciones séricas más altas de TGF-β1. No obstante, el humor acuoso de los pacientes con glaucoma se caracteriza, como ya hemos mencionado, por un importante aumento del TGF-β2 y una expresión limitada del TGF-β141-46. De hecho, los pacientes con GPAA tienen concentraciones proteínicas muy bajas y, a la vez, muy altas de TGF-β1 y TGF-β2 (< 0.1 pg/ml frente a 1.48 ± 0.68 ng/ml) en el humor acuoso42,46.
Por otro lado, al contrario de lo que reflejan nuestros resultados, en un estudio realizado en pacientes del noreste de Irán, el PNU -509C/T (rs1800469) se asoció a riesgo de desarrollar GPAA; no obstante, las OR eran bajas (< 2 en la mayoría de los casos)14. Otro estudio realizado en pacientes de India no halló ninguna relación entre este PNU y el GPAA26. Estos resultados podrían parecer controvertidos y explicarse por las diferencias genéticas entre poblaciones; deben realizarse más estudios que ayuden a aclarar esta posible relación.
Además, apoyar la idea de que concentraciones muy bajas de TGF-β1 son relevantes en la fisiopatología del glaucoma es nuestro hallazgo en el análisis haplotípico. El haplotipo compuesto por el alelo C del PNU -509C/T (rs1800469), el alelo A del PNU -800G/A (rs1800468) y el alelo C del PNU +915G/C (rs1800471) confirió un mayor riesgo de GPAA con una significativa OR: 2,74 (IC: 1.20-6.25; p = 0.018). De acuerdo con este resultado, parece importante recordar que el alelo C (alelo salvaje) del PNU -509C/T (rs1800469) no influye en la expresión del TGF-β1, el alelo A del PNU -800G/A (rs1800468) reduce la expresión del TGF-β1 y el alelo C del PNU +915G/C (rs1800471) reduce la secreción del TGF-β1. Esto podría significar que la combinación de menor expresión y menor secreción sin un efecto de sobreexpresión de contrapeso del PNU -509C/T (rs1800469) aumenta el riesgo de GPAA.
Concurrentemente, no se halló una relación entre el PNU del exón 1 +915G/C (rs1800471) y el GPAA, lo cual coincide con un estudio que analizó esta relación en una población diferente de pacientes24. No obstante, como ya se ha mencionado, la portabilidad del alelo C (que provoca una menor secreción del TGF-β1) se asoció a riesgos en el análisis haplotípico.
Esto, sumado a nuestros hallazgos, sugiere que es posible que diferentes concentraciones de TGF-β1 y TGF-β2 tengan efectos distintos en el microambiente de la MT. No obstante, hay que realizar más estudios que avalen esta hipótesis.
Las limitaciones de nuestro estudio son que, aunque se hallaron asociaciones significativas en las OR calculadas, estas se acompañaron de amplios IC, lo cual sugiere que la muestra fue pequeña. Para calcular con mayor precisión estas asociaciones, la muestra debe ser mayor. Nuestros resultados, además, deben ser confirmados en diferentes poblaciones de pacientes.
Conclusiones
El hallazgo de que los polimorfismos funcionales del gen TGF-β1 que modifican la expresión de la proteína TGF-β1 se asocian al GPAA pone de manifiesto la relación que existe entre esta citocina y el proceso fibrótico que sobreviene en la MT en esta patología. Se deben realizar estudios genéticos sobre los PNU aquí analizados en diferentes poblaciones y con muestras más grandes. También hay que realizar estudios que analicen el papel que desempeñan los distintos tipos de TGF-β en el microambiente de la MT para aclarar el grado de implicación de este factor en el GPAA.
