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Veterinaria México OA

On-line version ISSN 2448-6760

Veterinaria México OA vol.3 n.2 México Apr./Jun. 2016

http://dx.doi.org/10.21753/vmoa.3.2.364 

Artículos científicos

Administración neonatal única de aceite de soya y/o tamoxifeno afecta permanentemente a la histomorfología testicular en ratas adultas

Alicia González-González1 

Everardo González-Padilla1 

Francisco Fierro2 

Ma. De Lourdes Juarez-Mosqueda3 

Juan José Perez-Rivero4 

Clara Ortega-Camarillo5 
http://orcid.org/0000-0001-8709-6727

Mónica Salas-Rojas6 
http://orcid.org/0000-0001-7046-0967

Marcela Vergara Onofre4  * 

1Departamento de Reproducción Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM Ciudad Universitaria. Del. Coyoacán CP. 04510 Ciudad de México.

2Departamento de Biotecnología Universidad Autónoma Metropolitana-Unidad Iztapalapa. Av. San Rafael Atlixco 186 Col. Vicentina. 19340 Del. Iztapalapa Ciudad de México.

3Departamento de Morfología Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM. Ciudad Universitaria Del. Coyoacán CP. 04510 Ciudad de México.

4Departamento de Producción Agrícola y Animal Universidad Autónoma Metropolitana-Unidad Xochimilco. Calzada del Hueso 1100 Col. Villa quietud CP. 04960 Del. Xochimilco Ciudad de México.

5Unidad de Investigación Médica en Bioquímica Hospital de Especialidades Centro Médico Nacional Siglo XXI Instituto Mexicano del Seguro Social Av. Cuauhtémoc 330 Col. Doctores CP. 06720 Del Cuauhtémoc. Ciudad de México.

6Unidad de Investigación Médica en Inmunología Hospital de Pediatría Centro Médico Nacional Siglo XXI Instituto Mexicano del Seguro Social México. Av. Cuauhtémoc 330 Col. Doctores CP. 06720 Del Cuauhtémoc. Ciudad de México.

Resumen

El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la administración de tamoxifeno (Tx) y aceite de soya (SO) durante el periodo crítico de la diferenciación sexual hipotalámica en ratas macho recién nacidas, en el contexto de la histomorfología gonadal durante la edad adulta. Los animales se dividieron al azar en tres grupos (n = 5 cada uno). Una hora después del nacimiento, un grupo fue tratado por vía subcutánea con 200 μg de Tx y 20 μL de SO comercial como vehículo; mientras otro grupo fue tratado solo con 20 μL de SO, y el grupo control no recibió ningún tratamiento. Todas las ratas se pesaron y sacrificaron por dislocación cervical a los 90 días postratamiento. Se extrajeron los testículos, se pesaron y procesaron para la evaluación histológica. La administración única de Tx y de SO durante el periodo crítico de la diferenciación sexual del hipotálamo altera de forma permanente la histomorfología testicular, la espermatogénesis y el peso corporal en la edad adulta. Las alteraciones incluyen: vacuolización, reducción del número de espermatogonias y de células de Sertoli. La administración de Tx redujo el peso testicular, el diámetro y el área de los túbulos seminíferos, así como la altura del epitelio germinal, e incrementó el espacio intertubular. El SO redujo el número de espermatocitos y espermátides, incluso más que el Tx. No se afectó el número de células de Leydig. La posibilidad de que el aceite de soya actúe como disruptor endócrino, amerita más atención y abre la posibilidad para el desarrollo de nuevos métodos de control de plagas.

Palabras clave: disruptores endócrinos; tamoxifeno; aceite de soya; diferenciación sexual del hipotálamo; morfología testicular

Introducción

Durante el desarrollo de la rata, en el periodo crítico de la diferenciación sexual a nivel cerebral, el cerebro de estos roedores macho está expuesto a altos niveles de testosterona de origen testicular, los cuales se incrementan a finales de la gestación, principalmente dos horas después del nacimiento (Anne et al. 2011). En las neuronas, la testosterona se convierte a estrógenos mediante la intervención de la enzima P450 aromatasa. Los estrógenos pueden actuar en dos etapas: en la fase de “organización” durante los periodos prenatal y postnatal temprano, y en la fase de “activación” en la edad adulta (Phoenix et al. 1959). El efecto del estradiol en la fase organizacional induce la diferenciación sexual del hipotálamo (Lauber et al. 1997) y regula activamente los circuitos neuronales (Barraclough 1966; Simerly et al. 2002), responsables de la secreción tónica de gonadotropinas (Finkelstein et al. 1991; Bagatell et al. 1994) y el comportamiento reproductivo característico de los machos (Lauber et al. 1997; Simerly 2002). Los estrógenos también participan en la espermatogénesis y en la maduración espermática en el epidídimo (Balasinor et al. 2001).

La exposición a disruptores endócrinos (EDCs, por sus siglas en inglés, endocrine-disrupting chemicals, de origen natural o sintético) exógenos que imitan o bloquean el efecto endógeno de las hormonas esteroides sexuales (Wilson et al. 2007) pueden enviar mensajes contradictorios al cuerpo, y provocar anormalidades en el desarrollo biológico con efectos irreversibles.

El papel de los estrógenos en la reproducción sexual se ha confirmado mediante el uso de antiestrógenos como el tamoxifeno (Tx; Z-1-[4-(2-dimethylamino-ethoxy)-phenyl]-1, 2-diphenyl-1-butane) (Barraclough 1967; Dörner 1968; Döhler et al. 1984), un fármaco sintético comúnmente utilizado en el tratamiento de cáncer de mama. Su mecanismo de acción aún no es claro, pero se sabe que ejerce diversos efectos biológicos, actúa como un completo agonista o antagonista según la dosis, el órgano blanco, el sexo y la especie (Gill-Sharma et al. 1993; Furr et al. 1984; Macnab,1984). Además del tamoxifeno existen otros químicos que alteran el ambiente hormonal y afectan el crecimiento, el desarrollo y el comportamiento sexual.

En ratones macho, el Tx perjudica el desarrollo de los testículos y las glándulas accesorias después de la administración neonatal (24 horas postnacimiento; 20 o 100 µg/día durante cinco días; Iguchi, 1986), y genera infertilidad (Taguchi 1987). El Tx impide la interacción del estradiol con su receptor en el hipotálamo, además de inhibir la enzima aromatasa, lo que conduce a la feminización cerebral (Döhler et al. 1985). En ratas adultas, Gill-Sharma (1993) y Nafisa Balasinor (2002) reportaron un efecto irreversible del Tx sobre el eje hipotálamo-hipófisis (observaron una reducción-dosis dependiente en la fertilidad debido a la pérdida de embriones en hembras apareadas con ratas macho tratadas con Tx).

En nuestro grupo, Herrera et al, (2013) encontraron que en ratas, una sola dosis subcutánea (sc) de Tx (200 µg), aplicada una hora después del nacimiento, modifica la expresión de ciertos genes hipotalámicos. Para avanzar en estos estudios, diseñamos un experimento donde se determinó la expresión de 11 genes específicos en el hipotálamo de ratas macho dentro de las primeras seis horas después del tratamiento con: 1) Tx disuelto en SO, 2) SO y 3) grupo control, a una hora posnacimiento.

Algunos de los animales se pesaron cada semana, se sacrificaron a los 90 días de edad, y se les extrajeron los testículos, se pesaron y se sometieron a análisis histológico. Las observaciones de los cambios en la morfología testicular en estos animales se presentan en esta comunicación.

Materiales y métodos

Animales

Los animales se obtuvieron de la Unidad de Producción y Experimentación de Animales de Laboratorio (UPEAL) de la Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco, y se alojaron en esta Unidad, bajo un ambiente controlado (21 °C) con ciclos invertidos de 12 horas de luz-oscuridad (luces apagadas a las 4:00 AM) así como alimento (Rodent Diet 5001, LabDiet) y agua ad libitum.

Nueve ratas Wistar (seis hembras y tres machos) se utilizaron como reproductores. Los machos eran ratas de 90 días de edad con un peso superior a 400 g. Su capacidad reproductiva se evaluó mediante el comportamiento copulatorio, la presencia de tapón seminal en las hembras después de la cópula y la confirmación de la gestación.

Las ratas hembra tenían 60 días de edad con un peso mayor a 200 g. Se monitoreo diariamente su ciclo estral mediante citología vaginal por un mínimo de tres ciclos para confirmar la normalidad endócrino-reproductiva. Las ratas en estro se colocaron en una jaula con un macho para permitir una primera gestación y corroborar la capacidad reproductiva. Después de la primera camada, se llevó a cabo una segunda selección de acuerdo con el comportamiento materno observado. Finalmente, solo se seleccionaron ratas con ciclo estral, gestación y camadas normales, así como un comportamiento materno adecuado.

Dos semanas después del primer parto, se realizó de nuevo el seguimiento del ciclo estral. Una hembra y un macho se colocaron una vez más en una jaula durante tres horas. El inicio de la gestación se verificó por la presencia de espermatozoides mediante citología vaginal y por la formación de tapón seminal. Las ratas gestantes fueron alojadas en jaulas bajo las condiciones antes descritas. Como nuestro principal objetivo fue analizar el efecto de la administración temprana (una hora después del nacimiento) del Tx y su vehículo (SO) sobre la morfología microscópica testicular en ratas adultas, fue necesario un estricto control del tiempo de fertilización y el monitoreo constante de las madres, principalmente al final de la gestación para identificar la hora exacta de nacimiento.

El momento del nacimiento de cada animal se consideró como hora cero. A los machos recién nacidos se les separó de su madre para formar tres grupos de cinco animales cada uno. Una hora después del nacimiento se administró el tratamiento: un grupo fue tratado por vía subcutánea con 200 μg de Tx de una marca comercial (Sigma-Aldrich- Sigma-Aldrich Corporate Offices, 3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103, USA) diluido en SO (20 μL); otro grupo fue tratado sólo con 20 μL de SO por la misma vía, y el grupo control que no recibió tratamiento alguno. El Tx se aplicó con la finalidad de inducir feminización del cerebro. El SO sólo se administró para evitar confundir los efectos del tratamiento con los de su vehículo. A las ratas tratadas se les regresó con sus madres hasta el destete (21 días) y, después, se alimentaron de la misma manera que los otros animales.

Colección y procesamiento de las muestras

Todas las ratas se pesaron cada semana hasta los 90 días postratamiento y se sacrificaron por dislocación cervical. De inmediato, los testículos se les retiraron en bloque y se disecaron bajo un microscopio estereoscópico, se pesaron en una balanza analítica, se prefundieron y se fijaron en solución Bouin durante ocho horas. Subsecuentemente se deshidrataron en series descendentes de alcohol etílico, se aclararon en xileno y se incluyeron en parafina para realizar cortes transversales (cinco micras) en un micrótomo rotatorio (Leica RM2125 RT). Finalmente, se tiñeron con hematoxilina-eosina para hacer las evaluaciones morfométricas, y los cortes transversales de los testículos se observaron bajo el microscopio.

Evaluación morfológica

Solo se digitalizaron túbulos redondos, 10 túbulos por cada testículo (20 túbulos por cada rata), que se analizaron en campos de amplificación 20X y 40X. Las mediciones del diámetro, área, altura del epitelio germinal y del espacio intersticial se realizaron a partir de secciones digitalizadas con el software LSM5 (Carl Zeiss, Alemania) con las herramientas de marcado.

Una vez fotografiadas las secciones transversales, se identificó el estadio tubular y el conteo celular mediante el método de morfología tubular (Berndtson 1977; Hess 2007), basado en la forma de los núcleos de las espermátides, la aparición de divisiones meióticas, y la posición de espermátides en el epitelio seminífero (Farias et al. 2014). Tres morfólogos veterinarios analizaron todas las laminillas y los resultados individuales se promediaron para este reporte.

Análisis estadístico

Mediante la prueba de Shapiro Wilks se determinó la normalidad de los datos en los diferentes parámetros estudiados. Según la distribución normal obtenida, los datos se evaluaron o con la prueba de Kruskall-Wallis (morfología y conteo celular), o con ANOVA (peso corporal y testicular). Los resultados se expresan como valores promedio ±EE (error estándar) y los valores promedio ±DE (desviación estándar) respectivamente. Los valores del peso corporal y el peso testicular se obtuvieron de cinco animales por grupo, de quienes se tomaron 10 túbulos al azar de cada testículo. La estadística se calculó con el Software PAST (Paleontological Statistics, Paquete de Educación y Análisis de Datos (Huang et al. 2013)

Resultados y discusión

Los resultados del peso testicular y el peso corporal a los 90 días postratamiento se muestran en el Cuadro 1. El promedio del peso testicular fue significativamente más bajo en los animales tratados con Tx, que en los grupos: control y el tratado solo con SO (F: 47.19; grados de libertad entre grupos: 2; grados de libertad dentro de los grupos: 12; P < 0.001).

Cuadro 1 Promedio ± DE del peso corporal y testicular a los 90 días. 

Peso corporal y testicular de ratas de 90-días de edad. Distinto superíndice en cada línea indica diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05).

El promedio del peso corporal a los 90 días fue menor en los animales tratados con Tx seguido del grupo tratado con SO, mientras que los animales del grupo control obtuvieron un peso mayor (F: 16.67; grados de libertad entre grupos: 2; grados de libertad dentro de los grupos: 12; P < 0.001). Solo los animales tratados con Tx mostraron una reducción significativa en el diámetro tubular (H: 12.88; Hc: 13.00; P < 0.005), el área tubular (H: 9.85; Hc: 9.85; P < 0.05) y la altura del epitelio germinal (H: 27.04; Hc: 27.05; P < 0.001) (Cuadro 2). En comparación con el grupo control, el espacio intertubular fue mayor en los animales tratados con Tx seguido de los tratados con SO.

Cuadro 2 Morfometría testicular de ratas macho de 90 días de edad tratadas con tamoxifeno y SO una hora posnacimiento (promedio ± EE) 

Alteraciones testiculares inducidas por tratamientos con Tx y/o SO. Distinto superíndice en cada línea indica diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05).

El promedio del conteo celular por túbulo se muestra en el Cuadro 3. El número de espermatogonias (H: 6 953; Hc: 6 959; P < 0.05) y las células de Sertoli (H: 9.89; Hc: 10.31; P < 0.05) fue significativamente menor en los grupos experimentales Tx y SO en comparación con el grupo control. No se observaron diferencias en el número de células de Leydig (H: 1.33; Hc: 1.33; P < 0.5). Comparado con el grupo control, los machos tratados con SO mostraron mayor reducción en el número de espermatocitos (H: 12.21; Hc: 12.22 P < 0.05) y espermátides elongadas (H: 11.62; Hc: 11.64; P < 0.05), seguido de los machos tratados con tamoxifeno.

Cuadro 3 Conteo celular en testículos de ratas de 90-días de edad tratadas con tamoxifeno y/o aceite de soya una hora posnacimiento (promedio ± EE). 

Alteraciones testiculares inducidas por tratamientos con Tx y/o SO. Distinto superíndice en cada línea indica diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05).

Como se observa en la Figura 1, los testículos del grupo control (A-B) mostraron evidencia de túbulos seminíferos con espermatogénesis normal. El grupo tratado con SO (C-D) mostró vacuolización en los túbulos seminíferos, destrucción del epitelio germinal, reducción del número de células germinales y de células de Sertoli; además, incrementó el espacio intertubular y la desagrupación de las células de Leydig. Estas alteraciones también se encontraron en los animales tratados con Tx, que además mostraron túbulos con reducción significativa en el diámetro y el área tubular, así como un espacio intertubular más amplio que en el grupo SO y, control.

Figura 1 Secciones histológicas representativas de los testículos, teñidas con hematoxilina-eosina, colectadas del grupo de control (A y B); de ratas tratadas con SO (C y D), y con Tx (E y F). A, C y E, 200X. B, D y F, 400X. T: túbulo. LC: células de Leydig. Se pueden observar los cambios histológicos inducidos por los tratamientos con Tx y/o SO. Las flechas negras señalan mayor espacio intertubular. Las flechas blancas en E y F señalan la desagrupación de las LC. Los asteriscos señalan vacuolas presentes en los túbulos seminíferos. 

Los resultados revelaron que, durante el periodo crítico de diferenciación sexual del hipotálamo, una sola administración de Tx y SO reduce tanto el peso corporal como el peso testicular, y altera la histomorfología gonadal y la espermatogénesis en ratas adultas. En este experimento, aunque no se midió la concentración de hormonas circulantes, el efecto sobre la ganancia de peso a los 90 días en los animales tratados, es un indicativo de la insuficiente estimulación de la testosterona.

A pesar de que el tratamiento no afecto la cantidad de células de Leydig, es importante señalar que el ambiente edematoso y la dispersión de las células en el espacio intertubular en los animales tratados, así como la posible falta de dispersión en la estimulación de las gonadotropinas, pudo reducir la producción de testosterona. La disrupción en la secreción normal de gonadotropinas (y por lo tanto de testosterona) debido al inadecuado control hipotalámico causado por los tratamientos, podría explicar el bajo número de células de Sertoli, que constituyen la base estructural de la barrera hemato-testicular (Yu-hua et al. 2015) y proveen el soporte para la espermatogénesis. La reducción de FSH y testosterona en los túbulos podría afectar la función de las células de Sertoli y la producción de estrógenos, lo cual es congruente con la reducción observada en el número de células germinales, muy probablemente originada por el aumento de apoptosis en un entorno con vacuolización y edema tubular.

El testículo de mamífero se caracteriza por la síntesis de hormonas esteroides y la producción de espermatozoides (Carreau et al. 2006). Las hormonas gonadotropinas y la testosterona controlan principalmente el desarrollo testicular y el mantenimiento de la espermatogénesis (Carreau et al. 1999). Los factores locales modulan el efecto sobre estas hormonas, uno de estos factores es el estrógeno, esencial para el mantenimiento del tracto reproductivo en los machos (Carreau et al. 2003).

Los estrógenos se sintetizan en las células de Leydig (Abney, 1999), en las células de Sertoli, y en las espermátides, tanto en las redondas como en las alongadas (Hess et al. 2001; Saunders et al. 2005; Lambard et al. 2005). En todas estas células, la existencia de receptores específicos a estrógenos alfa (ERα) y beta (ERβ) sugieren un efecto paracrino y autocrino del estradiol (Carreau et al. 2002; Scobie et al. 2002). Los estrógenos actúan como factores de sobrevivencia en las células germinales (Carreau et al. 2003).

Se ha demostrado que se requiere la enzima P450 aromatasa para la maduración de los espermatozoides y la regulación de los mecanismos de absorción de líquidos en los conductos eferentes (Lambard et al. 2005). En ausencia de receptores a estrógenos, la absorción de líquidos en estos conductos, en la rete testis y en los túbulos seminíferos se reduce (Hess et al. 2000), y se acumula en los testículos, causando daño en el epitelio germinal y alterando el desarrollo espermático y la fertilidad (Hess et al. 2001) como se observó en esta investigación. Esto sugiere que los tratamientos afectan los mecanismos implicados en la acción estrogénica, necesarios para la función testicular normal.

En condiciones fisiológicas, los estrógenos juegan un papel importante en el desarrollo normal de la estructura y la función de los testículos, y del tracto reproductor masculino. En el testículo, los estrógenos dependen de la disponibilidad de los andrógenos para su síntesis; sin embargo, bajo condiciones experimentales, la administración neonatal de sustancias estrogénicas exógenas vía oral, en el alimento o el agua, reduce el número de espermatozoides, la testosterona plasmática y el número de células de Sertoli (Goyal et al. 2003; Sharpe et al. 2003; Atanossova et al. 2005). En ratas postpuberales, Assinder et al. (2007) reportaron que los machos destetados y alimentados durante 24 días con una dieta alta en fitoestrógenos, mostraron un aumento en la apoptosis de las células germinales, una reducción en los recuentos espermáticos y un aumento del lumen en los túbulos seminíferos, sin aparente implicación del eje hipotálamo-hipófisis-testículo, sino de los efectos paracrinos y autocrinos de los estrógenos en el testículo.

Es sabido que la soya y sus derivados son fuente de isoflavonas, una clase particular de fitoestrógenos que pueden interactuar en las vías de señalización del estrógeno endógeno (Cederroth et al. 2012). Estudios anteriores han demostrado que, durante los periodos críticos del desarrollo, la exposición a fitoestrógeno induce efectos morfológicos y fisiológicos adversos sobre la diferenciación sexual masculina en ratones (Roberts et al. 2000; Wisniewski et al. 2003). Levy y sus colaboradores (1995) reportaron que el tratamiento con genisteína (derivado de la soya) reduce el peso corporal en machos y hembras, la distancia ano-genital al nacimiento en machos, y retrasa el inicio de la pubertad en hembras.

Estos resultados fueron confirmados por Wisniewski y sus colegas (2005), quienes también observaron trastornos de conducta y de fenotipo en ratones macho hijos de madres alimentadas con 5 ó 300 mg de genisteína/kg de peso corporal durante la gestación y la lactancia. A los 21 días después del nacimiento, las crías exhibieron desmasculinización permanente; reducción de células espermáticas, de testosterona y de comportamiento agresivo, así como un aumento en el comportamiento defensivo.

En nuestro estudio, la vacuolización, la disminución de la altura del epitelio germinal y el aumento del espacio intertubular constituyen hallazgos importantes. Otros investigadores, como Pérez-Rivero y sus colegas (2009 y 2014) han reportado previamente estos cambios en los perros y en los murciélagos vampiro alimentados con dietas ricas en fitoestrógenos (cumestrol). Estas observaciones son compatibles con las de nuestro experimento, pero están asociadas con una sola inyección SC de aceite de soya.

La administración de tamoxifeno durante la etapa perinatal bloquea la interacción de estradiol con su receptor en el hipotálamo e inhibe a la enzima aromatasa (Döhler et al. 1985), necesaria para masculinizar los circuitos neuronales que modulan el comportamiento y la secreción de gonadotropinas, circuitos típicos de los machos en la edad adulta. El Tx induce estrés oxidativo y apoptosis en los espermatozoides del ratón albino, anormalidades morfológicas -formación de aductos de ADN-(Padmalatha et al. 2001) y distorsión de los túbulos seminíferos con desprendimiento de células germinales. En ratas macho adultas, el Tx (200, 400 u 800 mg/kg de peso corporal) genera células gigantes multinucleadas (D’Souza 2003) y reducción de la fertilidad (Balasinor et al. 2001; Gill-Sharma 1993).

Se sabe que Tx puede actuar como un antagonista o un agonista de estrógenos en el eje reproductivo de la rata (Bellido et al. 2003), y que el SO puede ser una fuente de fitoestrógenos. En este estudio, ambas sustancias se administraron en la primera hora después del nacimiento de las crías, cerca del momento crítico de la diferenciación sexual del hipotálamo; por lo tanto, los cambios morfológicos observados en los testículos se podrían atribuir a los efectos de los tratamientos sobre los núcleos hipotalámicos que controlan la secreción tónica de las gonadotropinas, con un efecto adicional sobre la esteroidogénesis testicular. El papel de la testosterona en la función testicular y la espermatogénesis está bien documentado. Sin embargo, es importante mencionar que en los modelos de administración de fitoestrógenos de soya en roedores adultos, la interrupción de la función testicular puede ser independiente de las concentraciones circulantes de gonadotropinas y testosterona.

Conclusión

Esta comunicación documenta los cambios irreversibles en la función y la histomorfología testicular de ratas adultas causados por el tratamiento agudo único de tamoxifeno o aceite de soya una hora después del nacimiento de las ratas. Estos cambios pueden estar asociados con la interrupción del curso normal de la diferenciación sexual del hipotálamo durante el llamado periodo crítico de este proceso.

Financiamiento

Este proyecto fue parcialmente financiado por el CONACYT, subvención 105961-M, ANUIES-ECOS-CONACYT, subvención M10-A02, y CONACYT, beca 201677.

REFERENCIAS

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Agradecimientos

Los autores agradecen a Beatriz Márquez Cruz y Pablo Sánchez Peña del Laboratorio de Patología (Zonas: Hospital General 47 y 1A, respectivamente, Instituto Mexicano del Seguro Social) por su apoyo técnico. Al Comité Interno para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de UAMX por aprobar los procedimientos realizados en los animales.

Recibido: 10 de Febrero de 2016; Aprobado: 08 de Junio de 2016

Los autores declaran que no existe conflicto de interés alguno.

Alicia González-González, en el desarrollo experimental y el análisis de resultados. Everardo González-Padilla, en la discusión y el análisis de los resultados. Francisco Fierro, en el análisis de los resultados. Mónica Salas-Rojas, en el análisis morfométrico. Ma. De Lourdes Juárez-Mosqueda, en el procesamiento de las muestras. Juan José Pérez-Rivero, en el análisis morfométrico y estadístico. Clara Ortega-Camarillo y Marcela Vergara Onofre, en el diseño experimental y el suministro de materiales.

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