Material biológico

Se emplearon las cepas Pleurotus ostreatus ECS-1123, de interés comercial, y Pleurotus djamor ECS-123, de interés biotecnológico debido a los metabolitos y enzimas que produce ^{(Moreno-Ruiz et al. 2014}; ^{Cruz-Ornelas et al. 2019)}, ambas cepas están resguardadas en el cepario micológico de El Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR) en Tapachula, Chiapas, México.

Obtención del inóculo

Para la preparación del inóculo, se emplearon semillas de sorgo lavadas, la humedad de las semillas se ajustó entre 60-70 %, siguiendo las indicaciones de ^{Quimio (2002)}. Posteriormente, el material se esterilizó en autoclave a 1.05 kg/cm² de presión, 121 °C por 30 min. Las semillas estériles y a temperatura ambiente, fueron inoculadas con micelio de las cepas de Pleurotus spp. ECS-123 y ECS-1123. Los inóculos se incubaron a 25 °C en oscuridad por aproximadamente 20 días.

Sustratos

Los materiales evaluados fueron tres residuos agroindustriales:1) pasto pangola, 2) pulpa de café y 3) olote de maíz. La pulpa de café fue obtenida como subproducto del beneficiado seco de café robusta Coffea canephora, una mezcla heterogénea de pulpa y cascarilla del grano de café. El pasto y el olote fueron obtenidos en el área agrícola de las inmediaciones de Tapachula, Chiapas, México y fueron fragmentados en partículas de 2-3 cm de longitud, con la ayuda de un molino eléctrico de disco de 7 HP.

Preparación de los tratamientos

A partir de los sustratos mencionados, se obtuvieron 10 tratamientos, siete fueron mezclas y tres fueron los residuos agroindustriales de manera individual (Tabla 1). Cada tratamiento consistió en 385 g de material seco (gramos de material seco necesarios para obtener un peso final de aproximadamente 1 kg en cada bolsa de tratamiento, con 60 % de humedad), adicionado con cal apagada (hidróxido de calcio 0.5 %). Todos los tratamientos se colocaron en bolsas de polipapel de 20 x 35 cm y fueron esterilizados en autoclave a 1.05 kg/ cm² de presión, 121 °C por 40 min. Posteriormente se enfriaron a temperatura ambiente y se inocularon con 40 g de semillas de sorgo colonizadas con micelio de las cepas antes mencionadas. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado.

Análisis bromatológico de los tratamientos

Para conocer la composición química de los diferentes tratamientos (sustratos), los materiales fueron molidos hasta obtener un polvo fino, y fueron enviados al Laboratorio de Bromatología de ECOSUR, en donde se realizaron las siguientes determinaciones, siguiendo los lineamientos de la AOAC ^{(Williams 1984)}: humedad y cenizas por el método gravimétrico; proteína por digestión 100 min/398 ºC, destilación con ácido bórico al 1 % y mezcla de catalizadores, titulación con solución de ácido sulfúrico 0.0501 N; nitrógeno por método de Kjeldahl; grasa por el método Soxhlet; fibra cruda por digestión ácida/alcalina; azúcares reductores por DNS, los carbohidratos totales se determinaron mediante la fórmula: % carbohidratos = 100 - (% humedad + % cenizas + % proteína + % grasa + % fibra cruda). El porcentaje de carbono fue obtenido por la fórmula de ^{Adams et al. (1951)}: % Carbono = (% VS) / 1.8, donde % VS = 100 - % cenizas.

Incubación y fructificación

Los tratamientos una vez inoculados, fueron incubados a 25 °C en oscuridad por 3-5 semanas, según colonizaba cada tratamiento. Una vez que los tratamientos estuvieron completamente colonizados, fueron trasladadas al cuarto de fructificación en condiciones apropiadas de humedad (80-90 %), temperatura (22-26 °C), luz natural y aeración constante ^{(Tshinyangu y Hennebert 1995)}.

Parámetro de crecimiento de los cuerpos fructíferos

Para la evaluación de productividad de las cepas en los diferentes sustratos se contaron y pesaron los hongos frescos de la primera y segunda cosecha por cada bolsa de tratamiento, a partir de estos datos se calculó la eficiencia biológica (EB), la tasa de producción (TP) y rendimiento (R), mediante las siguientes fórmulas ^{(Del Pilar Ríos et al. 2010)}:

El secado de los hongos y de los sustratos se llevó a cabo en una cámara de deshidratación a 50 °C por tres días.

Análisis estadístico

Se utilizó un diseño estadístico de dietas ABCD de 10 tratamientos con tres repeticiones para cada cepa. Los datos obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA), y a una prueba de comparación de medias por el método de Tukey, con 95 % de confiabilidad (α= 0.05), con el paquete estadístico JMP versión 7.0.1 ^{(SAS, 2007)}.

Composición bromatológica de los sustratos

En las Tablas 2 y 3 se muestran los resultados del análisis bromatológico de los tratamientos evaluados como sustratos. Se obtuvieron valores de proteína entre 2.54 a 8.21 % y de nitrógeno entre 0.41 a 1.31 %. El T₆, que corresponde a 100 % pulpa de café, obtuvo los porcentajes más altos de nitrógeno y de proteína, y en cuanto a la relación C/N presentó el valor más bajo en comparación a los demás tratamientos, que fue de 39.79. Por otro lado, los tratamientos T₈ y T₉ presentaron los valores más bajos de nitrógeno, que fueron de 0.41 y 0.47 %, respectivamente, aunque presentaron las relaciones C/N más altas, 131.41 y 111.87, respectivamente; T₈ corresponde a 100 % olote de maíz, y T₉ corresponde a la relación 1:1 de olote y pasto. El T₈ fue el tratamiento con mayor contenido de carbohidratos y azúcares reductores, mientras que el T₆ obtuvo los valores más bajos en dichos parámetros. Los valores de grasa oscilaron entre 0.2-1.04 % y los valores de ceniza entre 3.01-7.7 %.

Parámetros de producción y productividad

Eficiencia biológica. Los valores de EB de las cepas de Pleurotus spp. obtenidos con las diferentes mezclas y sustratos evaluados se muestran en la Figura 1.

Figura 1 Efecto de la variación del sustrato en la productividad de dos cepas de Pleurotus spp. La composición de los tratamientos se menciona en la Tabla 1. Las líneas sobre las barras representan la desviación estándar de tres repeticiones. Letras iguales indican que no hay diferencias significativas (en letras mayúsculas para el análisis de los tratamientos de la cepa ECS-123 y en minúscula para la cepa ECS-1123, a través de la prueba Tukey α= 0.05). 

Los valores obtenidos de las EBs correspondientes a la cepa P. djamor ECS-123 se clasificaron en tres grupos estadísticos: A, B y C. El T₇ (100 % pasto) fue el sustrato en que esta cepa produjo la mayor EB (EB= 38.2 %), siendo estadísticamente diferente sólo de T₆ (100 % pulpa de café) y T₁₀ (1:1 olote y pulpa de café), ya que se obtuvieron los valores más bajos (EBs de 20.8 % y 20.2 %, respectivamente).

En cuanto a la cepa P. ostreatus ECS-1123, el análisis estadístico separó los valores promedio de EB en dos grupos diferentes: a y b. El valor más alto para esta cepa se obtuvo en el T₇ (100 % pasto) con una EB de 48.8 %, este valor fue estadísticamente similar a las EBs de siete de los tratamientos probados: T₁, T₂, T₃, T₄, T₅, T₉ y T₁₀, pero diferente de T₆ (100 % pulpa de café) y T₈ (100 % olote), los cuales obtuvieron los valores de EB más bajos (16.9 y 24.6 %, respectivamente), estos dos tratamientos no tuvieron diferencias significativas entre sí.

El efecto de cada sustrato en la EB es presentado en la Figura 2, para ambas cepas es notorio que, a mayor cantidad de pasto en los tratamientos, las EBs se incrementan. Mientras que, a mayor cantidad de pulpa de café en los tratamientos, las EBs disminuyen.

Figura 2 Efecto del sustrato (olote, pasto y pulpa de café) sobre la EB de las cepas cultivadas. Las líneas punteadas horizontales hacen referencia a la media de respuesta de la EB y las líneas punteadas verticales hacen referencia al intercepto de la media de respuesta de la EB con el eje y. 

En el caso del olote de maíz, los resultados variaron dependiendo de la cepa, ya que las muestras inoculadas con P. djamor ECS-123 presentaron menores porcentajes de EB cuando se aumentó el contenido de olote, mientras que para P. ostreatus ECS-1123 los mejores EBs se alcanzaron cuando el tratamiento contenía una fracción de 0.33 del sustrato, disminuyendo su productividad a mayores contenidos del olote de maíz.

Peso promedio, productividad y rendimiento. En la Tabla 4 se muestran los resultados de los parámetros de productividad de las cepas evaluadas bajo los diferentes tratamientos. El peso promedio de los hongos cosechados con ambas cepas fue mayor en el T₇, siendo estadísticamente diferente sólo de T₆ y T₁₀ en la cepa ECS-123, y de T₆ y T₈ en la cepa ECS-1123. El mismo comportamiento se observó para la tasa de producción (TP) y rendimiento (R), con valores de 0.1 hasta 0.6 % y de 6.5 a 18.8 %, respectivamente. Por otro lado, el número de hongos cosechados en los diferentes tratamientos de la cepa ECS-123 no presentaron diferencias significativas, con valores que oscilaron entre 30.2 a 62.8 hongos por bolsa. Para el caso de la cepa ECS-1123, T₇ presentó el número más alto de cuerpos fructíferos cosechados por bolsa de 46.2, este valor fue estadísticamente similar a los tratamientos T₁,T₂, T₃, T₄, T₅, T₈, T₉ y T₁₀, pero diferente de T₆, que fue el tratamiento con menor número de hongos cosechados por bolsa.

Composición bromatológica de los sustratos

Las mezclas de sustratos (tratamientos) evaluados en el presente estudio, permitieron explorar una variedad de concentraciones de nutrientes disponibles para el cultivo de Pleurotus spp., los cuales incluyeron valores de nitrógeno entre 0.41 y 1.31 %, relaciones C/N entre 39.79 hasta 131.41 y contenidos de azúcares reductores entre 13.76 a 23.09 % (Tablas 2 y 3), entre otros parámetros evaluados.

Los contenidos de carbono, nitrógeno y proteína del olote de maíz y el pasto se encuentran dentro de los intervalos de reportes previos, 51 % para carbono, de 2.5-3.3 % para proteína y una relación C/N de 96.5-132.7 ^{(Reyes et al. 2009}; ^{Colmenares-Cruz et al. 2017}; ^{Morales y Sánchez 2017)}, a excepción de ^{Hoa et al. (2015)} quienes reportaron para el olote de maíz un contenido de nitrógeno y una relación C/N diferentes (1.16 y 34.57 %, respectivamente). La pulpa de café presentó una menor cantidad de proteína y azúcares reductores y una mayor cantidad de fibra que la reportada comúnmente ^{(Braham y Bressan, 1978)}, esto probablemente se debe a que la pulpa utilizada en estos experimentos provenía de un beneficio seco de café variedad Robusta (Coffea canephora), la cual lleva un procesamiento postcosecha de secado directo, diferente del tratamiento de despulpado y acumulación en fresco de la pulpa que caracteriza a los granos de la otra especie cultivada, C. arabica. Los subproductos obtenidos por ambos procesos son diferentes, el beneficiado seco proporciona una mezcla de fragmentos de pulpa y cascabillo, como el utilizado en la presente investigación, mientras que con el beneficiado húmedo se obtiene la pulpa entera con residuos del mucílago que acompaña al grano y sin cascabillo. Esto explicaría el menor contenido de azúcares y más fibra en las muestras aquí analizadas.

Por otra parte, el contenido de fibra cruda de los 10 tratamientos evaluados se encuentra dentro de los porcentajes señalados en la literatura (30 al 60 %, ^{Koutrotsios et al. 2014}). La variación aquí observada entre las diferentes combinaciones de sustrato (38.01 a 39.84 %, Tabla 2) no fue suficiente para demostrar un efecto en la producción de hongos, más bien, indica que los sustratos probados tenían suficiente materia lignocelulósica para el cultivo de hongos de pudrición blanca. El contenido de grasas de los tratamientos evaluados osciló entre 0.2 y 1.04 %. La literatura reporta que los sustratos que no sobrepasan contenidos lipídicos de 1 %, favorecen una lenta descomposición ^{(Heredia-Solis et al. 2014)}. El contenido de cenizas varió de 3.01 a 7.7 % siendo acorde con estudios previos que indican disponibilidad adecuada para los requerimientos minerales en el crecimiento de Pleurotus spp. ^{(Castillo et al. 2012}; ^{Heredia-Solis et al. 2014)}.

Producción y rendimiento

El sustrato donde se obtuvieron los valores más altos de eficiencia biológica (EB) para ambas cepas fue el pasto pangola, que presentó un contenido de proteína de 3.32 % y nitrógeno de 0.53 % (Tabla 2) y una relación C/N de 96.75 (Tabla 3). De acuerdo con la literatura, un alto rendimiento del cultivo de Pleurotus sp. se obtiene a partir de sustratos que contengan nitrógeno entre 0.5-1.2% con base a materia seca ^{(Dündar y Yildiz 2009)}. Además, el pasto pangola presentó una composición adecuada de fibra y una alta concentración de azúcares reductores, que, adicionado de una alta concentración de ácidos acético, propiónico y butírico, resulta en una mayor disponibilidad de energía ^{(Reyes et al. 2009)}. Esto podría explicar por qué este pasto resulta un buen sustrato para Pleurotus spp. y otros hongos comestibles ^{(Barrios-Espinoza et al. 2009}; ^{Colmenares-Cruz et al. 2017}; ^{Morales y Sánchez 2017)}.

Llama la atención que los sustratos que produjeron mayor EB no fueron aquellos que contenían más nitrógeno. De hecho, para ambas cepas, el sustrato que produjo valores estadísticamente bajos de EB fue la pulpa de café (T₆), que tenía la concentración más alta de nitrógeno y proteína (1.31 y 8.21 %, respectivamente) y una relación C/N de 39.79 (Tablas 2 y 3). El contenido de nitrógeno y de proteína en el sustrato, junto con el carbono, son nutrientes esenciales para el crecimiento del micelio, la colonización y formación de primordios, así como el desarrollo de cuerpos fructíferos ^{(Sánchez et al. 2008)}. Esta situación sugiere que las concentraciones de nitrógeno y proteína del sustrato son importantes hasta cierto punto, pero que la producción y la productividad no dependen únicamente de ellas, sino también de otros factores, como por ejemplo: otros nutrientes de fácil acceso y de la microbiota presente en la micósfera, la cual influye de manera determinante por la presencia de microorganismos benéficos que estimulan el crecimiento del hongo ^{(Torres-Ruiz et al. 2016)}, y aún de otros microorganismos con genes que implican capacidad para fijar nitrógeno ^{(Sánchez y Royse 2017)}. El género Pleurotus spp. en su fase de crecimiento micelial, consume preferentemente carbohidratos solubles y simples ^{(Sharma et al. 2013)}, en este sentido, se observa que la pulpa de café fue el sustrato con menor contenido de azúcares reductores y carbohidratos entre los tratamientos probados (Tabla 2).

En ambas cepas, se observó que, a mayor porcentaje de pasto en los tratamientos, mayor es la EB, mientras que a mayor porcentaje de pulpa de café se observa un descenso de dichos valores (Figura 2). Por ello, cuando el sustrato fue 100 % de pulpa de café (T₆) se observó el valor más bajo. Esto no concuerda con lo reportado por otros autores, quienes afirman que los residuos de café son un excelente sustrato para el cultivo del género Pleurotus, en particular la pulpa. Incluso, se han reportado valores de EB de hasta 175 % ^{(Martínez Carrera 1989}; ^{García etal. 2006}; ^{García-Oduardo et al. 2011)}. La baja EB podría ser atribuida al tipo de residuos de café que se usó en los sustratos. ^{Mendoza et al. (2019)} reportaron un valor de EB de 15.7 %, un valor más bajo al obtenido en este trabajo (16.9 %), en P. ostreatus sobre los residuos de café C. arabica. Por otro lado, ^{Savón et al. (2018)} reportaron valores de EB entre 57.7 y 59.4 % en dos cepas de Pleurotus spp. utilizando como sustrato pulpa de café obtenida de C. canephora. ^{Nieto-Juárez et al. (2019)} reportaron diferentes valores de EB del cultivo de P. ostreatus sobre pulpa de café provenientes de diferentes lugares, aun tratándose de la misma variedad, por lo que el lugar de procedencia de los sustratos influye sobre su calidad.

El T₈ (100% olote de maíz), presentó el contenido de nitrógeno más bajo, abajo del valor mínimo de 0.5% recomendado para el cultivo de hongos ^{(Dündar y Yildiz 2009)}, por ello, la preparación de mezclas de sustratos favoreció elevar el 0.41 % de nitrógeno y el 0.2 % inicial de grasas (Tablas 2 y 3), aunque la grasa no es un nutriente esencial, puede tener un efecto benéfico en el desarrollo micelial que implique una mejor disponibilidad de energía ^{(Forero et al. 2008}; ^{Reyes et al. 2009)}.

Los valores de EB obtenidos en el presente estudio son bajos en comparación a lo reportado por ^{Barrios-Espinoza et al. (2009)}, quienes alcanzaron una EB de hasta 112 % en cepas de P. ostreatus, cultivado en pasto pangola pasteurizado previamente por composteo en cajones. Por su parte, ^{Torres-Ruiz et al. (2016)} aislaron microorganismos promotores en la micósfera de P. ostreatus después de la pasteurización del sustrato, los cuales tuvieron efecto positivo en el desarrollo de micelio y crecimiento de basidiomas. En este trabajo, los sustratos fueron esterilizados en autoclave, que, adicionadas a variaciones en el sustrato y la cepa utilizada, pueden explicar las diferencias de productividad reportadas.

En cuanto a la TP y R, los valores obtenidos fueron inferiores a los reportados por ^{Romero et al. en 2010} (TP de 2.2 % utilizando de hojas de plátano para el cultivo de P. ostreatus), mientras que ^{Sánchez et al. (2008)} reportaron una TP de 2.9 % para cultivo de P. ostreatus en rastrojo de tomate. Los valores de rendimiento para la cepa ECS-123 variaron entre 7.7-14.7 % y no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, mientras que en la cepa ECS-1123 estos valores fluctuaron entre 6.5 hasta 18.8 %. En general, en la primera cosecha se obtuvo entre 60 y 70 % de la producción de basidiomas totales, que coincide con lo reportado por ^{Pérez Merlo y Mata (2005)} y ^{Gaitán-Hernández et al. (2006)}.

Un parámetro físico importante de resaltar es la compactación del sustrato. Se observó que las bolsas de T₆ (100 % pulpa de café), estaban más compactas con respecto a otros tratamientos que se veían más esponjados o voluminosos. Algunos autores reportan que la compactación del material afecta el intercambio de gases, favoreciendo el aumento de la concentración de CO₂, disminuyendo el O₂ disponible y provocando condiciones adversas para el rendimiento del hongo ^{(López-Rodríguez et al. 2008}; ^{Liang et al. 2009)}; por ello, se considera que cuando la pulpa de café estuvo mezclada con otros sustratos, ya sea pasto, olote o ambos, se alcanzaron mejores resultados de productividad. ^{García-Oduardo et al. (2011)} afirman que la pulpa café debe ser mezclada o suplementada con otros subproductos agrícolas (pajas de cebada y trigo, bagazo de caña de azúcar y rastrojo de maíz) para favorecer la fermentación aerobia de la misma y ofrecer mejores valores de EB, TP y R.