Introducción

Durante el desarrollo de la rata, en el periodo crítico de la diferenciación sexual a nivel cerebral, el cerebro de estos roedores macho está expuesto a altos niveles de testosterona de origen testicular, los cuales se incrementan a finales de la gestación, principalmente dos horas después del nacimiento (^{Anne et al. 2011}). En las neuronas, la testosterona se convierte a estrógenos mediante la intervención de la enzima P450 aromatasa. Los estrógenos pueden actuar en dos etapas: en la fase de “organización” durante los periodos prenatal y postnatal temprano, y en la fase de “activación” en la edad adulta (^{Phoenix et al. 1959}). El efecto del estradiol en la fase organizacional induce la diferenciación sexual del hipotálamo (^{Lauber et al. 1997}) y regula activamente los circuitos neuronales (^{Barraclough 1966}; ^{Simerly et al. 2002}), responsables de la secreción tónica de gonadotropinas (^{Finkelstein et al. 1991}; ^{Bagatell et al. 1994}) y el comportamiento reproductivo característico de los machos (^{Lauber et al. 1997}; ^{Simerly 2002}). Los estrógenos también participan en la espermatogénesis y en la maduración espermática en el epidídimo (^{Balasinor et al. 2001}).

La exposición a disruptores endócrinos (EDCs, por sus siglas en inglés, endocrine-disrupting chemicals, de origen natural o sintético) exógenos que imitan o bloquean el efecto endógeno de las hormonas esteroides sexuales (^{Wilson et al. 2007}) pueden enviar mensajes contradictorios al cuerpo, y provocar anormalidades en el desarrollo biológico con efectos irreversibles.

El papel de los estrógenos en la reproducción sexual se ha confirmado mediante el uso de antiestrógenos como el tamoxifeno (Tx; Z-1-[4-(2-dimethylamino-ethoxy)-phenyl]-1, 2-diphenyl-1-butane) (^{Barraclough 1967}; ^{Dörner 1968}; ^{Döhler et al. 1984}), un fármaco sintético comúnmente utilizado en el tratamiento de cáncer de mama. Su mecanismo de acción aún no es claro, pero se sabe que ejerce diversos efectos biológicos, actúa como un completo agonista o antagonista según la dosis, el órgano blanco, el sexo y la especie (^{Gill-Sharma et al. 1993}; ^{Furr et al. 1984}; ^Macnab,1984). Además del tamoxifeno existen otros químicos que alteran el ambiente hormonal y afectan el crecimiento, el desarrollo y el comportamiento sexual.

En ratones macho, el Tx perjudica el desarrollo de los testículos y las glándulas accesorias después de la administración neonatal (24 horas postnacimiento; 20 o 100 µg/día durante cinco días; ^{Iguchi, 1986}), y genera infertilidad (^{Taguchi 1987}). El Tx impide la interacción del estradiol con su receptor en el hipotálamo, además de inhibir la enzima aromatasa, lo que conduce a la feminización cerebral (^{Döhler et al. 1985}). En ratas adultas, ^{Gill-Sharma (1993)} y Nafisa ^{Balasinor (2002)} reportaron un efecto irreversible del Tx sobre el eje hipotálamo-hipófisis (observaron una reducción-dosis dependiente en la fertilidad debido a la pérdida de embriones en hembras apareadas con ratas macho tratadas con Tx).

En nuestro grupo, ^{Herrera et al, (2013)} encontraron que en ratas, una sola dosis subcutánea (sc) de Tx (200 µg), aplicada una hora después del nacimiento, modifica la expresión de ciertos genes hipotalámicos. Para avanzar en estos estudios, diseñamos un experimento donde se determinó la expresión de 11 genes específicos en el hipotálamo de ratas macho dentro de las primeras seis horas después del tratamiento con: 1) Tx disuelto en SO, 2) SO y 3) grupo control, a una hora posnacimiento.

Algunos de los animales se pesaron cada semana, se sacrificaron a los 90 días de edad, y se les extrajeron los testículos, se pesaron y se sometieron a análisis histológico. Las observaciones de los cambios en la morfología testicular en estos animales se presentan en esta comunicación.

Materiales y métodos

Resultados y discusión

Los resultados del peso testicular y el peso corporal a los 90 días postratamiento se muestran en el Cuadro 1. El promedio del peso testicular fue significativamente más bajo en los animales tratados con Tx, que en los grupos: control y el tratado solo con SO (F: 47.19; grados de libertad entre grupos: 2; grados de libertad dentro de los grupos: 12; P < 0.001).

Cuadro 1 Promedio ± DE del peso corporal y testicular a los 90 días. 

Peso corporal y testicular de ratas de 90-días de edad. Distinto superíndice en cada línea indica diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05).

El promedio del peso corporal a los 90 días fue menor en los animales tratados con Tx seguido del grupo tratado con SO, mientras que los animales del grupo control obtuvieron un peso mayor (F: 16.67; grados de libertad entre grupos: 2; grados de libertad dentro de los grupos: 12; P < 0.001). Solo los animales tratados con Tx mostraron una reducción significativa en el diámetro tubular (H: 12.88; Hc: 13.00; P < 0.005), el área tubular (H: 9.85; Hc: 9.85; P < 0.05) y la altura del epitelio germinal (H: 27.04; Hc: 27.05; P < 0.001) (Cuadro 2). En comparación con el grupo control, el espacio intertubular fue mayor en los animales tratados con Tx seguido de los tratados con SO.

Cuadro 2 Morfometría testicular de ratas macho de 90 días de edad tratadas con tamoxifeno y SO una hora posnacimiento (promedio ± EE) 

Alteraciones testiculares inducidas por tratamientos con Tx y/o SO. Distinto superíndice en cada línea indica diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05).

El promedio del conteo celular por túbulo se muestra en el Cuadro 3. El número de espermatogonias (H: 6 953; Hc: 6 959; P < 0.05) y las células de Sertoli (H: 9.89; Hc: 10.31; P < 0.05) fue significativamente menor en los grupos experimentales Tx y SO en comparación con el grupo control. No se observaron diferencias en el número de células de Leydig (H: 1.33; Hc: 1.33; P < 0.5). Comparado con el grupo control, los machos tratados con SO mostraron mayor reducción en el número de espermatocitos (H: 12.21; Hc: 12.22 P < 0.05) y espermátides elongadas (H: 11.62; Hc: 11.64; P < 0.05), seguido de los machos tratados con tamoxifeno.

Cuadro 3 Conteo celular en testículos de ratas de 90-días de edad tratadas con tamoxifeno y/o aceite de soya una hora posnacimiento (promedio ± EE). 

Alteraciones testiculares inducidas por tratamientos con Tx y/o SO. Distinto superíndice en cada línea indica diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05).

Como se observa en la Figura 1, los testículos del grupo control (A-B) mostraron evidencia de túbulos seminíferos con espermatogénesis normal. El grupo tratado con SO (C-D) mostró vacuolización en los túbulos seminíferos, destrucción del epitelio germinal, reducción del número de células germinales y de células de Sertoli; además, incrementó el espacio intertubular y la desagrupación de las células de Leydig. Estas alteraciones también se encontraron en los animales tratados con Tx, que además mostraron túbulos con reducción significativa en el diámetro y el área tubular, así como un espacio intertubular más amplio que en el grupo SO y, control.

Figura 1 Secciones histológicas representativas de los testículos, teñidas con hematoxilina-eosina, colectadas del grupo de control (A y B); de ratas tratadas con SO (C y D), y con Tx (E y F). A, C y E, 200X. B, D y F, 400X. T: túbulo. LC: células de Leydig. Se pueden observar los cambios histológicos inducidos por los tratamientos con Tx y/o SO. Las flechas negras señalan mayor espacio intertubular. Las flechas blancas en E y F señalan la desagrupación de las LC. Los asteriscos señalan vacuolas presentes en los túbulos seminíferos. 

Los resultados revelaron que, durante el periodo crítico de diferenciación sexual del hipotálamo, una sola administración de Tx y SO reduce tanto el peso corporal como el peso testicular, y altera la histomorfología gonadal y la espermatogénesis en ratas adultas. En este experimento, aunque no se midió la concentración de hormonas circulantes, el efecto sobre la ganancia de peso a los 90 días en los animales tratados, es un indicativo de la insuficiente estimulación de la testosterona.

A pesar de que el tratamiento no afecto la cantidad de células de Leydig, es importante señalar que el ambiente edematoso y la dispersión de las células en el espacio intertubular en los animales tratados, así como la posible falta de dispersión en la estimulación de las gonadotropinas, pudo reducir la producción de testosterona. La disrupción en la secreción normal de gonadotropinas (y por lo tanto de testosterona) debido al inadecuado control hipotalámico causado por los tratamientos, podría explicar el bajo número de células de Sertoli, que constituyen la base estructural de la barrera hemato-testicular (^{Yu-hua et al. 2015}) y proveen el soporte para la espermatogénesis. La reducción de FSH y testosterona en los túbulos podría afectar la función de las células de Sertoli y la producción de estrógenos, lo cual es congruente con la reducción observada en el número de células germinales, muy probablemente originada por el aumento de apoptosis en un entorno con vacuolización y edema tubular.

El testículo de mamífero se caracteriza por la síntesis de hormonas esteroides y la producción de espermatozoides (^{Carreau et al. 2006}). Las hormonas gonadotropinas y la testosterona controlan principalmente el desarrollo testicular y el mantenimiento de la espermatogénesis (^{Carreau et al. 1999}). Los factores locales modulan el efecto sobre estas hormonas, uno de estos factores es el estrógeno, esencial para el mantenimiento del tracto reproductivo en los machos (^{Carreau et al. 2003}).

Los estrógenos se sintetizan en las células de Leydig (^{Abney, 1999}), en las células de Sertoli, y en las espermátides, tanto en las redondas como en las alongadas (^{Hess et al. 2001}; ^{Saunders et al. 2005}; ^{Lambard et al. 2005}). En todas estas células, la existencia de receptores específicos a estrógenos alfa (ERα) y beta (ERβ) sugieren un efecto paracrino y autocrino del estradiol (^{Carreau et al. 2002}; ^{Scobie et al. 2002}). Los estrógenos actúan como factores de sobrevivencia en las células germinales (^{Carreau et al. 2003}).

Se ha demostrado que se requiere la enzima P450 aromatasa para la maduración de los espermatozoides y la regulación de los mecanismos de absorción de líquidos en los conductos eferentes (^{Lambard et al. 2005}). En ausencia de receptores a estrógenos, la absorción de líquidos en estos conductos, en la rete testis y en los túbulos seminíferos se reduce (^{Hess et al. 2000}), y se acumula en los testículos, causando daño en el epitelio germinal y alterando el desarrollo espermático y la fertilidad (^{Hess et al. 2001}) como se observó en esta investigación. Esto sugiere que los tratamientos afectan los mecanismos implicados en la acción estrogénica, necesarios para la función testicular normal.

En condiciones fisiológicas, los estrógenos juegan un papel importante en el desarrollo normal de la estructura y la función de los testículos, y del tracto reproductor masculino. En el testículo, los estrógenos dependen de la disponibilidad de los andrógenos para su síntesis; sin embargo, bajo condiciones experimentales, la administración neonatal de sustancias estrogénicas exógenas vía oral, en el alimento o el agua, reduce el número de espermatozoides, la testosterona plasmática y el número de células de Sertoli (^{Goyal et al. 2003}; ^{Sharpe et al. 2003}; ^{Atanossova et al. 2005}). En ratas postpuberales, ^{Assinder et al. (2007)} reportaron que los machos destetados y alimentados durante 24 días con una dieta alta en fitoestrógenos, mostraron un aumento en la apoptosis de las células germinales, una reducción en los recuentos espermáticos y un aumento del lumen en los túbulos seminíferos, sin aparente implicación del eje hipotálamo-hipófisis-testículo, sino de los efectos paracrinos y autocrinos de los estrógenos en el testículo.

Es sabido que la soya y sus derivados son fuente de isoflavonas, una clase particular de fitoestrógenos que pueden interactuar en las vías de señalización del estrógeno endógeno (^{Cederroth et al. 2012}). Estudios anteriores han demostrado que, durante los periodos críticos del desarrollo, la exposición a fitoestrógeno induce efectos morfológicos y fisiológicos adversos sobre la diferenciación sexual masculina en ratones (^{Roberts et al. 2000}; ^{Wisniewski et al. 2003}). ^{Levy y sus colaboradores (1995)} reportaron que el tratamiento con genisteína (derivado de la soya) reduce el peso corporal en machos y hembras, la distancia ano-genital al nacimiento en machos, y retrasa el inicio de la pubertad en hembras.

Estos resultados fueron confirmados por ^{Wisniewski y sus colegas (2005)}, quienes también observaron trastornos de conducta y de fenotipo en ratones macho hijos de madres alimentadas con 5 ó 300 mg de genisteína/kg de peso corporal durante la gestación y la lactancia. A los 21 días después del nacimiento, las crías exhibieron desmasculinización permanente; reducción de células espermáticas, de testosterona y de comportamiento agresivo, así como un aumento en el comportamiento defensivo.

En nuestro estudio, la vacuolización, la disminución de la altura del epitelio germinal y el aumento del espacio intertubular constituyen hallazgos importantes. Otros investigadores, como Pérez-Rivero y sus colegas (2009 y 2014) han reportado previamente estos cambios en los perros y en los murciélagos vampiro alimentados con dietas ricas en fitoestrógenos (cumestrol). Estas observaciones son compatibles con las de nuestro experimento, pero están asociadas con una sola inyección SC de aceite de soya.

La administración de tamoxifeno durante la etapa perinatal bloquea la interacción de estradiol con su receptor en el hipotálamo e inhibe a la enzima aromatasa (^{Döhler et al. 1985}), necesaria para masculinizar los circuitos neuronales que modulan el comportamiento y la secreción de gonadotropinas, circuitos típicos de los machos en la edad adulta. El Tx induce estrés oxidativo y apoptosis en los espermatozoides del ratón albino, anormalidades morfológicas -formación de aductos de ADN-(^{Padmalatha et al. 2001}) y distorsión de los túbulos seminíferos con desprendimiento de células germinales. En ratas macho adultas, el Tx (200, 400 u 800 mg/kg de peso corporal) genera células gigantes multinucleadas (^{D’Souza 2003}) y reducción de la fertilidad (^{Balasinor et al. 2001}; ^{Gill-Sharma 1993}).

Se sabe que Tx puede actuar como un antagonista o un agonista de estrógenos en el eje reproductivo de la rata (^{Bellido et al. 2003}), y que el SO puede ser una fuente de fitoestrógenos. En este estudio, ambas sustancias se administraron en la primera hora después del nacimiento de las crías, cerca del momento crítico de la diferenciación sexual del hipotálamo; por lo tanto, los cambios morfológicos observados en los testículos se podrían atribuir a los efectos de los tratamientos sobre los núcleos hipotalámicos que controlan la secreción tónica de las gonadotropinas, con un efecto adicional sobre la esteroidogénesis testicular. El papel de la testosterona en la función testicular y la espermatogénesis está bien documentado. Sin embargo, es importante mencionar que en los modelos de administración de fitoestrógenos de soya en roedores adultos, la interrupción de la función testicular puede ser independiente de las concentraciones circulantes de gonadotropinas y testosterona.

Conclusión

Esta comunicación documenta los cambios irreversibles en la función y la histomorfología testicular de ratas adultas causados por el tratamiento agudo único de tamoxifeno o aceite de soya una hora después del nacimiento de las ratas. Estos cambios pueden estar asociados con la interrupción del curso normal de la diferenciación sexual del hipotálamo durante el llamado periodo crítico de este proceso.