Recolección de material

Durante los años 2013-2016, se recolectaron muestras vegetales con síntomas de cenicillas en plantas de onagra, mercadela, hortensia y margarita localizadas en jardines de Texcoco, Estado de México, México. Las muestras de limón con síntomas y signos de cenicilla se recolectaron en árboles de traspatio localizados en los municipios de Villa Guerrero y Texcoco en el Estado de México, México. Los especímenes representativos de cada planta hospedante se depositaron en el herbario del Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo con los números de acceso UACH H115-H119.

Análisis en microscopia de luz (ML)

Para el análisis en microscopia de luz, se realizaron preparaciones semipermanentes a partir de signos del hongo sobre una gota de ácido láctico al 85% y ligeramente calentada. Las características morfológicas de 100 conidios, 50 conidióforos, 10 apresorios hifales y 10 tubos germinativos se examinaron en un microscopio de luz Eclipse Ni-U (Nikon Corporation, Japón) equipado con una cámara Moticam 580 (Motic, China) para su caracterización cualitativa y cuantitativa. La identificación a nivel de género y especie se realizó siguiendo las claves especializadas para Erysiphales reportadas por ^{Braun y Cook (2012)}.

Análisis en microscopia electrónica de barrido (MEB)

Para el análisis en MEB, se fijaron piezas pequeñas de hojas (5 mm²) con ligera esporulación, en frascos conteniendo glutaraldehído (Electron Microscopy Science, USA) al 3% y se almacenaron a 4 °C por 24 h, para ser procesadas de acuerdo con la metodología reportada por ^{Bozzola y Russell (1992)}. Las piezas de hojas fijadas se lavaron tres veces en buffer de fosfatos Sorensen 0.1M, pH 7.2 por 20 min en cada cambio, se deshidrataron en una serie gradual de etanol (30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 96 %) por 20 min, y dos veces en etanol al 100 % por 30 min en cada cambio. Los especímenes se colocaron en una secadora de punto crítico Sandri-780 (Tousimis Research Corporation, EE. UU.) con CO₂. El material desecado se transfirió a un portamuestras metálico usando una cinta adhesiva doble de cobre y se cubrieron con una capa de oro de 500 Å de grosor en una ionizadora Ion Sputter JFC-1100 (Jeol, Japón) por 4 min. Los especímenes se examinaron en un microscopio electrónico de barrido JSM-6390 (Jeol, Japón) operado a una aceleración de voltaje de 10 kV y se tomaron micrografías a magnificaciones entre 600 y 10,000×.

Síntomas

En plantas de O. fruticosa se observaron inicialmente colonias fúngicas dispersas a manera de parches grisáceos principalmente sobre la superficie adaxial de las hojas (Figura 1A-B). Posteriormente, las colonias se expandieron y coalecieron hasta cubrir la superficie de las hojas casi en su totalidad. En infecciones severas, se observó crecimiento micelial sobre los tallos de las plantas. De acuerdo con ^{Gleason et al. (2009)}, las plantas de O. fruticosa son comúnmente susceptibles a la infección por Erysiphales y los síntomas se presentan típicamente como un crecimiento fúngico blanco-grisáceo sobre la superficie inferior de las hojas. Sin embargo, no hay reportes sobre las especies de Erysiphales que causan esta enfermedad en México.

Figura 1 Síntomas y signos de cenicilla en plantas ornamentales y frutales. A-B) Crecimiento fúngico blanco-grisáceo de Erysiphe sp. en hojas de Oenothera fruticosa; C) Hoja de Calendula officinalis con síntomas de cenicilla causados por Podosphaera xanthii; D) Síntomas de cenicilla causados por Pseudoidium hortensiae en hojas de Hydrangea macrophylla. E) Hoja de margarita con crecimiento fúngico sobre la superficie superior causado por Golovinomyces macrocarpus. F) Fruto de limón real cubierto por crecimiento fúngico blanco de Erysiphe quercicola. 

Con respecto a C. officinalis, los signos se observaron a manera de polvo blanco-grisáceo principalmente sobre la superficie adaxial de las hojas (Figura 1C). En infecciones severas, la totalidad de la hoja fue cubierta por los signos del hongo. Cabe mencionar que no se observaron signos del hongo sobre tallos o inflorescencias. Al respecto, ^{Lucero et al. (2007)} reportaron síntomas similares en plantas de C. officinalis en Argentina y también indicaron que las hojas afectadas se pueden deformar y marchitar para posteriormente secarse.

Acerca de las plantas de H. macrophylla, éstas exhibieron síntomas a manera de parches blanquecinos sobre la superficie adaxial (Figura 1D) y abaxial de las hojas. En infecciones severas, se observó una necrosis del tejido foliar. Estos síntomas coincidieron con los reportados por ^{Woodward y Daughtrey (2001)} para el caso de cenicillas infectando Hydrangea spp., además indicaron que, bajo condiciones óptimas para el desarrollo de la enfermedad, se pueden observar manchas marrones-purpuras cubiertas por crecimiento fúngico blanco.

En cuanto a los síntomas en plantas de L. vulgare, éstos se presentaron inicialmente como lesiones cloróticas en la superficie adaxial de las hojas, las cuales posteriormente se cubrieron de crecimiento fúngico blanco (Figura 1E). De acuerdo con ^{Braun y Cook (2012)}, varias especies de Leucanthemum pueden ser infectadas con cenicilla, incluyendo a L. maximum, L. monspeliense y L. vulgare.

En árboles de limón se observó que todas las partes verdes (hojas, ramitas, brotes y frutos) presentaron síntomas. Éstos inician como pequeñas colonias de micelio blanco sobre la superficie de los tejidos y, posteriormente, pueden llegar a cubrir completamente los tejidos con abundante producción de estructuras asexuales del hongo. Los tejidos mayormente infectados son los que se localizaron en la parte inferior y central de la copa del árbol, coincidiendo con la parte más sombreada. Las hojas son las partes más comúnmente colonizadas por el hongo tanto en la superficie adaxial como en la abaxial, causando en infecciones severas una deformación de hojas y defoliación prematura. Las ramitas infectadas pueden cubrirse casi en su totalidad y exhibir muerte descendente. Los brotes o tejidos jóvenes son afectados severamente y llegan a presentarse deformaciones de hojas, al ser cubiertas completamente por el micelio. Los frutos infectados son cubiertos por micelio y esporulación del hongo casi en su totalidad y en infecciones severas se presenta caída prematura. Estos síntomas concuerdan con los reportados por ^{Holford et al. (2010)} para el caso de árboles de mandarina (Citrus reticulata) infectados con E. quercicola en Bután.

Caracterización morfológica

El análisis en ML de los caracteres morfológicos del hongo infectando O. fruticosa mostró conidióforos erectos originando conidios simples; las células base de los conidióforos fueron cilíndricas, midiendo de 24.3-33.8 × 6.3-10.4 μm, y seguida por 1-2 células más cortas; los conidios fueron elipsoides, doliiformes y cilíndricos, de 22.4-34.5 × 9.6-15.8 μm (Figura 2A); los tubos germinativos fueron terminales, cortos, y con apresorios conidiales lobados (Figura 2B-C). Mientras que, en MEB se observaron apresorios hifales lobados, solitarios (Figura 2D) o en pares opuestos; los conidióforos fueron erectos y originaron conidios individuales (Figura 2E); los conidios turgentes presentaron pared externa con patrón rugoso (Figura 2F) y pared terminal con patrón fibrilar (Figura 2G). No se observaron casmotecios. Todas las características morfológicas del anamorfo fueron consistentes con las reportadas por ^{Braun y Cook (2012)} para el caso de los estados asexuales de Erysiphe howeana y E. alphitoides. Por consiguiente, nuestro estudio no logró distinguir entre ambas especies de Erysiphales mediante el uso de las características morfológicas del anamorfo. Esto coincidió con ^{Bereczky et al. (2015)}, quienes indicaron que las especies Erysiphe howeana y E. alphitoides en plantas de Oeneothera spp., únicamente pueden ser distinguidas mediante el análisis de secuencias del ADN ribosómico.

Figura 2 Micrografías en microscopia de luz A-C) y microscopia electrónica de barrido D-G) del estado asexual de Erysiphe sp. sobre hojas de Oenothera fruticosa. A) Conidios. B-C) Conidios germinando y con apresorio conidial lobado. D) Apresorio hifal lobado y solitario. E) Conidióforo con conidio simple. F) Conidio turgente mostrando pared externa con patrón rugoso. G) Pared terminal del conidio con patrón fibrilar. 

La examinación en MEB realizada al hongo que se encontró infectando tejidos de C. officinalis mostró conidióforos con conidios catenados parcialmente deshidratados mostrando patrón sinuoso en la pared externa (Figuras 3A y B); los apresorios hifales fueron solitarios y en forma de pezón (Figura 3C); los conidios turgentes presentaron pared externa con patrón liso y con superficie de la pared terminal con patrón verticilado (Figura 3D); los conidios exhibieron tubos germinativos más o menos terminales, simples (Figura 3E) o bifurcados (Figura 3F). No se observó la presencia de casmotecios. Las características del anamorfo coincidieron ampliamente con las descripciones en MEB de Podosphaera xanthii reportadas sobre calabaza zucchini (Cucurbita pepo) (^{Félix-Gastélum et al., 2005}) y tomatillo (Physalis ixocarpa) (^{Félix-Gastélum et al., 2007}) en México. Por otra parte, el análisis en ML mostró hifas lisas con pared delgada; los apresorios hifales fueron solitarios y en forma de pezón; los conidióforos fueron erectos y originándose de la superficie superior de la célula madre; las células basales de los conidióforos presentaron forma cilíndrica, midiendo 41.6-65.9 × 10.9-13.4 µm, seguidas por 2-3 células más cortas; los conidios fueron catenados, elipsoides-ovoides a doliiformes y midiendo 24.4-36.8 × 14.8-21.1 µm. Estos caracteres morfológicos concuerdan con las descripciones reportadas para el estado anamorfico de Podosphaera xanthii (^{Braun y Cook, 2012}). Previamente, ^{Yáñez-Morales et al. (2009)} reportaron la presencia del anamorfo de P. xanthii sobre C. officinalis en México. Asimismo, nosotros no observamos la presencia de casmotecios, en contraste con otros estudios realizados en Argentina (^{Lucero et al., 2007}) e Italia (^{Garibaldi et al., 2008}), donde se ha observado comúnmente la presencia de casmotecios en plantas de C. officinalis.

Figura 3 Micrografías en microscopia electrónica de barrido del estado asexual de Podosphaera xanthii. A-B) Conidióforos con conidios catenados (parcialmente deshidratados) mostrando patrón superficial sinuoso. C) Apresorio hifal solitario y en forma de pezón. D) Conidio turgente con pared externa con patrón liso y parte terminal con patrón verticilado. E) Conidio deshidratado con tubo germinativo simple. F) Conidio deshidratado con tubo germinativo bifurcado. 

La examinación en MEB de la especie de hongo infectando H. macrophylla, reveló conidios formados individualmente sobre el conidióforo (Figura 4A); los conidios turgentes mostraron patrón rugoso en la pared externa (Figura 4B) y patrón fibrilar en la parte terminal (Figura 4C); los apresorios hifales fueron multilobados, solitarios o en pares opuestos (Figura 4D). Por otra parte, en ML se observaron conidióforos erectos y originándose más o menos en la parte central de la superficie superior de la célula madre y midiendo 53-116 × 8.1-9.7 µm; las células basales de los conidióforos fueron cilíndricas, algunas veces ligeramente curvadas, midiendo 16.3-38.6 × 6.2-9.9 µm, seguidas por 1-2 células más cortas; los conidios fueron elipsoides-ovoides, cilíndricos o doliiformes, midiendo 23.5-42.7 × 11.6-18.9 µm. No se observó la presencia de casmotecios. Estas características fueron similares a las descritas por ^{Braun y Cook (2012)} para Pseudoidium hortensiae. Este hongo se ha reportado ampliamente a nivel mundial infectando plantas de Hydrangea spp. (^{Farr y Rossman, 2018}). En México, ^{Yáñez-Morales et al. (2009)} previamente identificaron mediante análisis en ML a P. hortensiae sobre Hydrangea sp. en muestras de Texcoco, Estado de México.

Figura 4 Micrografías en microscopia electrónica de barrido de Pseudoidium hortensiae. A) Conidióforo con conidio simple. B) Conidio turgente con superficie exterior con patrón rugoso. C) Conidio mostrando superficie de pared terminal con patrón fibrilar. D) Apresorios hifales multilobados solitarios y dispuestos en pares opuestos. 

La examinación en ML del hongo sobre hojas de L. vulgare mostró conidióforos erectos, rectos y midiendo de 108 a 144 µm de longitud (Figura 5A); las células base de los conidióforos fueron cilíndricas o incrementándose ligeramente en amplitud de la base a la punta de 58.6-84.6 × 10.9-14.4 µm, seguidas por 1-2 células más cortas (Figura 5B); los conidios fueron catenescentes, elipsoides-ovoides a doliiformes, midiendo de 23.3-37.8 × 12.6-20.5 µm (Figura 5C); los tubos germinativos fueron terminales y simples. Por otra parte, la examinación en MEB exhibió apresorios hifales solitarios y en forma de pezón (Figura 5D); los conidióforos con conidios catenados (Figura 5E); los conidios turgentes presentaron pared externa con patrón granuloso y con superficie de la parte terminal con patrón fibrilar (Figura 5F), mientras que los conidios parcialmente deshidratados mostraron un patrón reticulado en la pared externa y un patrón fibrilar en la superficie de la parte terminal. No se observó la presencia de casmotecios. Con base en los caracteres morfológicos observados en ML y MEB, el hongo se identificó como el estado asexual de Golovinomyces macrocarpus (^{Braun y Cook, 2012}). Para nuestro conocimiento, este es el primer reporte de G. macrocarpus causando cenicilla en L. vulgare en México. Este patógeno, se ha reportado sobre hospedantes de la familia Asteraceae en países de Europa, África del Norte (Marruecos), Norteamérica (Canadá y EE. UU.), Sudamérica (Argentina), y Asia (Irán, Japón, Kazakstán y Rusia) (^{Braun y Cook, 2012}).

Figura 5 Micrografías en microscopia de luz (A-C) y microscopia electrónica de barrido (D-G) del estado asexual de Golovinomyces macrocarpus. A-B) Conidióforos con conidios simples. C) Conidios. D) Apresorio hifal solitario y en forma de pezón. E) Conidióforos con conidios en cadena. F) Conidio turgente con patrón superficial granuloso y patrón terminal fibrilar. G) Conidio parcialmente deshidratado con patrón superficial reticulado y patrón terminal fibrilar. 

La examinación en ML del hongo en C. limon mostró hifas hialinas, septadas, de 2.2-5.4 µm de ancho y con apresorios lobulados (2-3); los conidióforos fueron erectos y midiendo 29.9-62.1 × 6.6-9.9 µm; las células basales fueron rectas, cilíndricas, de 23.3-36.6 × 6.5-9.8 µm (Figuras 6A-B) seguida por 1-2 células cortas que dan origen a un conidio simple; los conidios primarios fueron obovoides-elipsoidales, hialinos, con ápice redondeado y base subtruncada (Figura 6C); los conidios secundarios fueron doliiformes, hialinos, con los ápices subtruncados, de 20.9-32.5 × 10.8-14.7 µm (Figura 6D); los tubos germinativos fueron simples (Figuras 6E-F). No se observaron casmotecios. Todas las características observadas en ML correspondieron con las reportadas por ^{Braun y Cook (2012)} para el estado asexual de Erysiphe quercicola. En un estudio previo llevado a cabo por ^{Yáñez-Morales et al. (2009)}, se identificó mediante análisis en ML a E. quercicola infectando árboles de limón en muestras recolectadas en Tenancingo, Villa Guerrero y Texcoco en el Estado de México; en Ocuituco, Morelos; y en San Salvador el Verde, Puebla. Con respecto a MEB, se observaron conidióforos con conidios simples (Figura 6G); los conidios turgentes primarios (Figuras 6H-I) y secundarios (Figura 6J) mostraron pared externa con patrón rugoso, mientras que, la pared terminal presentó patrón superficial fibrilar (Figura 6K); los tubos germinativos fueron simples (Figura 6K) y los apresorios miceliales fueron multilobados (Figura 6L). De manera similar, ^{Holford et al. (2010)} identificaron a Oidium citri (sin. E. quercicola) en árboles de mandarina en Bután usando ML y MEB, así como análisis de secuencias de la región de los espaciadores internos transcritos (ITS) del ADN ribosómico. No obstante, estos autores únicamente publicaron las micrografías, pero no describieron los patrones de la pared externa y pared terminal de conidios observados en MEB.

Figura 6 Micrografías en microscopia de luz (A-F) y microscopia electrónica de barrido (G-L) del estado asexual de Erysiphe quercicola. A) Conidióforo con conidio primario. B) Conidióforo con conidio secundario. C) Conidio primario. D) Conidio secundario. E-F) Conidios con tubo germinativo simple. G) Conidióforo con conidio turgente simple. H-I) Conidios secundarios turgentes con pared exterior con patrón rugoso. J) Conidio primario con pared externa con patrón rugoso. K) Conidio con pared terminal con patrón fibrilar y con tubo germinativo simple. L) Apresorio hifal multilobado. 

En general, las examinaciones en MEB realizadas en este estudio permitieron diferenciar a los géneros Erysiphe, Podosphaera, Pseudoidium y Golovinomyces con base en los patrones de las paredes externas y terminales de conidios. Esto confirmó lo indicado por ^{Cook et al. (1997)}, ^{Braun et al. (2002)}, y ^{Braun y Cook (2012)}, quienes mencionaron que los patrones superficiales de conidios vistos en MEB, ayudan a la identificación precisa de los géneros de anamorfos de Erysiphales, permitiendo la identificación del género del teleomorfo en ausencia de su ascoma. Asimismo, se llevó a cabo la identificación a nivel de especie de cuatro Erysiphales mediante características morfológicas de conidióforos, conidios, apresorios hifales, tubos germinativos y apresorios conidiales vistas en ML y MEB.

En conclusión, este estudio muestra de manera detallada la examinación morfológica mediante MEB y ML de cinco especies de Erysiphales, incluyendo a Erysiphe sp., Podosphaera xanthii, Pseudoidium hortensiae, Golovinomyces macrocarpus y E. quercicola. Estos datos morfológicos servirán para ampliar el conocimiento sobre estudios de Erysiphales en México y a nivel mundial. Además, este estudio muestra el primer reporte de G. macrocarpus infectando L. vulgare en México.