Introducción

El pterigión es un crecimiento celular anormal en la conjuntiva que posee características tumorales, entre las que se destacan crecimiento descontrolado, invasión y migración. Su aparición se asocia a la exposición solar prolongada. Tiene una incidencia de hasta el 10% en poblaciones cercanas al ecuador. Es de naturaleza benigna; sin embargo, su crecimiento y migración hacia la región central del ojo puede llegar a interferir con el campo visual, además de causar irritación, inflamación e inducir astigmatismo¹.

Aunque no se conocen con precisión los mecanismos que subyacen la patogénesis del pterigión, su desarrollo se asocia a la exposición a los rayos ultravioleta (UV) por la luz solar. Una variedad de factores se ha relacionado con la patogénesis del pterigión, incluyendo factores epigenéticos, mediadores de inflamación, factores de crecimiento, moduladores de la matriz extracelular, factores angiogénicos y linfangiogénicos, mecanismos inmunológicos y alteraciones en el metabolismo del colesterol².

El único tratamiento disponible para la remoción del pterigión es la cirugía, con la desventaja de la recurrencia. Las técnicas quirúrgicas más sofisticadas utilizan autoinjertos conjuntivales o de membrana amniótica para recubrir el área conjuntival de donde se ha removido el pterigión, en búsqueda de mejores resultados estéticos y una reducción de la reincidencia. El uso posquirúrgico de antimetabolitos, como la mitomicina-C y la beta-radioterapia, también son utilizados como adyuvantes en la prevención de la reincidencia³.

Las investigaciones sobre la patogénesis del pterigión con el uso de modelos in vitro ha proporcionado información sobre los mecanismos moleculares subyacentes y con ello posibles blancos terapéuticos. Se ha demostrado que en pterigiones humanos, el metabolismo de colesterol se encuentra acelerado y que, cuando se aplican agentes antiproliferativos al pterigión, el metabolismo de colesterol disminuye⁴. Similarmente, se ha encontrado que los fibroblastos de pterigión tienen aumentado el proceso de esterificación del colesterol y esto conlleva un aumento en su tasa de proliferación⁵. Dado que el tejido adiposo es el principal sitio de almacenamiento y metabolismo de lípidos y colesterol, el análisis de vías en común entre este tejido y el pterigión brindaría más información sobre su patogénesis y posibles blancos terapéuticos. Además, la comparación con otro tipo de fibroblastos proporcionaría información sobre las características específicas de los fibroblastos de pterigión.

Propósito

El objetivo de esta investigación ha sido comparar la expresión de genes asociados al metabolismo de lípidos y colesterol entre fibroblastos de pterigión, adipocitos y otros tipos de fibroblastos e identificar las vías de señalización asociadas.

Metodología

Los datos sobre el patrón de expresión génica de 8 muestras de pterigión primario (GSE2513, sin usar conjuntiva), 12 de células adiposas (GSE39117, específicamente las T1 pre-LPS) y 63 de otros tipos de fibroblastos de diferentes tejidos del organismo (GSE63626, que contiene 3 de vaso sanguíneo, 4 de pecho, 8 de colon, 6 de duodeno, 6 de esófago, 3 de vesícula biliar, 6 de íleon, 5 de hígado, 3 de pulmón, 7 de glándula mamaria, 3 de próstata, 6 de estómago, y 3 de útero). Todos los datos fueron ensayados con la misma plataforma (Affymetrix Human Genome U133) y fueron obtenidos de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Los datos fueron normalizados transformándolos a distribución uniforme entre 0 y 1 antes del análisis. Cero indica nula o muy baja expresión y 1 indica la máxima expresión.

Los datos de expresión génica fueron analizados en Excel. Las regiones de intersección entre los estudios de expresión se obtuvieron por la función BUSCARV, creando una matriz con los mismos genes analizados en ambos tejidos junto con su valor de expresión para cada muestra. Posteriormente, los datos fueron normalizados mediante la función de Excel JERARQUIA.EQV, para asignar la misma jerarquía a los valores utilizados. El promedio de expresión para cada gen fue calculado para células adiposas, fibroblastos de pterigión y otros tipos de fibroblastos. Se calculó la diferencia de expresión, establecida como la resta del promedio de expresión de fibroblastos de pterigión y células adiposas para cada gen y luego se comparó con el promedio de expresión de los fibroblastos de otros tipos.

Se realizó el análisis estadístico de la diferencia de expresión de cada gen con la prueba t de student con los valores normalizados de los diferentes tipos celulares. La diferencia de expresión fue analizada para la determinación del intervalo de diferencia de expresión y valor de prueba t de student en los que existe mayor relación. El intervalo de diferencia de expresión fue establecido usando una diferencia absoluta mayor a 0.4 y una p < 1x10^-7. El intervalo de similitud de expresión fue acotado con una p > 0.5 y una diferencia absoluta en el nivel de expresión < 0.05.

El análisis de sobrerrepresentación de los genes similarmente y diferencialmente expresados entre fibroblastos de pterigión y células adiposas se hizo mediante la herramienta Gene Functional Classification Tool de DAVID Bioinformatics Resources⁶,⁷ para obtener los términos de ontología, vías de señalización e interacción proteica asociados. Los genes representativos de las vías del metabolismo de lípidos y colesterol fueron buscados en la matriz de genes en los diferentes tipos de células para comparar su nivel de expresión.

Resultados

Expresión de genes asociados al metabolismo de lípidos y colesterol en adipocitos, fibroblastos de pterigión y otros tipos de fibroblastos

Se analizó dentro de la matriz de datos los niveles de expresión de los genes ACOX1, HMGCR, HMGCS y LRP1, específicos del metabolismo de lípidos. Se observó que los cuatro genes presentan un mayor nivel de expresión (p < 0.05) en otros tipos de fibroblastos en comparación con fibroblastos de pterigión. El gen HMGCS mostró mayor nivel de expresión en fibroblastos de pterigión en comparación con adipocitos, con un valor p < 0.05. Los fibroblastos de otros tipos mostraron mayor expresión de este gen en comparación con adipocitos y fibroblastos de pterigión. Los genes ACOX1 y LRP1 no mostraron diferencia significativa en el nivel de expresión entre adipocitos y otros tipos de fibroblastos (p > 0.05) (Fig. 1).

Figura 1 Comparación de los niveles de expresión de los genes ACOX1, HMGCR, HMGCS y LRP1 entre adipocitos, fibroblastos de pterigión y otros tipos de fibroblastos. 

Se compararon, además, los promedios de los niveles de expresión de genes adicionales relacionados al metabolismo de lípidos entre cada tipo celular, generando un mapa de calor (Fig. 2). En general, se observó que la expresión de genes asociados al metabolismo de lípidos y colesterol tiene mayor similitud entre adipocitos y otro tipo de fibroblastos. Los genes con mayor diferencia en el nivel de expresión en fibroblastos de pterigión con respecto a los adipocitos y otros fibroblastos fueron FADS2, FADS3, HMGCR, LPL y APOC1. Los genes LDLRAD4, ACOT1, ACOX1, LRP1 y APOE no mostraron diferencia significativa en su nivel de expresión entre adipocitos y otros fibroblastos (p > 0.05).

Figura 2 Mapa de comparación del nivel de expresión de genes asociados al metabolismo de lípidos y colesterol.AD: adipocitos; FP: fibroblastos de pterigión; OF: otros fibroblastos. 

Discusión

El análisis de sobrerrepresentación de los genes con expresión similar y diferente entre adipocitos y fibroblastos de pterigión mostró una gran cantidad de genes asociados a procesos constitutivos: factores de transcripción, ciclo celular, membrana celular, etcétera. Al realizar la búsqueda enfocada a colesterol y metabolismo de lípidos, se encontraron términos con asociación significativa con una cuenta mucho menor de genes. De los genes diferencialmente expresados se obtuvieron más términos con asociación significativa al metabolismo de lípidos que en los genes similarmente expresados. El principal término asociado tanto a los genes similarmente como diferencialmente expresados entre fibroblastos de pterigión y adipocitos fue SREBP1. Este gen codifica para el activador transcripcional requerido para la homeostasia de los lípidos, regulando la transcripción del receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y de la síntesis de ácidos grasos y colesterol. Tong, et al.⁸ reportaron que la expresión de SREBP1 en pterigión es mayor al observado en conjuntiva sana. En nuestro análisis, el gen SREBP1 estuvo significativamente aumentado en fibroblastos de pterigión con respecto a lo observado en adipocitos, pero con igual expresión a otro tipo de fibroblastos.

Del análisis comparativo del nivel de expresión de genes asociados al metabolismo de lípidos y colesterol entre fibroblastos de pterigión, adipocitos y otros fibroblastos, se encontraron cuatro genes fundamentales desregulados: ACOX1, HMGCR, HMGCS y LRP1. De estos, solo HMGCS mostró mayor expresión en fibroblastos de pterigión en comparación con adipocitos. En un estudio previo, Peiretti, et al.⁹ demostraron que la HMGCR, enzima limitante en la vía de la síntesis de colesterol, se encuentra sobreexpresada en pterigión comparada con pingüécula y conjuntiva sana. En nuestro análisis, el gen HMGCR tuvo menor nivel de expresión en fibroblastos de pterigión en comparación con adipocitos y otros fibroblastos.

Los genes ACOX1, HMGR y LRP1 tuvieron un nivel de expresión promedio menor en fibroblastos de pterigión comparado con adipocitos. La expresión de ACOX1 y LRP1 no tuvo diferencia significativa entre adipocitos y otros fibroblastos. La enzima ACOX1 es la primera enzima en la vía de la beta-oxidación de los ácidos grasos, su disminución causa adrenoleucodistrofia, una enfermedad en donde hay acumulación de ácidos grasos de cadena muy larga¹⁰. HMGCR es la enzima limitante en la biosíntesis del colesterol y su expresión es directamente proporcional con los niveles séricos del mismo¹¹. Se ha demostrado que la inactivación en ratones de LRP1, el gen productor del receptor 1 de lipoproteínas de baja densidad, conlleva a dislipidemia y aterosclerosis¹².

El gen HMGCS1 mostró orden de nivel de expresión mayor a menor en otros fibroblastos > fibroblastos de pterigión > adipocitos. La diferencia en los niveles de expresión fue significativa. Este gen codifica para la enzima HMGCS1, la cual produce HMG-CoA en el paso crítico en la vía de la biosíntesis del colesterol. Se ha demostrado que la regulación aumentada de esta enzima conlleva a una síntesis elevada de lípidos y aumento de peso¹³. Los genes de las enzimas MVK y LSS, que también participan en la vía de la síntesis de colesterol, se encontraron con diferente expresión en los tres tipos celulares. El gen MVK tuvo mayor expresión en fibroblastos de pterigión, otros fibroblastos y adipocitos. Mientras que el gen LSS se encontró con menor expresión en comparación con adipocitos y otros fibroblastos. En conjunto, la desregulación de la expresión de genes de enzimas asociadas a la síntesis de colesterol explica la sobreproducción reportada por Peiretti⁴.

Dentro de los genes analizados, también se encontraron diferencias de expresión en aquellos que codifican para enzimas del metabolismo de lipoproteínas. Los genes APOB, APOC1 y APOL2 se encontraron con expresión significativamente disminuida en fibroblastos de pterigión con respecto a adipocitos y otros fibroblastos, mientras que el gen APOE se encontró sobreexpresado. APOB es el principal componente proteico de los quilomicrones (apoB-48), LDL y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) (apoB-100). Las mutaciones de este gen conllevan a niveles desregulados de LDL en sangre e hipercolesterolemia¹⁴. La desregulación de la expresión de los genes APOC1 y APOL1 se relaciona también con el desarrollo de trigliceridemia¹⁵,¹⁶. Se conoce que APOE media el metabolismo del colesterol y diferentes isoformas se asocian a hiperlipidemia e hipercolesterolemia¹⁷. LRP1 es el gen productor del receptor 1 de las LDL. Este receptor se involucra en la señalización intracelular y endocitosis de las lipoproteínas. Se ha demostrado que la inactivación de este gen en ratones conlleva a dislipidemia y aterosclerosis¹². El análisis mostró expresión de este gen en fibroblastos de pterigión disminuida significativamente en comparación con adipocitos y otros fibroblastos, lo cual se correlaciona con el aumento en el metabolismo de colesterol ya descrito.

Los niveles de expresión de los genes LPL, LCAT, FADS1 y FADS3 se encontraron significativamente disminuidos en fibroblastos de pterigión respecto a los adipocitos y otros fibroblastos. Estos genes codifican para enzimas que participan en la homeostasis del colesterol y ácidos grasos. La lipoproteinlipasa (LPL) hidroliza a los triglicéridos produciendo ácidos grasos libres y glicerol. Se ha demostrado que la deficiencia de esta enzima conlleva a hiperlipoproteinemia e hipertrigliceridemia¹⁸. La lecitina colesterolaciltransferasa (LCAT) convierte el colesterol libre a esteres de colesterol, la forma hidrofóbica del colesterol que forma parte de las lipoproteínas. La deficiencia de LCAT está asociada al aumento de los niveles de lipoproteínas de alta densidad (HDL) unido a colesterol e hipertrigliceridemia¹⁹. Las enzimas FADS1 y FADS3 desaturan los ácidos grasos produciendo ácidos grasos poliinsaturados, que son esenciales en el ser humano, su desregulación ha sido asociada a la hiperlipidemia²⁰-²².

El gen ACOT1 se encontró con expresión disminuida en fibroblastos de pterigión. Este gen codifica para la enzima acil-CoA tioesterasa, que regula los niveles intracelulares de ésteres-CoA, coenzima A y ácidos grasos libres. Se ha sugerido una relación funcional entre los niveles de esta enzima y la oxidación de ácidos grasos y que la regulación de ACOT1 es adaptativa como protección de la sobreproducción de ácidos grasos²³. La expresión de ACOT1 fue igual entre adipocitos y otros fibroblastos.

En general, la desregulación de los genes analizados provee un panorama más amplio de los mecanismos que subyacen al aumento de colesterol encontrado en el pterigión, que a su vez se relaciona con el aumento en la proliferación celular característica de esta patología.

Conclusiones

El pterigión es un crecimiento anormal en la conjuntiva que solo puede ser tratado con remoción quirúrgica. Aunque este tratamiento ha ido mejorando hasta el desarrollo de injertos autoconjuntivales y de membrana amniótica, aún no se ha logrado prevenir por completo la recurrencia. Este problema de salud es específicamente importante en regiones cercanas al ecuador, en donde la incidencia es mayor por la exposición a los rayos UV solares.

En el estudio de la patogénesis, se ha reportado que el colesterol es una de las vías desreguladas en el tejido de pterigión, lo cual contribuye al mecanismo de proliferación desregulada. Esto provee herramientas para la identificación de blancos terapéuticos que puedan ser abordados farmacológicamente para la disminución, eliminación o prevención de la recurrencia del pterigión.

En este sentido, se han reportado análisis del patrón de expresión génica por microarreglos y análisis por proteómica del pterigión. Sin embargo, la cantidad de información obtenida de estos análisis es muy vasta y la identificación de vías importantes puede llevar mucho tiempo. En estos análisis, la expresión génica del pterigión es comparada con la de conjuntiva sana. En este análisis se corroboró la desregulación del gen HMGCR previamente reportada en pterigión y se comparó por primera vez su nivel de expresión con adipocitos y otros fibroblastos. El análisis adicional de genes asociados al metabolismo del colesterol y de lipoproteínas demostró que los fibroblastos de pterigión tienen diferente patrón de expresión que otros tipos de fibroblastos y adipocitos, y que estos dos últimos tienen similar patrón de expresión de este tipo de genes. A la fecha, no se han encontrado reportes similares. El conocimiento de las vías lipídicas desreguladas en el pterigión proporciona herramientas para el estudio de su patogénesis y para el análisis de posibles blancos terapéuticos farmacológicos.