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Introducción
Los telómeros son secuencias repetidas de nucleótidos que cubren los extremos de los cromosomas. Con cada división celular, los telómeros se acortan hasta una longitud crítica cuando la célula ya no puede replicarse, provocando senescencia o muerte. Este mecanismo conduce a una disminución de la función celular. Se ha sugerido que los telómeros cortos podrían ser marcadores de baja resistencia al estrés1. En consecuencia, la longitud de los telómeros se ha propuesto como un indicador del envejecimiento celular y de la longevidad, y se ha asociado con muchas enfermedades relacionadas con la edad avanzada y la esperanza de vid2,3.
Para mantener la longitud de los telómeros, la enzima telomerasa se encarga de sintetizar las repeticiones de GGTTAG en los extremos de los cromosomas. La telomerasa humana se compone principalmente de transcriptasa inversa de telomerasa (TERT), ácido ribonucleico de telomerasa (TERC) y disquerina (DKC1). Las variantes genéticas comunes, TERT 1327C>T rs27350940 y TERC 63G>A rs2293607, se han relacionado con una actividad reducida de la telomerasa que causa un acortamiento prematuro de los telómeros4,5. Estos genes se expresan en tejidos embrionarios o células mononucleares periféricas, pero no se han identificado en el cristalino humano.
Además, la longitud de los telómeros se ha asociado con factores de riesgo cardiovascular, como diabetes, hipertensión arterial y tabaquismo6. De hecho, los pacientes con diabetes tienen telómeros más cortos que los individuos sanos7, y los individuos con longitudes teloméricas cortas muestran más complicaciones por diabetes8. Además, varios estudios han detectado un acortamiento más rápido de los telómeros en fumadores, probablemente debido al daño oxidativo causado por el tabaco9. En el Framingham Heart Study se encontró que los hombres hipertensos tenían longitudes de telómeros de leucocitos ajustadas por la edad significativamente más cortas en comparación con sus pares normotensos10. Sin embargo, esta asociación no pudo confirmarse en una cohorte mixta de hombres y mujeres examinada en el estudio de salud cardiovascular11. Por lo tanto, podría haber un efecto relacionado con el sexo sobre la longitud de los telómeros de los leucocitos en humanos por el que la longitud de los telómeros sea más corta en los hombres adultos que en las mujeres12.
La hipótesis de que la transparencia del cristalino podría estar relacionada con la longitud de los telómeros de los leucocitos como marcador del envejecimiento está respaldada por observaciones en trastornos del envejecimiento prematuro, como el síndrome de Werner. En los pacientes con este síndrome, las características relacionadas con el envejecimiento normal, como el cáncer y las cataratas bilaterales, aparecen tempranamente, y los pacientes muestran un acortamiento acelerado de los telómeros13-15.
El presente estudio fue diseñado para examinar la longitud de los telómeros leucocitarios en adultos jóvenes con cataratas y evaluar la supuesta asociación entre los polimorfismos de los genes TERT y TERC y las cataratas prematuras. También se determinó si las longitudes de los telómeros diferían entre sujetos con y sin factores de riesgo cardiovascular para eliminar los factores de confusión (tabaquismo, diabetes e hipertensión) que posiblemente causan acortamiento de los telómeros.
Método
Sujetos
Se recolectaron muestras de sangre de 205 sujetos después de obtener su consentimiento informado. El protocolo del estudio recibió la aprobación del Comité de Revisión Institucional y se adhirió a los principios de la Declaración de Helsinki. Los sujetos se dividieron en cuatro grupos: 46 con catarata ≤ 55 años emparejados con 47 sin catarata de edad similar, y 56 con catarata ≥ 60 años emparejados con 56 sin catarata de edad similar. Las características clínicas y demográficas se resumen en la tabla 1. Las edades medias de los sujetos en los cuatro grupos fueron: 48.5 ± 7.47 años (catarata ≤ 55), 43.8 ± 7.63 (sin catarata ≤ 55 años), 72.5 ± 7.6 años (catarata ≥ 60 años) y 66.5 ± 4.3 años (sin catarata ≥ 60 años).
Tabla 1 Características clínicas y demográficas de los sujetos incluidos en el studio
| Casos ≤ 55 años, n (%) | Controles ≤ 55 años, n (%) | Casos ≥ 60 años, n (%) | Controles ≥60 años, n (%) | |
|---|---|---|---|---|
| Tamaño de la muestra | 46 | 47 | 56 | 56 |
| Sexo | ||||
| Hombres | 28 (60.9%) | 21 (44.7%) | 25 (44.6%) | 18 (32.1%) |
| Mujeres | 18 (39.1%) | 26 (55.3%) | 31 (55.4%) | 38 (67.9%) |
| Hipertensión | 9 (19.6%) | 4 (8.5%) | 32 (57.1%) | 30 (53.6%) |
| Diabetes | 10 (21.7%) | 7 (14.9%) | 10 (17.9%) | 13 (23.2%) |
| Tabaquismo | 11 (23.9%) | 11 (23.4%) | 9 (16.1%) | 10 (17.9%) |
Todos los participantes se sometieron a un examen oftalmológico estándar, que incluyó medición de la agudeza visual mejor corregida (AVMC), refracción, medición de la presión intraocular y biometría por ultrasonido. El examen también incluyó la observación del segmento anterior dilatado utilizando una lámpara de hendidura para verificar la presencia o ausencia de catarata (nuclear, cortical, subcapsular posterior) y revisar el fondo de ojo. La transparencia del cristalino se clasificó de acuerdo con el Sistema de Clasificación de Opacidades del Cristalino (LOCS) III validado.
Los criterios de inclusión de los pacientes fueron: AVMC < 0.5 Snellen de escala decimal, una vez descartada cualquier otra patología oftalmológica que pudiera justificar la pérdida de agudeza visual, y la presencia de catarata en el examen oftalmológico. Y para los controles fueron: AVMC de 1 en ausencia de catarata según el LOCS III. Todos los sujetos, casos y controles, cumplieron los mismos criterios en términos de lugar de residencia o trabajo al aire libre o en el interior (para controlar los riesgos ambientales, como la exposición al sol).
Los criterios de exclusión fueron tener tratamiento presente o pasado relacionado con el desarrollo de cataratas (corticosteroides, cirugía vitreorretiniana, quimioterapia, radiación), abuso de alcohol o cualquier enfermedad ocular (trauma, uveítis, glaucoma) o sistémica asociada con cataratas (enfermedad de Steinert, trastornos metabólicos, síndrome de Marfan y otras enfermedades del músculo esquelético).
Extracción de ADN
Se extrajo ADN genómico de células sanguíneas periféricas nucleadas siguiendo el método de fenol-cloroformo, como se informó anteriormente16.
Análisis de la longitud telomérica
La longitud de los telómeros se midió mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa relativa y comparativa. Se comparó el número medio de copias de la secuencia de repetición de los telómeros con el gen de copia única de referencia 36B4. Para cada muestra de ADN se realizaron seis experimentos diferentes: tres para secuencia de repetición de telómeros y tres para gen de copia única. El método fue descrito por Gil y Coetzer en 200417 utilizando los mismos cebadores desarrollados por Cawthon en 2002 para la longitud de los telómeros18 y el gen 36B4 como control endógeno19. Los cebadores específicos de telómeros fueron directo (forward, hacia adelante), 5’-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGA GGG TGAGGGT-3’, e inverso (reverse, hacia atrás), 5’-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCC TATCCCTA-3’. Los cebadores específicos de 36b4 fueron directo, 5’-CAGCAAGTGGGAAGG TGTAATCC-3’, e inverso, 5’-CCC ATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’20. El gen de control 36B4 se amplificó en las mismas condiciones de PCR que el gen telomérico, reduciendo así el riesgo de variación entre placas.
Se agregó lo siguiente a cada pocillo: 5 ng/μl de ADN, 5 ml de SYBR Green PCR Master Mix (Kapa Biosystems) y 4 ml de agua. También se añadieron 1 μl de cebador directo (5 μM) y 2.33 μl de cebador inverso (5 μM) para la reacción de amplificación de telómeros, y 0.4 μl (5 μM) de cada cebador para la amplificación del gen 36B4. El perfil de ciclos térmicos fue de la siguiente manera: 10 minutos a 95 °C seguido de 35 ciclos de 95 °C durante 15 segundos, 54 °C durante 2 minutos y 72 °C durante 15 segundos21. La amplificación de qPCR se realizó utilizando el sistema de PCR en tiempo real Step-One Plus (Applied Biosystems). Para determinar la longitud relativa de los telómeros se utilizó la versión 1.2 del software RQ Manager.
El valor de Ct, definido como el número de ciclos de PCR necesarios para que el ADN amplificado cruce un umbral predefinido, se utilizó para calcular el número de copias repetidas de telómeros con respecto a la proporción del número de copias del gen de una sola copia (T/S) utilizando T/S = 22 DCt. La longitud relativa de los telómeros se determinó normalizando la relación (T/S) de cada muestra al ADN calibrador para estandarizar los valores de las muestras en todas las placas de reacción. Para facilitar el manejo de los datos se utilizó el logaritmo natural de este valor22.
Análisis de polimorfismos de la telomerasa
Los polimorfismos del ADN del gen de la telomerasa se midieron mediante un procedimiento de discriminación alélica por PCR en tiempo real realizado en un volumen total de 12 μl por reacción. Se colocó ADN (2.5 μl) en una mezcla de reacción de 9.5 μl que contenía 0.25 μl de cebadores oligonucleotídicos y sondas Taqman (VIC/FAM), 5 μl de TaqMan® Universal PCR Master Mix No AmpErase® UNG (Applied Biosystems) y agua bidestilada hasta un volumen final de 12 μl. Siguiendo las instrucciones del fabricante para el sistema de PCR en tiempo real Step-One Plus (Applied Biosystems), el protocolo de ciclos consistió en un paso de desnaturalización inicial de 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 segundos, alineamiento a 65 °C durante 60 segundos y una etapa de extensión a 60 °C durante 30 segundos.
Las secuencias de las sondas VIC y FAM utilizadas para la detección de polimorfismos se detallan en la tabla 2.
Tabla 2 Secuencias de las sondas VIC y FAM (5’-3’) utilizadas para la detección de los polimorfismos TERT-1327C>T y TERC-63G>A mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
| Polimorfismos | Sonda Taqman (Applied Biosystems) | Secuencia 5’-3’ (VIC/FAM) |
|---|---|---|
| TERT-1327C >T (rs2735340) | C_1839086_10 | TCGTCTTGTAAATACTTAGGATTAC(A/G)GGTCGCTCTTCTAGAAATCCCCTTA |
| TERC-63G>A (rs2293607) | C_16184740_10 | AGGTTTGGGGGTTCACAAGCCCCCA(C/T)TGCCGGCGAGGGGTGACGGATGCGC |
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el software SPSS Statistics para Windows, versión 2.0, y el programa GenEx 5.3.6 desarrollado para calcular la longitud de los telómeros. Para confirmar los resultados del software GenEx se aplicó la prueba U de Mann Whitney.
Las asociaciones entre la longitud de los telómeros de los leucocitos y los polimorfismos (SNP) de TERT/TERC se modelaron utilizando la prueba de ji al cuadrado.
Debido a que algunos datos siguieron una distribución normal y otros (edad) mostraron una distribución no paramétrica, se utilizó el análisis de la varianza (ANOVA) o la prueba U de Mann Whitney para explorar la influencia de posibles variables de confusión (diabetes, tabaquismo, hipertensión y edad) sobre la longitud de los telómeros en los pacientes con catarata. También se realizó un análisis de varianza multivariado (MANOVA) para comparar estas variables dependientes juntas (diabetes, tabaquismo, hipertensión y edad) en los mismos grupos.
Resultados
Se encontraron diferencias significativas en la longitud relativa de los telómeros entre los sujetos con cataratas y los que no tenían cataratas independientemente de la edad (p < 0.01). Como era de esperar de acuerdo con el impacto de la edad en la longitud de los telómeros, los sujetos sin catarata ≥ 60 años tenían telómeros más cortos que los sujetos ≤ 60 años (p < 0.01). Sin embargo, se observaron diferencias significativas (p < 0.01) en la longitud de los telómeros en sujetos con catarata no relacionada con la edad. Curiosamente, los sujetos más jóvenes con cataratas tenían telómeros más cortos que las personas mayores con catarata (Tabla 3).
Tabla 3 Comparación de las longitudes de los telómeros de leucocitos entre los grupos de estudio
| Longitud del telómero | p | |
|---|---|---|
| Casos vs.controles | 2.88 ± 1.43 5.17 ± 1.58 |
< 0.01 |
| Casos ≤ 55 años vs.controles ≤ 55 años | 2.36 ± 1.56 5.85 ± 1.58 |
< 0.01 |
| Casos ≥ 60 años vs. controles ≥ 60 años | 3.30 ± 1.17 4.69 ± 1.30 |
< 0.01 |
| Casos ≤ 55 años vs. casos ≥ 60 años | 2.36 ± 1.56 3.30 ± 1.17 |
< 0.01 |
| Controles ≤ 55 años vs. controles ≥ 60 años | 5.85 ± 1.58 4.69 ± 1.30 |
< 0.01 |
La hipótesis de que las variaciones individuales en los genes TERT y TERC de la telomerasa podrían estar asociadas con una menor actividad de la telomerasa, y por lo tanto con una menor longitud de los telómeros leucocitarios, no se confirmó en ningún grupo de los sujetos incluidos en el estudio (Tabla 4).
Tabla 4 Frecuencias de los genotipos de SNP de TERT y TERC en casos y controles
| SNP | Genotipo | Casos n (%) | Controles n (%) | p |
|---|---|---|---|---|
| TERT rs2735940 | TT | 31 (3.4%) | 26 (25.2%) | 0.7 |
| TC | 54(52.9%) | 58 (56.3%) | 0.44 | |
| CC | 17 (16.7%) | 19 (18.4%) | 0.44 | |
| TT | 31 (3.4%) | 26 (25.2%) | ||
| TC + CC | 71 (69.9%) | 77 (74.8%) | ||
| TT + TC | 85 (83.3%) | 84 (81.55%) | ||
| CC | 17 (16.7%) | 19 (18.4%) | ||
| TERC rs2293607 | AA | 60 (58.8%) | 69 (67.7%) | 0.38 |
| AG | 38 (37.3%) | 29 (28.2%) | 0.25 | |
| GG | 4 (3.9%) | 5 (4.9%) | 1 | |
| AA | 60 (58.8%) | 69 (67%) | ||
| AG + GG | 42 (41.2%) | 34 (33%) | ||
| AG + AA | 98 (96.1%) | 98 (95.1%) | ||
| GG | 4 (3.9%) | 5 (4.9%) |
A: adenina; C: citosina; G: guanina; SNP: polimorfismo de un solo nucleótido; T: timina; TERC: componente de ARN de telomerasa; TERT: transcriptasa inversa de telomerasa.
El análisis revela que la relación entre la longitud de los telómeros y las cataratas no se vio afectada por factores de riesgo cardiovascular, como la diabetes, el tabaquismo y la hipertensión, en todos los grupos.
En los pacientes con cataratas, el MANOVA no indicó diferencias significativas (p > 0.05) en la longitud de los telómeros leucocitarios en relación con los factores hipertensión, diabetes, tabaquismo y edad. El valor de p obtenido en la prueba ANOVA para cada uno de estos factores de riesgo cardiovascular fue > 0.05.
Sin embargo, como la edad no sigue una distribución paramétrica, se utilizó la prueba U de Mann Whitney y entonces se observó un efecto significativo de la edad sobre la longitud de los telómeros de los leucocitos (p < 0.05).
Discusión
El desarrollo de cataratas se caracteriza por la senescencia de las células del cristalino. Este envejecimiento es acelerado por el estrés oxidativo y la radiación no ionizante en forma de luz ultravioleta, que induce daño al ADN producido por los radicales libres derivados del oxígeno. Debido a la ausencia de actividad de la telomerasa en el cristalino, el ataque oxidativo de los hidroperóxidos de fosfolípidos presentes en el humor acuoso y el daño a las estructuras de la membrana de las células del cristalino probablemente produzcan un acortamiento de los telómeros1,6,23-25. Por lo tanto, el aumento del estrés oxidativo y la falta de desintoxicación reductora de los hidroperóxidos de fosfolípidos son los mecanismos desencadenantes del acortamiento de los telómeros y del desarrollo de cataratas.
En este estudio, una mayor transparencia del cristalino se relacionó con una mayor longitud de los telómeros leucocitarios, como ya han informado otros autores6,13,23.
Hasta donde sabemos, el presente estudio es el primero en examinar la longitud de los telómeros de los leucocitos en pacientes jóvenes con catarata, y en informar longitudes relativamente cortas para el rango de edad. Se observó que las personas más jóvenes con catarata tenían telómeros más cortos que los controles de la misma edad sin cataratas. Además, este grupo de pacientes también mostró una longitud telomérica más corta que los sujetos mayores con cataratas.
Especulamos que este hallazgo podría reflejar un envejecimiento prematuro en esta población. En consecuencia, la aparición de cataratas en adultos jóvenes puede servir como un marcador in vivo del envejecimiento natural, y también podría advertir sobre otras afecciones asociadas con el acortamiento y el envejecimiento de los telómeros, como glaucoma, degeneración macular relacionada con la edad24, enfermedad cardiovascular o cáncer. Por tanto, los telómeros podrían considerarse nuevos biomarcadores del envejecimiento y también predictores del riesgo de determinadas enfermedades degenerativas relacionadas con la edad. Por consiguiente, la longitud de los telómeros podría ayudar a monitorear la eficacia de la prevención o de las estrategias destinadas a modificar el proceso del envejecimiento.
El cristalino tiene varias ventajas reales como marcador del envejecimiento. Por ejemplo, utilizando técnicas de imagen rápidas, no invasivas y no peligrosas, se puede medir su transparencia en una escala continua. Además, el uso de un sistema de clasificación como LOCS III ofrece una forma reproducible y precisa de determinar la transparencia del cristalino.
Nuestros resultados también revelaron que los polimorfismos de los genes TERT y TERC, rs2735940 y rs2293607, no se asociaron con un acortamiento de los telómeros en ningún grupo, incluido el de personas más jóvenes con cataratas. Esto significa que el acortamiento de los telómeros observado en los jóvenes con catarata no se asoció con estos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP).
Existen varios informes7-11 sobre la relación entre la longitud corta de los telómeros y los factores de riesgo cardiovascular, como la hipertensión, la diabetes y el tabaquismo. Analizamos la relación entre posibles factores de confusión (diabetes, hipertensión y tabaquismo) y la longitud de los telómeros leucocitarios. Los participantes de nuestro estudio fueron estratificados por edad, sexo y enfermedad cardiovascular, como se muestra en la tabla 1. En los pacientes con catarata, el análisis multivariado no mostró ninguna relación entre la longitud de los telómeros, la edad y los factores de riesgo cardiovascular. Esto indica que el acortamiento de los telómeros en los pacientes jóvenes con catarata no estuvo influenciado por factores de riesgo cardiovascular ni por polimorfismos de la telomerasa, por lo que este acortamiento podría estar directamente asociado a la catarata. Se necesitan estudios longitudinales para confirmar nuestra hipótesis y fortalecer la idea de que la catarata temprana podría indicar un envejecimiento prematuro y la posible presencia de enfermedades relacionadas con la edad.
Se deben considerar varias limitaciones en la interpretación de nuestros resultados. La longitud de los telómeros en los leucocitos periféricos podría no reflejar alteraciones en la longitud de los telómeros en las células del cristalino, aunque varios estudios han demostrado su buena correlación12,13,25. Además, como queríamos examinar una cohorte de sujetos representativa de la población general, no se excluyó a las mujeres. Sin embargo, es bien sabido que las mujeres adultas tienen una longitud de los telómeros leucocitarios más larga que los hombres26, aunque la longitud de los telómeros al nacer es equivalente en niños y niñas12,27. Otra limitación es que el tabaquismo acelera el acortamiento de los telómeros y esto se ha relacionado con múltiples resultados negativos para la salud durante la vida de una persona28. Algunos estudios han encontrado una relación dosis-respuesta entre la exposición acumulada de por vida al tabaquismo y la longitud de los telómeros en adultos29. No obstante, para evitar estos factores de confusión, equilibramos a los fumadores en todos los grupos incluidos en nuestro estudio.
Finalmente, se deben considerar otros factores, como el complejo shelterina30,31. Los telómeros consisten en repeticiones en tándem de una secuencia de ADN conectada a seis componentes proteicos conocidos como shelterina30, siendo el factor 1 de unión a las repeticiones teloméricas (TRF1) y la proteína homóloga de la displasia adrenocortical (TPP1) las proteínas más relevantes en los mamíferos. Las proteínas shelterina están especializadas en proteger a los telómeros de los mecanismos de reparación del ADN, así como en regular la actividad de la telomerasa. Por consiguiente, la supresión de TRF1 y TPP1 da como resultado el desarrollo de enfermedades degenerativas y relacionadas con la edad, tales como disqueratosis congénita, anemia aplásica y fibrosis pulmonar idiopática en ratones jóvenes. Estas enfermedades están asociadas con telómeros cortos o disfuncionales y con una falla característica en la capacidad regenerativa de los tejidos31. En consecuencia, existen otros complejos, como la shelterina, además de los polimorfismos de la telomerasa, que actúan sobre esta enzima condicionando la longitud del telómero, y que por lo tanto podrían participar en la aparición de enfermedades relacionadas con la edad, como las cataratas.
Si bien es difícil reclutar pacientes jóvenes con catarata, la relación observada aquí entre una longitud telomérica corta y una catarata prematura requiere confirmación en series más amplias de pacientes.
En conclusión, informamos por primera vez que las personas jóvenes con cataratas tienen una longitud telomérica de los leucocitos más corta que las personas sin cataratas, y que esta relación no se ve afectada por factores de riesgo cardiovascular ni por polimorfismos de la telomerasa. Si esta relación se confirma en series más amplias de pacientes, planteamos la hipótesis de que el desarrollo temprano de cataratas y la longitud corta de los telómeros podrían ser un marcador de envejecimiento prematuro.
