Los extractos vegetales son una fuente para el descubrimiento de nuevas moléculas o principios activos con un amplio rango de aplicaciones, desde la protección de los cultivos, la industria de la comida como antimicrobiano y antifúngico, hasta su uso en medicamentos tradicionales (^{Zhou et al., 2010}; ^{Negi, 2012}). La utilización de principios activos botánicos (PAB) en la agricultura surge de la necesidad de desarrollar medidas alternas para el control y protección de cultivos y productos almacenados (^{Letessier et al., 2001}), ya que la aplicación de fungicidas químicos ha generado problemas de desequilibrio ambiental y salud humana, favoreciendo el surgimiento de enfermedades fitopatógenas más agresivas y resistentes (^{Yengle et al., 2008}), además de incrementar los costos de producción (^{Céspedes y Alarcón, 2011}). Los extractos vegetales están compuestos por metabolitos secundarios que presentan diversos mecanismos de defensa eficientes para el control de enfermedades fitopatógenas y son menos tóxicos para el medio ambiente (^{Guédez et al., 2014}). Poseen un amplio espectro de acción para el control de organismos de interés comercial (^{Bakkali et al., 2008}), ya que son usados como antimicrobianos y antifúngicos (^{Monsálvez et al., 2010}), aunque su eficacia es altamente dependiente de la presencia y concentración de los componentes presentes, ya sea como extracto o aceite esencial (^{Mejía-Garibay et al., 2011}); por lo que una separación de los principios activos de los extractos y la evaluación de su eficacia sobre los organismos fitopatógenos podría incrementar las opciones de control bajo un esquema biorracional y de acuerdo con los principios de la química verde (^{Anastas et al., 2000}).

Actualmente existen en el mercado PABs que se han purificado de manera aislada y se desconoce su eficacia contra agentes fitopatógenos de importancia, debido a que son aceites esenciales muy volátiles y que generalmente se utilizan como repelentes; sin embargo, se están preparando nuevas formulaciones para ser utilizadas como productos de contacto contra insectos y enfermedades (^{Deshpande et al., 2006}). Así mismo, varios autores mencionan la eficacia de monoterpenos (^{Banihashemi y Abivardi, 2011}) y productos organosulfurados (^{Cázar et al., 2015}) como inhibidores de crecimiento de hongos y bacterias entomopatógenos. Por lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la capacidad inhibitoria in vitro de los PABs: 1-8 cineol (eucaliptol), β-citronelol, D-limoneno y alil isotiocianato, sobre el crecimiento micelial de los hongos fitopatógenos Rhizoctonia solani (Agonomicetaceae), Fusarium oxysporum (Nectriaceae) y Alternaria solani (Pleosporaceae).

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Toxicología del Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN). El eucaliptol (CAS-4708206) 99%, β-citronelol (CAS-106229) 95% y D-limoneno (CAS-5989275) 96% fueron obtenidos de Sigma Aldrich® y el alil isotiocianato (CAS-570607) 98% de Thermo Fisher®. Primeramente, se realizaron ventanas biológicas mediante bioensayos en medio de cultivo PDA envenenado (^{Ochoa Fuentes et al., 2012}), con la finalidad de establecer el intervalo de concentraciones a evaluar de cada uno los principios activos botánicos. Se evaluaron ocho concentraciones más un testigo por cada PAB: de 1000 a 4500 ppm con intervalos de 500 ppm para eucaliptol y D-limoneno, de 20 a 160 ppm con intervalos de 20 ppm para β-citronelol y de 500 a 4000 ppm con intervalos de 500 ppm para el alil isotiocianato. Cada concentración fue evaluada por quintuplicado. Los cultivos de los agentes fitopatógenos R. solani, F. oxysporum y A. solani fueron proporcionados por el cepario del Departamento de Parasitología de la UAAAN. Para la obtención de las concentraciones requeridas en el ensayo, se tomó el PAB a la concentración marcada en el envase y se realizaron diluciones con el medio de cultivo estéril, elaborado previamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con las que se prepararon placas en cajas de Petri de 9 cm Ø. Posteriormente se colocaron explantes de 0.5 cm Ø de cada una de las cepas fitopatógenas, previamente cultivadas en PDA, sobre las placas de medio cultivo. Las muestras se incubaron a 25 °C±2 en la oscuridad, midiendo diariamente el crecimiento micelial con un vernier, tomando dos valores en forma de cruz y sacando un promedio del diámetro micelial desarrollado. Las mediciones se realizaron hasta que los cultivos testigo (PDA sin PAB), cubrieron el diámetro total de las cajas de Petri. El porcentaje de inhibición de crecimiento se determinó de la siguiente manera: % inhibición = [(crecimiento micelial del testigo - crecimiento del tratamiento) / crecimiento del testigo] x 100. Una vez determinado el rango de concentraciones de la ventana biológica, se realizaron los bioensayos para determinar la concentración inhibitoria media (CI₅₀) con el mismo método. A los resultados de inhibición se les realizó una regresión Probit, mediante el método de máxima verosimilitud para determinar la CI₅₀ y sus límites fiduciales usando el programa SAS ver. 9.0 (^{SAS, 2002}).

De los cuatro PABs evaluados, β-citronelol fue el que presentó la mayor inhibición (93.2 a 98.8%) sobre los agentes fitopatológicos, a una menor concentración. Con relación a la CI₅₀, el patógeno más susceptible a la acción de β-citronelol fue F. oxysporum con 5.44 ppm, seguido de R. solani con 6.25 ppm (Tabla 1). β-citronelol es un monoterpeno acíclico identificado en Cymbopogon citratus “zacate limón”, Cymbopogon winterianus (Poaceae) “citronela de Java”, Lippia alba (Verbenaceae) “hierba negra” y Pelargonium graveolens (Geraniaceae) “malva silvestre” (^{Brito et al., 2012}; ^{Elsharif y Buettner, 2017}). Este PAB se utilizó inicialmente como atrayente para el control de ácaros (^{Vanhaelen et al., 1978}) y repelente contra mosquitos (Aedes aegypti, Anopheles quadrimaculatus y A. albimanus) (^{Taylor y Schreck, 1985}). Posteriormente se usó para controlar estadíos inmaduros de la garrapata de ganado Amblyomma americanum (^{Tabanca et al., 2013}) y para tratar enfermedades causadas por basidiomicetos, ascomicetos, zigomicetos y oomicetos (^{Banihashemi y Abivardi, 2011}). ^{Vaillant Flores et al. (2009)} reportaron que el β-citronelol inhibe el crecimiento de Rhizoctonia solani. Por su parte, ^{Banihashemi y Abivardi (2011)} encontraron que este PAB inhibió el 100% del crecimiento de oomicetes como Pythium y Phytophthora, en dosis de 1 a 10 ppm; mientras que ^{Morcia et al. (2017)} detectaron inhibición o disminución del crecimiento micelial de tres especies del género Fusarium, a CI₅₀ de 110 a 320 ppm.

Respecto al limoneno (Tabla 1), F. oxysporum requirió la concentración más alta (4040 ppm) en su CI₅₀, en contraste con A. solani que presentó la CI₅₀ más baja, de 1435 ppm. A pesar de que estas concentraciones pueden considerar altas para su uso agrícola, este PAB puede ser una alternativa de manejo para dichos agentes patógenos y ser incluido como fungicida para producción de cultivos orgánicos, ya que presenta nula toxicidad (^{Elson et al., 1988}), y es ampliamente utilizado en la preservación de alimentos por su actividad antibacterial (^{Espina et al., 2013}). Al respecto, ^{Marei et al. (2012)} mencionaron que el monoterpeno D-limoneno posee propiedades antifúngicas para Rhizoctonia solani y F. oxysporum, aunque anteriormente, ^{Alzate et al. (2009)} no habían encontrado efecto inhibitorio del extracto de cáscara de cítricos, rico en contenido de limoneno sobre F. oxysporum, esto probablemente debido a la combinación del D-limoneno con otros metabolitos aprovechables metabólicamente por el hongo, lo que podría interferir en su capacidad de inhibición. A la fecha, aún se desconocen los sitios de acción de este monoterpeno en hongos y Oomicetes, aunque se ha reportado su actividad antibacteriana debido a que sus componentes tienen la capacidad de incorporarse en ciertas estructuras de las membranas celulares, pudiendo ser absorbidos por la interfase de la membrana y alterar su sistema lipído, debido a la penetración en la monocapa lipídica (^{Wydro et al., 2017}).

En las evaluaciones con el 1-8 cineol (Tabla 1), las CI₅₀ variaron entre 1173 y 3565 ppm, correspondiendo las concentraciones mínima y máxima a los hongos A. solani y F. oxysporum, respectivamente. ^{Cazar et al. (2015)} encontraron que el extracto de Eucalyptus globulus inhibe el crecimiento micelial de Alternaria sp. a concentraciones de 300 ppm, valores inferiores a los encontrados en este estudio. El mecanismo de acción del Eucaliptol, tanto en bacterias como en hongos de importancia clínica, esta mediado por la pérdida de integridad de la membrana y la inhibición de la respiración celular, reduciendo la capacidad para mantener la homeostasis (^{Carson et al., 2006}), por lo que este PAB ha sido incluido en la agricultura como pesticida verde, debido a que está considerado como antimicrobiano de amplio espectro que puede inhibir completamente el desarrollo de hongos fitopatógenos como Fusarium graminearum, F. culmorum y Pyrenophora gramínea, a concentraciones de 2% (^{Terzi et al., 2007}).

Respecto al compuesto alil isotiocianato (Tabla 1), A. solani fue el patógeno más susceptible a este compuesto a concentraciones de 1022 ppm, mientras que R. solani fue el que presentó la mayor tolerancia, ya que su CI₅₀ fue de 1632 ppm. El alil isotiocianato es un compuesto que se encuentra presente en las crucíferas y presenta eficacia antibacterial contra patógenos de alimentos (^{Park et al., 2012}), además de tener efectos sobre la calidad de la fruta, suprimiendo los contenidos fenólicos y antocianinas en la mora, Morus alba (^{Chen et al., 2015}). Sin embargo, debido a su fuerte olor irritante, no ha sido conveniente utilizarlo en la conservación de frutas y hortalizas, siendo microencapsulado en goma arábiga para la industria alimentaria (^{Wu et al., 2015}). En este estudio, para el caso en F. oxysporum, se requirieron concentraciones menores a 4000 ppm para tener una buena acción de control. Este PAB puede ser incluido en el manejo integrado de enfermedades, debido a que reduce el contenido de aflatoxinas, fumonisinas, zerolenonas y tricotecenos producidos en grano de maíz por Aspergillus parasiticus, Fusarium tricinctum, F. verticillioides, Alternaria alternata y Gibberela zeae (^{Tracz et al., 2017}), así como la reducción de beaubericinas, compuesto bioactivo producido por el metabolismo secundario de varias cepas de Fusarium (^{Meca et al., 2012}). ^{Dhingra et al. (2004)} reportaron que el aceite esencial de mostaza fue efectivo en el control del mal del talluelo o marchitamiento fúngico (damping-off) en frijol causado por Rhizoctonia solani. Otros estudios reportan el uso de este PAB en el control de malezas, ya que redujo significativamente la viabilidad de los tubérculos de Cyperus rotundus (^{Bangarwa y Norsworthy, 2016}). Por otro lado, ^{Daferera et al. (2000)} reportaron que las propiedades antifúngicas del alil isotiocianato se deben a la formación de puentes de hidrógeno entre sus hidroxilos y sitios activos de ciertas enzimas de los hongos; mientras que ^{Omidbeygi et al. (2017)} encontraron que actúan sobre la membrana celular, provocando cambios celulares, enzimáticos y proteicos en los patógenos.

Los PAB evaluados en este estudio presentaron resultados promisorios como agentes de control inocuos y amigables con el humano y medio ambiente, siendo factible su uso en el control de algunos hongos fitopatógenos. El β-citronelol, en dosis bajas, fue el que presentó los mejores resultados de inhibición, por lo se recomienda su uso para el control de los fitopatógenos estudiados, así como para la rotación en el manejo de la resistencia a fungicidas sintéticos.