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INTRODUCCIÓN
Trypanosoma cruzi (T. cruzi) es un protozoo flagelado del orden Kinetoplastida (El-Sayed et al., 2005). Es el agente causal de la tripanosomiasis americana, una enfermedad parasitaria transmitida por vectores y endémica en Sudamérica, Centroamérica y México. T. cruzi representa un importante problema de salud pública, con aproximadamente 8 millones de personas infectadas y 25 millones en riesgo de infección (Ibáñez-Cervantes et al., 2018). En el 3-5 % de los pacientes afectados de forma aguda, la infección puede dar lugar a varias afecciones: 1) miocarditis, que puede evolucionar a insuficiencia cardiaca y muerte; 2) lesiones destructivas de cardiomiocitos y nervios cardiacos, que también pueden evolucionar a insuficiencia cardiaca; o 3) meningoencefalitis (James et al., 2005). En pacientes con infección crónica, la enfermedad puede pasar desapercibida durante varios años, hasta que el 20-35 % de estos pacientes desarrollan lesiones irreversibles del sistema nervioso autónomo. La enfermedad de Chagas representa la principal causa de lesiones cardiacas en adultos jóvenes y económicamente productivos de países endémicos (El-Sayed et al., 2005; James et al., 2005).
En la actualidad, las opciones de tratamiento son limitadas y no se dispone de ninguna vacuna para prevenir o controlar la infección por T. cruzi. Los fármacos aprobados por la OMS para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, como el nifurtimox (NFMX) y el benznidazol (BNZ), presentan al menos cuatro desventajas (Colantonio et al., 2016). En primer lugar, debido a los duros efectos secundarios de estos fármacos, alrededor del 40 % de los pacientes abandonan el tratamiento. En segundo lugar, estos fármacos actúan con mayor eficacia durante la fase aguda de la infección; sin embargo, como es difícil detectarla, la mayoría de las personas inician el tratamiento farmacológico hasta que se ha establecido la fase crónica de la enfermedad, con la consiguiente reducción de la eficacia antiparasitaria de los fármacos (Colantonio et al., 2016). Tercero, el acceso público a los fármacos terapéuticos es limitado (Chaves et al., 2017). En cuarto lugar, algunas cepas de T. cruzi son resistentes al NFMX y al BZN, lo que hace que su eficacia sea subóptima (Toledo et al., 2004). Estos factores enfatizan la necesidad de desarrollar mejores fármacos anti-T. cruzi y/o nuevas estrategias de tratamiento para la tripanosomiasis americana.
Las tendencias médicas actuales incluyen nanomateriales, especialmente metales nobles como el oro y la plata. Estos materiales han tenido aplicaciones biomédicas desde la antigüedad (Ge et al., 2014). Las investigaciones recientes sobre nanopartículas de oro se han orientado al tratamiento del cáncer, mientras que las nanopartículas de plata (AgNPs) se han utilizado para combatir patógenos (bacterias, hongos, virus y protozoos) (Ge et al., 2014).
Las nanoestructuras de plata cristalina están disponibles en muchas formas y tamaños (Sun et al., 2002) que se pueden utilizar como tratamientos médicos (Dankovich et al., 2011; Dubas et al., 2006; Kokura et al., 2010; Lee et al., 2006), pero el efecto de las nanopartículas de plata sobre los protozoos parásitos aún no se conoce completamente (Mao et al., 2016). En este sentido, dos estudios han reportado que el método tradicional para sintetizar las AgNPs puede tener propiedades citotóxicas contra los protozoos patógenos Leishmania tropica y Toxoplasma gondii (Allahverdiyev et al., 2011; Adeyemi et al., 2017) y aunque recientemente Brito et al., 2020 biosintetizaron AgNPs a partir de mazorcas de maíz que contenían xilanos fueron capaces de causar la muerte de la cepa Y del T. cruzi.
El objetivo del presente estudio fue evaluar el potencial citotóxico de las AgNPs sobre tripomastigotes de dos biotipos de T. cruzi in vitro. Hasta donde sabemos, este es el primer intento de definir cómo la dosis y las características estructurales de las AgNPs afectan a los cultivos de T. cruzi in vitro, en un esfuerzo por encontrar una alternativa segura para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Síntesis de nanopartículas de plata
La plata inorgánica (AgNO3, ≥ 99,0 %), y el borohidruro de sodio (NaBH4, ≥ 99,99 %) se adquirieron en Sigma-Aldrich, Estados Unidos. Todas las reacciones se llevaron a cabo utilizando agua desionizada (18MΩ; Millipore). El método elegido induce la dispersión de las nanopartículas a través de una solución coloidal estable, generando un gradiente de concentración. Se utilizó borohidruro sódico como agente reductor bajo un baño frío con agitación magnética (Mulfinger et al., 2007). La solución de AgNP (Figura 1) se produjo utilizando 0,1 mM AgNO3/50 mL (H2O).
Figura 1 Caracterización de las AgNPs mediante espectroscopia UV-Vis. Espectros de absorbancia de las AgNPs (λmax = 396 nm). La figura insertada muestra la fotografía del coloide de nanopartículas de plata.
Las AgNPs preparadas en solución acuosa facilitaron el estudio de la interacción entre las nanopartículas y el parásito, sin la intervención de ningún surfactante o medio de dispersión que no fuera agua desionizada. Esto se consiguió tras varias síntesis piloto con dos agentes reductores (citrato y borohidruro). El borohidruro produjo una síntesis más estable y concentrada (0,1 mM AgNPs) que sirvió para alcanzar las dosis de 1-12 µg utilizadas por Allahverdiyev et al., 2011 contra Leishmania tropica. La esterilidad de las AgNPs se comprobó incubando las nanopartículas en caldo Luria Bertani estéril (200 µl/L) a 37 ºC durante dos semanas.
Caracterización estructural de las AgNPs
Las nanopartículas se caracterizaron mediante espectroscopia UV-Vis, microscopia electrónica de transmisión (TEM) y microscopia electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) utilizando una dilución al 1 % de AgNPs suspendidas en agua desionizada (v/v). Se utilizó un Genesys 10S VIS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE.UU.) para realizar espectroscopia UV-Vis y verificar la longitud de onda de resonancia de plasmón superficial característica (400-450 nm) de las AgNPs (Mulfinger et al., 2007). Se colocaron alícuotas (40 μL) de AgNPs dispersas en metanol (1:5) sobre 400 rejillas de cobre recubiertas de carbono, se secaron en un desecador a 25 °C durante 24 h y, a continuación, se observaron en un JEM-ARM200F-TEM a 120 kV. Para determinar la dirección cristalográfica de las facetas de las AgNPs mediante transformada rápida de Fourier (FFT), se observaron las distancias interatómicas en un JEM-ARM200F-TEM a 200 kV (HRTEM) y se analizaron con el software Garantia Microscopy Suite Digital Micrograph Software.
Cultivo de parásitos
Los tripomastigotes de las cepas de T. cruzi Sylvio X10/4 (TcI) y Esmeraldo (TcII) se cultivaron en monocapas de células Vero, que se mantuvieron en medio DMEM suplementado con un 2% de suero bovino fetal [FBS] y un 1 % de penicilinaestreptomicina (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE.UU) en condiciones controladas (37 °C, 5 % de CO2 y humedad saturada) (Aparicio-Burgos et al., 2015). Cuando los tripomastigotes empezaron a salir de las células, se recogieron los parásitos libres y se prepararon para el ensayo de toxicidad de AgNP.
Los tripomastigotes se colocaron en tubos cónicos de 15 mL y se centrifugaron a 704 × g durante 7 min. Los sobrenadantes se desecharon y los pellets se volvieron a suspender en 1 mL de medio DMEM fresco. El número de parásitos se estimó con un hemocitómetro y se ajustó a 1×106 por pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos para el ensayo de toxicidad.
Ensayo de toxicidad de AgNPs para T. cruzi in vitro
Los tripomastigotes (1×106 por pocillo) se colocaron en placas de 96 pocillos (Sarstedt, EE.UU.) en medio suplementado con DMEM y se cultivaron a 37 °C, 5 % de CO2 y humedad saturada, con diferentes dosis de AgNP (1, 5, 10 o 12 μg/100 μL). El ensayo se realizó por triplicado con tripomastigotes no tratados (- Ctrl) o tratados con NFMX (400 μg/100 μL, Lampit®, Bayer) como controles negativo y positivo. El NFMX se preparó según lo descrito por Rolón et al., 2006. Brevemente, una tableta de la presentación comercial de NFMX (120 mg) se molió en un mortero estéril y se resuspendió en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). La concentración final de DMSO en los medios de cultivo nunca superó el 0,3 % (v/v).
Las placas se incubaron durante 24 horas en las mismas condiciones controladas. Tras el tratamiento farmacológico, se estimó la viabilidad del parásito y de las células mediante MTS (3-[4,5,dimetiltiazol-2-il]-5-[3-carboximetoxifenil]-2-[4-sulfofenil]-2H-tetrazolio, sal interna) de CellTiter 96 kit® Aqueous One Solution (Promega, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante, por colorimetría a 490 nm de longitud de onda. Para este ensayo, los valores de densidad óptica (DO) se correlacionaron positivamente con la viabilidad celular. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. La concentración inhibitoria semimáxima (IC50) para cada biotipo de T. cruzi se calculó a partir de la curva dosis-respuesta (Attarde et al., 2020; Barile & Hopkinson, 1993)..
Ensayos citotóxicos in vitro en una línea celular de queratinocitos humanos (HaCaT)
Las células HaCaT (una línea celular inmortal de queratinocitos humanos no cancerosos) (2×104/pocillo) se cultivaron en una placa de 96 pocillos (Sarstedt, EE.UU.) en DMEM suplementado (2 % FBS, penicilina 10.000 unidades/mL y estreptomicina 10.000 µg/mL) y AgNPs a 1, 3, 5, 10 o 12 µg/µL. Para cada experimento, las células de al menos tres pocillos se dejaron sin tratar (control). La placa se incubó durante 48 h en condiciones controladas (37 °C, 5 % de CO2 y humedad saturada). Tras el tratamiento, se estimó la viabilidad celular mediante MTS (3-[4,5,dimetiltiazol-2-il]-5-[3-carboximetiltioxi-fenil]-2-[4sulfofenil]-2H-tetrazolio, sal interna) de CellTiter 96 kit® Aqueous One Solution (Promega, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad metabólica de las células tratadas con MTS se estimó por colorimetría a una longitud de onda de 490 nm.
Análisis estadísticos
Se utilizó ANOVA para analizar los resultados del ensayo de viabilidad in vitro. Las diferencias medias de todos los ensayos se evaluaron mediante la prueba de Tukey. Las diferencias se consideraron significativas a P < 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., EE.UU.).
RESULTADOS
Caracterización de AgNPs
El espectro UV-Vis del coloide de plata acuoso (Figura 1) mostró un fuerte pico a 396 nm, una banda de resonancia de plasmón superficial (SPR) típica de las AgNPs. El pico de absorción estrecho y simétrico indica una distribución homogénea del tamaño de las AgNPs. Las micrografías de las muestras de AgNP muestran nanopartículas semiesféricas acompañadas de algunas estructuras alargadas de tamaño 52 nm (Figura 2a y 2b). La microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) mostró que 80% de las partículas eran decaedros (Figura 2c) con facetas {111} (Figura 2d).
Figura 2 Las micrografías muestran las nanopartículas de plata producidas cuando se utilizó borohidruro como agente reductor a una concentración de 0,1 mM. (a) Imagen de microscopía electrónica de transmisión (MET) de nanopartículas de plata con un diámetro medio de 52 nm; (b) las partículas son en su mayoría semiesféricas, y también se observan algunas estructuras alargadas; (c) la microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) mostró partículas decaédricas y (d) la transformada rápida de Fourier (FFT) mostró facetas {111} y {002}.
Viabilidad celular para el ensayo MTS
Los porcentajes de viabilidad de tripomastigotes para ambas cepas de T. cruzi mostraron una respuesta dependiente de la dosis; esta respuesta fue más evidente para la cepa Sylvio X10/4, que mostró una reducción del 50 % en la viabilidad del parásito a la dosis de 1 µg de AgNPs y una reducción del 95 % en la viabilidad a la dosis experimental más alta de 12 µg después de 24 horas de tratamiento. Sin embargo, la cepa Esmeraldo mostró una reducción del 83 % en la viabilidad a la dosis más alta (12 µg), mostrando diferencias estadísticas entre la cepa Esmeraldo y la cepa Sylvio X10/4. El análisis estadístico de los resultados mostró diferencias entre el control negativo y todos los demás tratamientos, incluidas las diferentes dosis de AgNPs y el control positivo (NFMX) (Figura 3).
Figura 3 Supervivencia de T. cruzi tras el tratamiento con cualquiera de las tres dosis diferentes de AgNPs (1, 5, 10, 12 µg/100 µl), Nifurtimox (NFMX, 400 µg/100 µl) o sin tratamiento (-Ctrl, utilizado como control negativo para el ensayo de viabilidad MTS). Las muestras se evaluaron tras 24 horas de tratamiento. Cada barra representa el valor medio de absorbancia ± DE. Las diferencias (P < 0,05) entre grupos, según la prueba de Tukey, se indican con caracteres encima de las barras de tratamiento
Estimación IC50
Las AgNPs no mostraron toxicidad diferente entre las IC50 de las cepas estudiadas de T. cruzi. Las IC50 para tripomastigotes de las cepas Sylvio X10/4 y Esmeraldo fueron de 4,05 y 6,16 µg/mL, respectivamente (Figura 4).
Figura 4 Inhibición de T. cruzi tras 24 horas de tratamiento con AgNPs Inhibición de T. cruzi tras 24 horas de tratamiento con AgNPs (1, 5, 10, 12 µg/100 µl). Cada barra representa el valor medio de absorbancia ± desviación estándar (n=6). Dentro del mismo punto temporal, las diferencias estadísticas (P < 0,05) entre grupos se muestran con caracteres diferentes encima de las barras según la prueba de Tukey
Células HaCaT tratadas con AgNPs
La viabilidad de las células HaCaT se evaluó 48 h después del tratamiento (Figura 5). La toxicidad de las AgNP en las células HaCaT se evaluó mediante MTS a diferentes concentraciones: 1, 3, 5, 10 o 12 μg/100 μL, que dieron como resultado un IC50 de 10 μg/mL (P<0,05), lo que indica que las AgNPs eran aproximadamente 2 veces menos tóxicas para las células HaCaT que los tripomastigotes. Los resultados mostraron que las AgNPs no eran citotóxicas a la dosis efectiva (valores IC50 = 4,05 y 6,16 µg/mL) contra las cepas TcI y TcII de T. cruzi.
Figura 5 Viabilidad de las células HaCaT La viabilidad de las células HaCaT se examinó mediante el ensayo MTS. Las células HaCaT se estimularon con diversas dosis de AgNPs (1, 3, 5, 10, 12 µg/100 µl) durante 24 horas. Los asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significativas en comparación con el control (CN) (P < 0,05)
DISCUSIÓN
La enfermedad de Chagas es una enfermedad transmitida por vectores y causada por T. cruzi, un parásito hemoflagelado que suele provocar cardiopatías debilitantes y mortales. BNZ y NFMX son los únicos fármacos disponibles aprobados para el tratamiento médico (Chaves et al., 2017; Toledo et al., 2004). Sin embargo, estos fármacos inducen duros efectos secundarios que impiden a los pacientes concluir el tratamiento. En muchos casos, T. cruzi es resistente a estos fármacos, por lo que son incapaces de eliminar el parásito de los tejidos infectados (Colantino et al., 2016; Toledo et al., 2004). Por lo tanto, los programas de salud pública requieren el desarrollo de fármacos terapéuticos más eficaces y menos tóxicos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.
Las nanopartículas de plata (AgNPs) tienen efectos antimicrobianos no solo contra hongos (Soliman et al., 2018; Mousavi et al., 2015), bacterias Gram-positivas (Adibhesami et al., 2017) y Gram-negativas (Pal et al., 2007), pero también contra protozoos como Apicomplexa (Toxoplasma gondii) (Adeyemi et al., 2017) y Trypanosomatida (Leishmania tropica y Leishmania infantum) (Baiocco et al., 2011). Aquí informamos de los efectos tripanolíticos in vitro de las AgNPs contra dos cepas diferentes de T. cruzi.
Para este estudio, produjimos AgNPs semiesféricas y decaédricas con un diámetro medio de 52 nm (Figuras 1 y 2), y las utilizamos a 5 dosis diferentes (1, 3, 5, 10 o 12 μg/mL) para probar la toxicidad en células HaCaT y la actividad tripanolítica en tripomastigotes producidos en co-cultivo con monocapas de células Vero. Encontramos que las nanopartículas de plata reducen significativamente la viabilidad celular de una manera dependiente de la dosis en células HaCaT. Esta observación está de acuerdo con otros estudios (Chen et al., 2019; Perde-Schrepler et al., 2019). Es importante destacar que las AgNPs no son citotóxicas a dosis eficaces contra las cepas de T. cruzi, y la toxicidad de las AgNPs sobre los tripomastigotes se evaluó indirectamente mediante un ensayo de proliferación MTS, que mostró un efecto negativo de las AgNPs sobre la viabilidad de los tripomastigotes. La figura 3 muestra que las nanopartículas redujeron significativamente la viabilidad celular en comparación con el control negativo, y que las AgNPs tuvieron un poder tripanolítico similar al NFMX a diferentes dosis. Aunque no se observaron diferencias significativas en la viabilidad de T. cruzi con diferentes dosis de AgNPs, se observó una tendencia dependiente de la dosis en la viabilidad. Estos datos sugieren que las dosis más altas de AgNPs pueden tener efectos adicionales sobre la viabilidad de los tripomastigotes de T. cruzi. Curiosamente, una dosis relativamente baja (12 μg/100 μL) de AgNPs mató hasta el 96,3 % (con un IC50 = 4,05 - 6,16 µg/100 μL) de tripomastigotes in vitro, mientras que NFMX (400 μg/100 μL) mató sólo el 70 % (Figuras 3 y 4). Esto también sugiere que las AgNPs podrían ser un agente tripanolítico in vitro más eficiente que el NFMX, como se observó en el presente estudio, pero también en comparación con las nanopartículas de BNZ (con un IC50 = 36 µg/mL) (Scalise et al., 2016).
T. cruzi ya ha desarrollado cierta resistencia a BNZ y NFMX, los únicos fármacos aprobados clínicamente contra la enfermedad de Chagas (Mejia et al., 2012; Molina et al., 2000). Diferentes biotipos de T. cruzi tienen resistencia diferencial a BNZ. Las cepas TcI de T. cruzi son más resistentes a BNZ, mientras que las cepas TcII son más sensibles a este fármaco (Toledo et al., 2004; Mejia et al., 2012). Aquí, no encontramos diferencias en la sensibilidad a las AgNPs entre las dos cepas de T. cruzi analizadas (Sylvio X10/4 y Esmeraldo) pertenecientes a diferentes biotipos (TcI y TcII, respectivamente). Aunque son necesarios más estudios, nuestros datos relativos al amplio espectro de actividad antiparasitaria de las AgNPs sugieren que las nanopartículas podrían ser una opción interesante para resolver el problema de la resistencia del parásito a otros fármacos, ya sea utilizadas como fármaco alternativo o en combinación con los actualmente en uso.
Otros estudios deberían abordar los efectos de las AgNP como fármacos alternativos contra T. cruzi, especialmente para comprender si estas nanopartículas pueden ejercer un efecto perjudicial sobre los amastigotes, la fase de desarrollo intracelular del parásito en los mamíferos. Se ha informado de que los amastigotes de Leishmania tropica son más sensibles a las AgNP que los promastigotes a una dosis de 10 μg/0,1 mL (Allahverdiyev et al., 2011). Si esa hipótesis se mantiene para T. cruzi, el uso de AgNPs in vivo para uso terapéutico contra la enfermedad de Chagas se convertiría en un interesante tema de estudio.
Las AgNPs poseen propiedades físicas y electrónicas únicas, que las convierten en excelentes candidatas para aplicaciones médicas. El mecanismo antimicrobiano de las AgNPs parece estar relacionado con la formación de radicales libres que dañan la membrana de los microorganismos (Kim et al., 2007). Estas propiedades dependen del tamaño, la forma y el recubrimiento de las nanopartículas (Dubey et al., 2015). En el presente estudio, sintetizamos AgNPs con un diámetro medio de 52 nm; la mayoría de ellas eran semiesféricas (decaédricas), tenían facetas {111} y {110}, y presentaban una actividad tripanolítica aceptable. Sin embargo, creemos que la actividad tripanolítica de las AgNPs podría mejorarse, si la forma y el tamaño de las nanopartículas se ajustaran a triángulos con un tamaño de 1-10 nm. Este tipo de nanopartículas muestra una mayor actividad antibacteriana que las AgNPs más grandes con forma semiesférica, debido a la mayor densidad en las facetas {111}. Esto permite a las nanopartículas triangulares permeabilizar libremente la membrana plasmática e inducir así más daños a los microorganismos. Además, las AgNPs triangulares truncadas requieren dosis más bajas (1-10 μg/0,1 μL) para ejercer propiedades bactericidas que las AgNPs esféricas y nanorodales de mayor tamaño (12,5 y 50-100 μg/0,1 μL, respectivamente) (Ge et al., 2014; Dubey et al., 2015; Morones et al., 2005).
CONCLUSIONES
Una dosis de 12 µg/100 µL de AgNPs con un diámetro medio de 52 nm resultó citotóxica para los tripomastigotes de los biotipos TcI y TcII de T. cruzi in vitro. Futuros estudios ensayarán AgNPs de forma triangular con facetas {111} para mejorar los efectos antiprotozoarios de las AgNPs sobre diferentes biotipos de T. cruzi.
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
