El empleo de hongos como agentes de control biológico depende, parcialmente, de la producción de estructuras infectivas de manera económica ^{(Latifian et al. 2013)}. Actualmente, la reproducción de hongos benéficos (HB) se puede realizar de manera artesanal, semi-industrial y/o industrial por compañías de bioplaguicidas; la diferencia principal entre estos sistemas radica en los volúmenes de producción ^{(Monzón 2001)}. Las técnicas de reproducción masiva de HB incluyen la fermentación bifásica, inicialmente se producen propágulos en medio líquido y posteriormente el inóculo obtenido se siembra sobre sustratos sólidos para obtener conidios ^{(Sahayaraj y Raja 2008)}. Bajo estas condiciones, el medio de Saboraud, dextrosa y agar (SDA) es el más recomendado para la producción de conidios de Lecanicilium lecanii, suplementado con polvo de camarón, con un rendimiento superior a 5x10⁹ conidios/ mL ^{(Reyes-Hernández et al. 2014)}.

Los hongos del género Simplicillium W. Gams & Zare, son los principales enemigos naturales de Hemileia vastatrix Berk. & Broome en Costa Rica ^{(García-Nevárez 2018)}. En Centroamérica, en 2012-2013, la roya causó pérdidas superiores a US$499 millones ^{(Promecafé/IICA 2013)}. Actualmente, el manejo de la roya en Costa Rica se basa en fungicidas cúpricos de contacto; desafortunadamente el cobre debe estar presente sobre las hojas previamente a la infección y se puede acumular en la materia orgánica del suelo en niveles fitotóxicos ^{(Arneson 2000)}. El biocontrol de H. vastatrix puede ser factible y ambientalmente seguro, por esto, desarrollar técnicas de producción de micoparásitos como S. lanosoniveum es clave para el manejo biorracional del patógeno. El objetivo de esta investigación fue evaluar medios de cultivo líquidos para la obtención de altas concentraciones de blastosporas de la especie S. lanosoniveum (SL).

La cepa de SL utilizada fue aislada de pústulas de H. vastatrix sobre Coffea arabica, variedad Caturra, en Turrialba, Costa Rica y codificada como EC (número de referencia de las secuencias similares en NBCI: MG807436.1) y se conserva en el Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE).

La cepa SL fue inoculada en el medio de cultivo de Papa Dextrosa Agar (PDA) para generar el inóculo inicial. Posteriormente, se evaluó la producción de blastosporas de SL utilizando los medios líquidos Jackson (MJ), medio base (MB), medio Bayfolan-Soya (BS) y medio Bayfolan-Quitina (BQ) (Tabla 1). Los matraces con los diferentes medios se inocularon con una suspensión de SL (1x10⁶ conidios/50 mL de medio). Los matraces inoculados fueron colocados aleatoriamente sobre un agitador orbital (VWR Scientific Products, USA) a 150 rpm. La concentración de blastosporas se contó cada 24 h después de la inoculación.

Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con cinco repeticiones; cada muestra consistió en un matraz de 125 mL de capacidad con 50 mL de medio. El análisis del número de blastosporas se realizó mediante el paquete estadístico Infostat ^{(Di Rienzo et al. 2016)}, realizando un análisis de conglomerados para ajustar el mejor modelo. La separación de medias fue mediante la prueba ^{Di Rienzo et al. (2002)} (DGC=0.05).

La mayor producción de blastosporas se produjo en los medios de BQ y BS, con picos máximos a los 14 días de incubación (DDI), respectivamente. Con menor producción, en el medio de MJ se registró el valor máximo a los 9 DDI, mientras que en MB se registraron los valores más bajos, alcanzando su pico máximo a los 5 DDI.

La producción de blastosporas en los medios MB y MJ declinó después del pico de producción, mientras que en las muestras de BS y BQ se mantuvo estable hasta los 19 DDI. Los valores máximos de blastosporas para ambos medios cuantificados a los 14 DDI fueron de 1.2X10⁸ blastosporas/mL para BQ y de 4.8X10⁷ para BS (Figura 1).

Figura 1 Producción de blastosporas de Simplicillium lanosoniveum en diferentes medios de cultivo. MJ: medio Jackson. MB: medio base. BS: bayfolan soya. BQ: bayfolan quitina. 

Cuando el hongo cultivado en MB y MJ alcanzó su máxima producción de propágulos, cinco y ocho DDI, en las condiciones de BS y BQ se produjeron 100 veces más blastosporas que MB y 10 veces más que MJ.

La presencia de cuerpos hifales de SL (Figura 2) observados en MB, posiblemente retardó la producción de blastosporas que había iniciado el primer DDI, adelantándose al resto de los medios de cultivo que iniciaron la producción un día después que MB.

Figura 2 Blastosporas, crecimientos cilíndricos y formación de cuerpos hifales de Simplicillium lanosoniveum. Aumento 20X. 

El número de blastosporas disminuyó a los 6 y 10 DDI en MB y MJ, respectivamente. Una fase estacionaria en la producción de blastosporas se observó entre 4-7 y 8-9 DDI para MB y MJ, respectivamente. En BS y BQ dicha fase se extendió desde 14 hasta 19 DDI. La adición de quitina coloidal a BQ mejoró la producción de blastosporas; un fenómeno similar fue observado con L. lecanii y la adición de fuentes de quitina ^{(Reyes-Hernández et al. 2014)}.

En general, SL cultivado en BS y BQ presentó los mejores resultados en la producción de blastosporas. Estos medios presentan la ventaja de incluir fuentes de carbono y nitrógeno de amplia disponibilidad (sacarosa y el fertilizante Bayfolan®). Los medios MS y MJ tuvieron una menor producción de dichos propágulos.

Además, la producción de altas concentraciones de blastosporas de S. lanosoniveum en los medios de cultivo BS y BQ se mantuvo durante 19 DDI.