Características del depósito de estudio y puntos de muestreo

El estudio se realizó en un depósito que resguarda un fondo documental muy revisado en el ARNAC, ubicado en el municipio Habana Vieja, La Habana, Cuba, en una zona aledaña al puerto de La Habana, caracterizada por niveles importantes de polución del aire, producto de la actividad industrial y el movimiento vehicular. El depósito estudiado se ubica en la segunda planta y sus dimensiones de largo × ancho × altura son 15. 2 × 6.2 × 2.5 m; se ventila de forma natural a través de orificios en la pared diseñados especialmente para dicho fin. El local atesora un fondo documental en papel de alto valor científico e histórico patrimonial, que se resguarda en estantería de madera. El acceso al local por parte del personal y la manipulación de los materiales es muy frecuente debido al elevado número de solicitudes de documentos de dicho fondo por parte de los usuarios de la institución.debido al elevado número de solicitudes de documentos de dicho fondo por parte de los usuarios de la institución.

Mediciones de temperatura y humedad relativa

Aunque se recogen datos de forma continua utilizando un termohigrógrafo, se realizaron mediciones durante la colecta de las muestras en cada punto de muestreo empleando un termohigrómetro digital.

Muestreo microbiológico del aire

Se establecieron 7 puntos de muestreo aéreo de acuerdo con Sánchis.¹⁵ Además, de acuerdo con Pasquarella,¹⁶ se obtuvo una muestra de aire exterior como control.

Las muestras de aire se tomaron por dos métodos: uno activo (interior y exterior) y otro pasivo (interior). Para el método de sedimentación en placa (pasivo) sugerido por Omeliansky¹⁷ se colocaron placas abiertas de 110 mm de diámetro durante 5 minutos a 1.5 m del suelo. Con el método volumétrico (activo) se utilizó un biocolector SAS Super 100™ (VWR International Srl, Italia) para aspirar 100 L de aire/1 minuto. En ambos casos se empleó un medio de cultivo específico para hongos: agar Malta (AM) suplementado con cloruro de sodio (NaCl) (7.5 %).¹⁸ Después de los muestreos, las placas se incubaron invertidas durante 7 días a 28 ± 1 °C y se realizó el conteo y aislamiento de colonias diferentes para análisis posteriores.

Análisis biométricos

Se determinó las unidades formadoras de colonias por metro cúbico de aire (UFC/m³) para cada uno de los métodos de muestreo:

Identificación taxonómica de los aislados

Para la identificación se tuvieron en cuenta las características culturales y morfológicas de las colonias y de las estructuras por observación al estéreomicroscopio y al microscopio óptico, según resultara conveniente. Dichas características se determinaron a partir de colonias de cada aislado obtenidas por inoculación en el medio AM. Para la observación de las características morfológicas se montaron microcultivos según la técnica de Casadesús y Rojas,²¹ así como preparaciones en fresco, semipermanentes con lactofenol. Para la observación de estructuras hialinas se utilizó lactofenol-azul algodón²² o lactofenol-fushina.²³

Las observaciones y mediciones se realizaron en un microscopio biológico trinocular de campo claro con cámara digital acoplada.

La identificación taxonómica hasta nivel de género se realizó de acuerdo con los criterios de Kendrick y Carmichael²⁴ y Barnett y Hunter.²⁵ La identificación de las especies de Aspergillus se realizaron según Raper y Fennel.²⁶ Para identificar hasta especie de los aislados del género Cladosporium, se efectuaron microcultivos en los medios AM, agar papa dextrosa y agar nutriente sintético; se tuvieron en cuenta los criterios de Castañeda²⁷ y Bensch.²⁸ En todos los casos se realizaron al menos 20 observaciones distribuidas en varios campos de visión, en preparaciones tanto de la parte joven como de la zona madura de la colonia. Las mediciones del tamaño conidial de cada una de las cepas se tomaron en cuenta para el análisis de la penetración de los conidios en el tracto respiratorio humano.

Concentración de hongos en el aire del depósito

Con el objetivo de realizar un estudio más completo desde el punto de vista cualitativo se complementó un método activo de muestreo aéreo con otro pasivo, lo cual implicó diferencias entre las concentraciones estimadas a partir de cada uno de ellos, incluso en un mismo punto de muestreo. Estas diferencias han sido informadas por varios autores,^16,18 pero su discusión la pasaremos por alto al no ser objetivo de este trabajo.

La determinación de las concentraciones de propágulos fúngicos en el local permitió estimar de forma general el nivel de polución del aire por hongos viables (Cuadro 1).

T, temperatura; HR, humedad relativa

^aValor promedio de la concentración fúngica en cada punto muestreado (por triplicado).

^bContaminado según método de Omeliansky (método pasivo). Referencia 17

^cContaminado según Cappitelli y colaboradores (método activo). Referencia 33

^dMedia de la concentración fúngica teniendo en cuenta las 15 placas utilizadas.

^eMedia de las 5 mediciones que corresponden a los puntos de muestreo microbiológico.

Cuadro 1 Concentraciones de propágulos fúngicos detectados mediante dos métodos de muestreo en un depósito documental 

La calidad microbiológica ambiental de un local depende de factores como la actividad que en él se desarrolla, la cantidad de personas que acceden o permanecen en el mismo, la ubicación del recinto dentro del edificio, el nivel de empolvamiento de las superficies, el tipo de ventilación/climatización, las características de los sitios colindantes, la zona geográfica y climática y la época del año.^13,29

Es por ello que si bien en ambientes laborales con características similares (como sucede con algunos depósitos documentales) es probable que existan semejanzas en la micobiota ambiental, no puede asumirse que su composición es homogénea. Para obtener resultados veraces deben realizarse estudios puntuales y frecuentes, más aún cuando se trata de detectar microorganismos con implicaciones en la salud humana.

Aunque desde hace algunos años se han incrementado en el mundo los estudios de calidad micológica del aire interior de ambientes domiciliarios y laborales por el riesgo potencial que implica la presencia de hongos para la salud humana, en la actualidad no existe un consenso internacional en cuanto a regulaciones que establezcan valores límite que permitan clasificar a un ambiente interior como contaminado o no.

En la literatura se encuentran disponibles reportes que establecen diferentes niveles de contaminación fúngica en interiores.^3,30,31,32 En relación con este estudio, dentro de la Unión Europea se plantea que 150 UFC/m3 debe ser el límite de hongos permisibles para que el ambiente interior de locales en instituciones patrimoniales se considere de calidad.³³ Es válido aclarar que en Cuba no existe normativa que regule la cálida microbiológica del aire en archivos, bibliotecas u otras instituciones públicas de características similares.

Como criterio general puede asumirse que la calidad microbiológica de un ambiente interior es buena si las concentraciones microbianas en el mismo son menores o iguales a las que existen en las áreas exteriores aledañas.^1,34 Esto a su vez se ha visto que guarda relación con la temperatura, humedad relativa, ventilación y grado de empolvamiento.^35,36

En este estudio, las concentraciones detectadas en algunos puntos del interior (180 y 155 UFC/m3 ) fueron significativamente mayores que las de áreas exteriores, donde la media fue de 80 UFC/m3. Lo anterior es indicativo de la existencia de microambientes originados por gradientes de temperatura, humedad relativa y ventilación en diferentes zonas del depósito. Estos microambientes pueden constituir reservorios de esporas y otros propágulos que pueden tener marcado carácter alergénico y convertirse en un factor de riesgo importante considerando la elevada dosis de alérgenos y el largo tiempo de exposición de los individuos que acceden al depósito durante la jornada laboral.

La reacción excesiva del sistema inmune se va adquiriendo después de exposiciones prolongadas a concentraciones elevadas de antígenos durante meses o años. Sin embargo, una vez que el sistema inmune ha sido sensibilizado, la reacción de hipersensibilidad se desencadena con exposición a mínimas cantidades del alérgeno específico.^{11, 37}

Así, los individuos ya sensibilizados con los alérgenos característicos de algunas esporas o propágulos podrían presentar episodios de alergia en el futuro si se ponen en contacto con una pequeña cantidad de estos, incluso fuera del ambiente laboral. Si se tiene en cuenta que la mayoría de estos hongos son anemófilos y abundan en el exterior se hace evidente que dicho contacto es altamente probable.

Los valores de temperatura y humedad relativa en el depósito (Cuadro 1) se encuentran dentro de lo establecido para la conservación de los soportes documentales que se preservan en el mismo.³⁸ Sin embargo, ante una exposición prolongada pueden propiciar que el aire seco afecte la humedad mucosal del tracto respiratorio superior o conjuntivo^.3 De esta forma se facilita el paso de los antígenos a través de las mucosas, desencadenando las posteriores reacciones de hipersensibilidad. Es por ello que en instituciones de este tipo es una exigencia permanecer el menor tiempo posible dentro de los depósitos.³⁸

Identificación taxonómica y de cepas con potencial alergénico

Si se pretende realizar un diagnóstico microbiológico ambiental riguroso en un ambiente interior es necesario no solo la cuantificación de los microorganismos sino, además, su identificación y caracterización.¹³ Rojas³⁴ plantea que para valorar el riesgo de los hongos ambientales sobre la salud es necesario conocer el género y la especie, ya que los efectos pueden ser graves en ambiente con presencia de un agente altamente alergénico o toxigénico, incluso a bajas concentraciones.

En el local se detectó gran diversidad de hongos, que fueron ubicados en 19 géneros entre ascomicetos, basidiomicetos y zigomicetos (16 hongos filamentosos y tres levaduras), además de tres tipos de micelios no esporulados (Figura 1). La comparación con la muestra de aire tomada en el exterior del edificio, donde se detectaron solo 9 géneros, denotó grandes diferencias. Fue evidente que tanto para la concentración como en términos de diversidad, el local se comportó como un reservorio importante de propágulos fúngicos y, consecuentemente, de alérgenos de diferentes características.

Figura 1 DR porcentuales de los géneros y micelios detectados en el depósito documental. DR, densidades relativas; OME, hongos detectados por método de sedimentación en placas de agar (Omeliansky); SAS, hongos detectados por aspiración de aire mediante biocolector; MSHNE, micelio septado hialino no esporulado; MSPNE, micelio septado pigmentado no esporulado; MAHNE, micelio aseptado hialino no esporulado. 

Vale destacar que la diversidad fúngica en el ambiente pudiera ser mayor, pues no se tomaron en cuenta los propágulos fúngicos no viables, que si bien son incapaces de colonizar sustrato alguno, sí pueden causar reacciones alérgicas.

La exposición prolongada a tal diversidad de esporas u otros fragmentos de hongos de forma repetida aumenta considerablemente el riesgo de que se desarrollen reacciones alérgicas específicas contra antígenos fúngicos.¹¹

Fue evidente el predominio de representantes de los géneros Aspergillus y Cladosporium, con los mayores valores de densidad relativa. Fue notable también la presencia de Penicillium spp.

Es de amplio conocimiento que los representantes de Aspergillus spp., Cladosporium spp. y Penicillium spp. son productores de gran cantidad de antígenos de marcado carácter alergénico; estos pueden ser enzimas, toxinas y compuestos orgánicos volátiles (Cuadro 2). Por otra parte, algunos componentes de la pared celular de las esporas como glucoproteínas y ciertas proteínas de reacción cruzada de estructura altamente conservada filogenéticamente pueden ejercer efecto negativo aun sin que exista crecimiento activo o viabilidad.⁵

Si bien a un género fúngico se le pueden atribuir determinadas propiedades alergénicas, existen grandes diferencias entre especies e, incluso, entre cepas de una misma especie. En este estudio detectamos especies de los géneros mencionados que se reportan como reconocidas causantes de alergias: Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Cladosporium cladosporioides, Penicillium oxalicum y Penicillium chrysogenum.^5,39

Otro género detectado de suma importancia para los alergólogos fue Alternaria. Aunque de forma general su concentración en el aire es menor que la de otros como Cladosporium spp., existen más personas alérgicas a Alternaria y las respuestas a sus alérgenos son mucho más severas.¹⁴ Cladosporium produce por lo general una reacción alérgica suave debido a sus altas concentraciones en el ambiente, causa importante de alergia inhalante y asma alérgica en los seres humanos.^10,40 Ambos géneros fúngicos son causantes de reacciones de hipersensibilidad, que puede ser inmediata y afectar al aparato respiratorio superior causando rinitis y asma;⁹ algunos autores han demostrado que existe una reactividad cruzada entre estos tipos de esporas. Este hecho y las elevadas concentraciones alcanzadas por los representantes de Cladosporium spp. en el aire, potencia la respuesta inmunológica de las personas sensibles a Alternaria spp.^10,41

El aislamiento de Alternaria cinerariae en el exterior del edificio y la baja concentración a la que se encontró en el interior pudieran explicar su procedencia y su detección ocasional en el local. Se aislaron otros géneros de potencialidades para causar reacciones alérgicas (Cuadro 2).

X, antígeno no descrito con nomenclatura oficial.

Cuadro 2 Hongos detectados cuyos propágulos se reportan como causantes de alergias^5,39  

El tamaño de los propágulos fúngicos como factor de virulencia

La capacidad individual de un microorganismo para causar enfermedades depende de una serie de mecanismos conocidos como factores de virulencia o atributos patogénicos.⁴² En los hongos filamentosos estos son diversos y varían según el grupo, el género o la especie.⁴³

En el caso de las reacciones de hipersensibilidad, asma o micosis invasivas en las vías respiratorias, sin duda el tamaño de las esporas puede ser considerado como un atributo patogénico importante. El tracto respiratorio funciona como una compleja red para la distribución del aire inspirado, en el que los conductos se van ramificando y disminuyendo de diámetro progresivamente hasta alcanzar los alvéolos, por lo que actúa a modo de trampa atrapaesporas, filtrando y reteniendo la mayoría de las partículas que acompañan a los más de 8000 L de aire que diariamente movilizan los pulmones.^{1, 44}

Cuando se inhalan en grandes cantidades, las esporas de pequeño tamaño son arrastradas al tracto respiratorio inferior y pueden llegar a los alvéolos.En este estudio, la medición de las esporas de los aislados esporulados, además de utilizarse para la identificación taxonómica, hizo posible determinar su potencial para penetrar en las vías respiratorias (Cuadro 3).

A, tracto respiratorio superior; B, tráquea, bronquios y bronquiolos; C, alvéolos

Cuadro 3 Tamaño de las esporas/propágulos de los diferentes taxa detectados. Nivel del tracto respiratorio al que penetran 

En el tracto respiratorio superior pueden penetrar 100 % de los propágulos detectados, sin embargo, 58 % no puede pasar al resto de las vías respiratorias debido a que su tamaño excede las 10 µm.

Entre las esporas que se retienen a este primer nivel se encuentran las de los géneros Alternaria, Botryotrichum, Fusarium, Gilmaniella, Itersonilia, Nigrospora, Nodulisporium, Ovulariopsis, Pestalotia, Zygospirium y Rhodotorula. Las esporas de estos hongos pueden entrar en contacto con la mucosa nasofaríngea y desencadenar alergias o infecciones.

El resto de las esporas (42 %) son capaces de pasar a tráquea, bronquios y bronquiolos. Destacan en este grupo, géneros detectados con altas DR como Aspergillus, Cladosporium y Penicillium. Solo las esporas que presentan un tamaño inferior a 3 µm pueden penetrar a los alvéolos (26 %).

Rodríguez y colaboradores,⁴⁵ en un estudio enfocado a identificar géneros fúngicos aislados de la mucosa nasal y faríngea de pacientes con rinitis alérgica, detectaron esporas de los géneros Cladosporium, Penicillium, Aspergillus, Alternaria y Fusarium a nivel nasal y esporas de Cladosporium, Aspergillus y Penicillium a nivel faríngeo, resultado que respalda el análisis que realizamos. Debe considerarse, además, que las especies de estos 3 últimos géneros se identifican con elevada frecuencia y casi siempre de forma predominante en el aire y sobre las superficies de ambientes laborales en Cuba.^34,46

Impacto de los estudios aeromicológicos en la alergología

Los estudios aeromicológicos constituyen una herramienta de gran valor para la lucha contra las alergias a los hongos y otras afecciones que estos producen. El mejor tratamiento para los procesos alérgicos se basa en evitar la exposición al alérgeno desencadenante de la reacción.¹¹ Aunque este tratamiento casi nunca es posible en forma plena, mediante estudios ambientales sistemáticos pudiera dilucidarse la dinámica de la micobiota característica de determinados locales o edificios, lo que derivaría en un mejor trabajo profiláctico en la prevención de las alergias.

Uno de los mayores problemas que existen en el estudio de las alergias a los hongos es la estandarización de los extractos antigénicos debido a que hay variaciones antigénicas importantes relacionadas con las condiciones ambientales de crecimientos como la temperatura, el pH, o los sustratos en los cuales se desarrollan.⁴⁷

En ausencia de información específica sobre la composición cualitativa y la concentración de antígeno en la atmósfera y sin el empleo de extractos uniformes de antígenos, es difícil establecer una relación causa-efecto.

Los estudios aerobiológicos de interiores y exteriores en conjunto con la caracterización de los aislados de determinadas zonas geográficas, edificios, viviendas o puestos de trabajo pudieran facilitar los bancos de especímenes que permitan la elaboración de extractos con cepas a las que con mayor probabilidad se expone una población o grupo determinado. Por otra parte, permitirán ubicar posibles fuentes de esporas o zonas de deposición de determinados propágulos.