Materiales biológicos

El protocolo para el uso de animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Experimentación (CICUAE) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ) de la Universidad Nacional Autónoma de México, además de seguirse los lineamientos del Parque Eco-arqueológico Xcaret.

Por tratarse de una especie amenazada, el estudio se desarrolló con tortugas caguama, muertas, en concordancia con las recomendaciones señaladas por el CICUAE. En el trabajo de campo colaboró la Coordinación de Tortugas Marinas y Manatís del Parque Ecoarqueológico Xcaret, localizado en Quintana Roo, México, a los 21°09'17'' N y 86°50'56'' O.

En el trabajo de campo, llevado a cabo de junio a julio de 2010, se practicaron diversas necropsias; sin embargo, solo en 4 individuos se cumplieron las características deseadas para esta investigación (n = 4), pues se consideró que el tiempo entre la muerte y la fijación fuera menor a una hora y que no existieran alteraciones macroscópicas. Los especímenes utilizados se incubaron en nidos artificiales dentro del acuario de Xcaret y se hallaron muertos después de la eclosión. Al examen post mórtem, no se observaron lesiones macroscópicas. Durante la necropsia, el ID de cada tortuga se dividió exactamente por la mitad. Se obtuvieron dos porciones: craneal (duodeno) y caudal (yeyuno/íleon), debido a la dificultad de distinguir macroscópicamente entre los segmentos intestinales, tal como lo reporta ^{Magalhaes (2012)}. El tiempo transcurrido entre la muerte y la fijación fue alrededor de 30 minutos.

Procesamiento histológico

Las muestras se fijaron durante 48 horas en Z-Fix® (Anatech Ltd., MI, USA), una solución tamponada de zinc-formalina. Después se procesaron por el método de inclusión en parafina Paraplast® ("R", McCormick Scientific® IL, USA) mediante un histoquinette (American Optical® T/P 8000): las muestras se cortaron con un micrótomo (Leica® RM 2125 RT) en láminas de 4 µm de grosor; se adhirieron a portaobjetos, desparafinados en xilol (5 minutos en dos ocasiones); se rehidrataron con soluciones decrecientes de etanol (100%-95%, 5 minutos en dos ocasiones), y se lavaron en solución tamponada de fosfatos (PBS) por 5 minutos.

Para el análisis histológico básico se manejaron las siguientes técnicas: hematoxilina y eosina (HE) y tricrómica de Gomori (TG) (^{García del Moral, 1993}). Mientras que para el estudio histoquímico se hicieron tinciones especiales (^{Pearse, 1960}, ^{García Del Moral, 1993}, ^{Prophet et al., 1995}), como la técnica del ácido peryódico-reactivo de Schiff (PAS), Giemsa, azul de toluidina (AT) a pH 4.5 y pH 3.5, azul alciano (AA) 8GX a pH 1.0 y pH 2.5, PAS/AA (AA 8GX pH 2.5/ácido peryódico-reactivo de Schiff), hierro coloidal, azul de Perls, metenamina de plata (MP), impregnación de Wilder (IW) (^{Prophet et al, 1995}), Grimelius y Masson-Fontana (M-F). Para el montaje se utilizó Permanent Mounting Medium (VectaMount® H-5000 CA, USA). La intensidad de la tinción se percibió visualmente bajo los siguientes parámetros: (-) sin tinción, (+-) intensidad muy débil, (+) intensidad débil, (++) intensidad media, (+++) intensidad fuerte y (y-M) gam a-metacromasia (García del Moral, 1993).

Procesamiento de imágenes

Las fotomicrografías se tomaron con un microscopio Carl Zeiss® (Primo Star®, Göttingen, Germany) conectado a una cámara digital Moticam 5® (Motic®, Xiamen, China). Para las mediciones se empleó el software Motic Image Plus® software (Motic®, Version 2.0, Xiamen, China).

Nomenclatura

La nomenclatura utilizada está adecuada a la Nómina Anatómica Veterinaria quinta edición (^{ICVGAN, 2012}).

Resultados de histología

La mucosa consiste en el epitelio de revestimiento, lámina propia y la muscular de la mucosa. El epitelio de revestimiento en el TGI de las tortugas caguama es pseudoestratificado cilíndrico con células caliciformes intercaladas (CC), que se notan en mayor número en la porción craneal (Figuras 1C, 1D, 1G y 1H). Se observó que las CC de esta porción tienen forma alargada típica, como un cáliz, en contraste con la porción caudal, donde son redondeadas y de menor tamaño.

Figura 1 Características histológicas del intestino delgado. A, B, C, E, F y G: Tinción tricrómica de Gomori. D y H: Tinción hematoxilina y eosina. Epitelio de revestimiento (E), mucosa (M), submucosa (Sb), músculo liso (SM), tunica muscularis (TM), serosa (S), células caliciforme (flecha), borde estriado (BB), vaso sanguíneo (BV), vaso linfático (LV), endotelio (En), plexo mientérico (PM) y lumen (*). Barra: A y E) 100 µm; B, C, D, F y G) 30 µm. 

Los enterocitos (células epiteliales) presentaron un borde estriado (Figuras 1C, 1D, 1G y 1H); además, en ellos se advirtieron vasos sanguíneos abundantes en la lámina propia (Figura 1C). Debajo de la membrana basal se encuentra la lámina propia, delimitada por la muscular de la mucosa que se evaginó y se formaron plicas con diferentes longitudes. El tamaño de estas plicas fue mayor en la porción craneal (Figuras 1A y 1E). Éstas evaginaciones se confirmaron con la tinción TG, que permite distinguir el tejido conjuntivo del músculo liso (Figuras 1C y 1G).

Del mismo modo, se distinguieron múltiples membranas basales que soportan un epitelio plano simple (endotelio) y forman ductos, semejantes a vasos linfáticos (Figuras 1C, 1F y 1H). Además, se apreciaron células de afinidad tintorial pálida de núcleo central y uno o dos nucléolos en el tejido conjuntivo laxo adyacente a la lámina muscular de la mucosa.

La tunica muscularis (muscular del órgano) consiste de 2 capas de músculo liso: el estrato circular, que fue el más delgado, y el estrato longitudinal (Figuras 1A, 1B, 1E y 1F). Entre las capas musculares circular y longitudinal se localizaron grupos de células de afinidad tintorial pálida y núcleo central (Figuras 1B y 1F). La serosa, formada por tejido conjuntivo laxo areolar y un mesotelio, recubría la superficie externa a lo largo del intestino (Figura 1B).

Resultados de histoquímica

Se verificaron variaciones importantes. Los resultados de la histoquímica de los mucopolisacáridos (MPS) se muestran en el cuadro 1.

Cuadro 1 Resumen de los resultados histoquímicos de las células caliciformes. 

(-) sin tinción, (+-) intensidad muy débil, (+) intensidad débil, (++) intensidad media, (+++) intensidad fuerte y (γ-M) gama-metacromasia.

La tinción PAS, que detecta glucógeno y dioles vecinales reactivos con el peryodato (^{Mc Manus, 1948}), confirmó que el epitelio de revestimiento es pseudoestratificado cilíndrico (Figuras 2A y 3A). El citoplasma apical de las CCs dio positivo a PAS a lo largo del TGI (Figuras 2A, 3A y Tabla 1). En la submucosa, las membranas basales que sostenían el endotelio, en particular, se tiñeron con las tinciones PAS, MP e IW (Figuras 2A, 2E, 2F, 3A, 3E y 3F respectivamente).

Figura 2 Características histoquímicas de la porción craneal del intestino delgado. A) Tinción PAS. B) Tinción Giemsa. C) Tinción azul de toluidina (pH 4.5). D) Tinción azul de toluidina (pH 3.5). E) Tinción metenamina de plata. F) Impregnación de Wilder. G) Tinción azul alciano (pH 1.0). H) Tinción azul alciano (pH 2.5). I) Tinción azul alciano/PAS. J) Tinción de hierro coloidal. K) Tinción azul de Perls. Epitelio de revestimiento (E), borde estriado (BB), célula caliciforme (flecha), membrana basal (BM), músculo liso (SM), vaso sanguíneo (BV), vaso linfático (LV), endotelio (En), tunica muscularis (TM) y lumen (*). Barra: 30 μm. 

Figura 3 Características histoquímicas de la porción caudal del intestino delgado. A) Tinción PAS. B) Tinción Giemsa. C) Tinción azul de toluidina (pH 4.5). D) Tinción azul de toluidina (pH 3.5). E) Tinción metenamina de plata. F) Impregnación de Wilder. G) Tinción azul alciano (pH 1.0). H) Tinción azul alciano (pH 2.5). I) Tinción azul alciano/PAS. J) Tinción de hierro coloidal. K) Tinción azul de Perls. Epitelio de revestimiento (E), borde estriado (BB), célula caliciforme (flecha), célula caliciforme teñida con AA pH 1.0 (flecha negra), membrana basal (BM), músculo liso (SM), plexo submucoso (PS), plexo mientérico (PM), vaso sanguíneo (BV), vaso linfático (LV), endotelio (En), tunica muscularis (TM) y lumen (*). Barra: 30 μm. 

Se observó una reacción de metacromasia con las tinciones Giemsa y AT a pH 4.5, que se corroboró con la tinción AT a pH 3.5, reacción que se resistió a la deshidratación etílica; por lo tanto, pertenece al tipo gamma, pues demostró la presencia de ésteres de sulfato (^{Pearse, 1960}, ^{García de Moral, 1993}). Se descubrió una reacción metacromática en la porción craneal (Figs. 2B, 2C, 2D y Tabla 1), pero no en la porción caudal, donde la tinción fue negativa (Figuras 3B, 3C, 3D y Tabla 1).

La tinción AA se usó para determinar la presencia de mucopolisacáridos ácidos (MPSA) (^{Mowry, 1956}); AA a pH 1.0, para MPSA con ésteres O-sulfatados, y AA a pH 2.5, para MPSA con ésteres O-sulfatados y MPSA con grupos carboxílicos (ácido siálico o urónico) (^{Pearse, 1960}, ^{García del Moral, 1993}).

En las muestras de la porción craneal teñidas con AA a pH 1.0, los gránulos de las CC se pigmentaron débilmente (Figura 2G). Mientras que los gránulos de algunas CC en la porción caudal tuvieron una muy débil coloración, algunos otros fueron negativos (Figura 3G). Las muestras de la porción craneal teñidas con AA a pH 2.5 mostraron una reacción tenue en los gránulos de las CC (Figura 2H), mientras que en la porción caudal los gránulos se pigmentaron intensamente (Figura 3H).

La técnica del PAS/AA permite distinguir entre gránulos con MPS neutros y MPSA en la misma célula. Detecta MPSA con grupos carboxílicos y MPSA con ésteres O-sulfatados (color turquesa), dioles vecinales reactivos al peryodato (color magenta) y MPSA con grupos carboxílicos, MPSA con ésteres O-sulfatados y dioles vecinales reactivos al peryodato en conjunto (color morado) (^{Yamabayashi, 1987}). Los gránulos de las CC en ambas porciones intestinales mostraron afinidad a los dos colorantes, pero con diferente distribución. En la porción craneal, las CC mostraron gránulos específicos; incluso fue posible distinguir su afinidad por la tinción PAS o AA (Figura 2I). En contraste, en la mitad caudal se observó una pigmentación homogénea con ambos colorantes de tono morado (Figura 3I).

Mediante la tinción de hierro coloidal se observaron MPS con ácido siálico (^{Pearse, 1960}; ^{Rambourg, 1972}; ^{García del Moral, 1993}) en gránulos de las CC a lo largo del TGI (Figuras 2J, 3J y cuadro 1). La porción craneal mostró una coloración menor (Figura 2J) a la porción caudal (Figura 3J). Este resultado se corroboró con la tinción azul de Perls, que descarta falsos positivos: las CC no se pigmentaron (^{García del Moral, 1993}) (Figuras 2K, 3K y cuadro 1).

La tinción MP y la IW, que evidenció fibras reticulares de la lamina reticularis (Figuras 2E, 2F, 3E y 3F), se emplearon para determinar la presencia de membranas basales. La tinción MP demostró, además de la presencia de múltiples membranas basales, afinidad por vesículas citoplasmáticas en los enterocitos, adicionalmente a los gránulos de las CC en ambas porciones intestinales, con mayor intensidad en la porción caudal (Figuras 2E y 3E).

La tinción Grimelius, una técnica de impregnación de plata, se empleó para la detección de células con gránulos argirófilos (Grimelius, 2004). Acúmulos de células agrupadas se encontraron en la submucosa, en particular en la base de la plica, y aisladas a lo largo de la plica, adyacentes a la membrana basal epitelial (Figuras 4A y 4E). En apariencia, estas células fueron más numerosas en la mitad craneal: alrededor de 4 o 5 células por grupo en comparación con una o 2 células agrupadas en la mitad caudal.

Figura 4 Resultados histoquímicos de las técnicas Grimelius y Masso-Fontana. Porción craneal: A y B) Tinción Grimelius, C y D) Tinción Masson-Fontana. Porción caudal: E y F) Tinción Grimelius, G y H) Tinción Masson-Fontana. Epitelio de revestimiento (E), mucosa (M), borde estriado (BB), célula caliciforme (flecha), célula argentafín (ArC), célula argirófila (AC), eritrocito (Er), submucosa (Sb), plexo submucoso (Psb), plexo mientérico (PM), vaso sanguíneo (BV), vaso linfático (LV), endotelio (En), tunica muscularis (TM) y lumen (*). Barra: A y C) 100 μm; E y G) 30 μm; B, D, F y H) 20 μm. 

La tinción M-F se usó para la detección de moléculas en los gránulos de secreción capaces de reducir a la plata, técnica basada en la reacción argentafin (^{García del Moral, 1993}). Se observaron grupos de células en el mismo número, posición y morfología que aquellas encontradas con la tinción de Grimelius (Figuras 4C, 4D, 4G y 4H).

Finalmente, para la distribución de MPS en las CC a lo largo del TGI se concluye de la siguiente manera: en la porción craneal, MPS neutros (Figura 2A), MPSA sulfatados (Figuras 2B, 2C, 2D y 2G) y MPS con ácido siálico (Figuras 2J y 2K); en la porción caudal, MPS neutros (Figura 3A) y MPS con ácido siálico (Figuras 3J y 3K).

Histología

El borde estriado de la superficie apical de los enterocitos (Figuras 1C, 1D, 1G y 1H) corresponde a la imagen microscópica de las microvellosidades, lo que sugiere que los enterocitos presentan el área de superficie incrementada para la absorción (^{Eichholz y Crane, 1965}); sin embargo, es necesario confirmar esta percepción mediante microscopía electrónica.

Con respecto al epitelio de revestimiento, ninguna de las técnicas de tinción (Figuras 1A, 2A y 3A) mostró límites celulares paralelos a la membrana basal, lo que define a este epitelio de revestimiento como pseudoestratificado cilíndrico; también exige confirmación mediante microscopía electrónica. Este hallazgo es consistente con las descripciones realizadas en el TGI de un anfibio: el cecílido Typhlonectes venezuelensis (^{Martínez et al, 2004}). Los autores proponen especular que el ID de las tortugas caguama pudiera llevar a cabo funciones respiratorias, basados en la peculiaridad del epitelio pseudoestratificado.

En un inicio el análisis apuntaba hacia las células de Paneth, las enteroendócrinas y las caliciformes; pero solo se identificaron estas últimas, mismas que presentaron características histoquímicas que se discuten con mayor detalle más adelante.

La submucosa se evagina hacia la luz formando plicas (Figuras 1A y 1E). La presencia de plicas en el aparato digestivo es una característica relevante del ID de las tortugas caguama. En el caso de las tortugas marinas, las razones fisiológicas acerca de la existencia de plicas no está confirmado; no obstante, en el duodeno, macroscópicamente se advierten estructuras o elevaciones de la mucosa con la apariencia de panal; estas estructuras pueden contribuir, no sólo a la compactación del alimento, sino a la ampliación de la superficie de contacto, quizá por la ausencia de vellosidades intestinales en las tortugas (^{Wyneken, 2001}).

Los múltiples ductos con la apariencia de vasos linfáticos es una característica significativa del ID de las crías de tortugas caguama. Una posibilidad de la existencia de estos ductos se explicaría por el transporte de quilomicrones a través de los vasos linfáticos (^{Tso y Balint, 1985}). Los quilomicrones transportan colesterol (^{Tso y Balint, 1986}) y las tortugas caguama son grandes consumidoras de colesterol (^{Kakizoe, 2004}), quizá por su dieta rica en crustáceos (^{Ernst y Lovich, 2009}).

Los grupos de células pálidas observadas en la submucosa y en la muscu lar del órgano, entre el estrato circular y el longitudinal (Figuras 1B y 1F), pueden corresponder al plexo mientérico y submucoso, que actúan como moduladores importantes de la peristalsis y en la compactación del contenido intestinal (^{Holmberg et al, 2002}). ^{Timmermans et al, (1991)} describieron la inervación entérica intrínseca en la tortuga de agua dulce Pseudemys scripta (ahora Trachemys scripta elegans); sin embargo, es inexiste la información al respecto en tortugas marinas para compararlas.

Histoquímica

La combinación de MPS se ha discutido como aspecto adaptativo (^{Park et al, 2001}) que permite la lubricación y limpieza (^{Moitra et al, 1989}) debido a la capacidad de favorecer las interacciones entre el agua y la mucosa (^{Singh et al, 1974}). ^{Rogers (1961)} reportó que 1 g de MPSs puede asociarse con 200-500 g de agua.

La reacción metacromática tipo gamma en los gránulos de secreción de las CC en la porción craneal se relaciona con la presencia de componentes electronegativos (polianiones), en particular, ésteres sulfatados que favorecen la acumulación o polimerización de los componentes catiónicos de las tinciones Giemsa y AT (^{Pearse, 1960}, ^{García del Moral, 1993}). Se ha sugerido que los MPSA, especialmente los MPSA sulfatados, forman una barrera de defensa que protege al intestino de patógenos potenciales y de las enzimas digestivas (^{Robertson y Wrigth, 1997}). Es compatible con otros experimentos, los cuales indican que las CC de la región intestinal, densamente poblada con microorganismos, secretan principalmente mucinas ácidas (^{Nieuw et al, 1998}). Más aún, los MPSA sulfatados muestran una mayor resistencia a la degradación por glicosidasa bacteriana, además de poseer un fuerte efecto inhibitorio en el crecimiento bacteriano comparado con los MPSA no sulfatados (^{Conour et al, 2002}).

Por otro lado, la afinidad de los gránulos de secreción de las CC con la tinción MP está asociada a los aldehídos reactivos obtenidos después de una alta oxidación con ácido crómico, lo que revela tanto glucógeno como MPS neutros (^{Pearse, 1960}). El glucógeno se ha reportado en las CC de ratas y se ha discutido el papel de la glucosa como precursor en la síntesis de otros carbohidratos en el aparato de Golgi (^{Neutra y Leblond, 1966}). Las vesículas citoplásmicas constatadas con la tinción MP indican la posible presencia de cisternas del aparato de Golgi (^{Rambourg et al, 1969}).

La naturaleza de las células con gránulos reactivos a las tinciones de impregnación de plata, Grimelius y M-F no se determinó por completo. ^{Ahmed et al, (2009)} evaluaron la técnica de Grimelius en el Varanus niloticus para demostrar la presencia de células enteroendócrinas, una variedad de célula epitelial. Más aún, en mamíferos, la reacción argentafin y argirófila se asocia con moléculas capaces de reducir el nitrato de plata, tales como las aminas biógenas (fundamentalmente 5-hidroxitriptamina y dopamina) (^{Lundqvist et al, 1990}), que sintetizan los mastocitos (^{Kushnir-Sukhov et al, 2007}) y las células enteroendócrinas (^{Grimelius, 2004}). En la C. caretta, la localización de estas células en la submucosa y su morfología, podrían sugerir corresponden a mastocitos; sin embargo, los mastocitos son células típicamente reactivas al AT (^{Chiu y Lagunoff, 1972}), hecho que no se observó en esta investigación. La posible presencia de otras células glandulares como las de Paneth es especulativo, ya que no se han reportado ni en otras tortugas, como en la tortuga Testudo graeca (^{Perez-Tomas et al, 1990}), ni en otros reptiles (^{Ferri et al., 1976}, ^{Kotze et al 1992}).

El hecho de que los animales analizados fueran crías complica la interpretación de los resultados. Al respecto, conviene llevar a cabo estudios inmunohistoquímicos complementarios, tanto para la investigación de mastocitos como de células de Paneth.

Los análisis de inmunohistoquímica, enfocados a determinar la existencia de células tales como linfocitos intraepiteliales, células dendríticas y linfocitos en migración, clarificarían los mecanismos de la inmunidad mucosal. También se recomienda indagar respecto a la fisiología de los quilomicrones, con investigaciones similares a las de ^{Tso y Balint (1985)}. Cualquier exploración prospectiva requerirá una descripción histológica, por lo que este trabajo servirá de cimiento.