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INTRODUCCIÓN
El objetivo de la criopreservación es mantener la viabilidad y funcionalidad de los espermatozoides a bajas temperaturas; sin embargo, esta provoca daños y deficiencias en los espermatozoides. Al momento de la criopreservación, los espermatozoides se exponen a impactos físicos y químicos que dificultan la viabilidad, disminuyen la motilidad, dañan el acrosoma y disminuyen su fertilidad (Mata-Campuzano et al., 2015). Esto se debe en parte al hecho de que la criopreservación induce estrés oxidativo, como resultado de la formación excesiva de especies reactivas al oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés; El-Khawagah et al., 2020), ya que los ácidos grasos poliinsaturados de la membrana son susceptibles al daño por ROS, y el citoplasma de los espermatozoides contiene bajas concentraciones de las enzimas que capturan los radicales libres (Karimfar et al., 2015).
La adición de antioxidantes en los diluyentes para la congelación de semen produce una mejora en las características post-descongelación, ya que protegen a los ácidos grasos poli-insaturados de los espermatozoides, previniendo así el daño por estrés oxidativo. Se ha demostrado que numerosas plantas tienen un efecto antioxidante, ya que contienen flavonoides con capacidades antioxidantes como la quercetina, y vitaminas antioxidantes como C, E y A (Berkovich et al., 2013). La quercetina es un flavonoide antioxidante comúnmente presente en vegetales, capaz de eliminar las ROS (El-Khawagah et al., 2020) y se ha reportado que mejora la calidad del semen de borrego post-descongelación (Silva et al., 2012; Gibb et al., 2013). La vitamina E es un antioxidante lipofílico que protege los ácidos grasos insaturados contra la peroxidación, ya que es un potente eliminador de radicales peroxilo y un inhibidor importante de la reacción en cadena de lipo-peroxidación en animales (Allai et al., 2018), y es comúnmente utilizado como antioxidante en la criopreservación de semen (Abdi-Benemar et al., 2015; Benhenia et al., 2016).
En comparación con otras técnicas de inseminación, la inseminación artificial por laparoscopia se utiliza como alternativa para la utilización de semen criopreservado, ya que los daños que ocurren en los espermatozoides al momento de la criopreservación limitan la fertilidad post-inseminación con técnicas vaginales o cervicales (Allai et al., 2018). Sin embargo, no se tiene ningún reporte de la evaluación de la fertilidad in vivo tras la adición de antioxidantes como la quercetina y la vitamina E en semen criopreservado de ovino. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la adición de quercetina en el medio de criopreservación de semen ovino sobre características espermáticas y fertilidad in vivo.
MATERIAL Y MÉTODOS
Área de estudio y animales
El estudio se realizó en el Laboratorio de Investigación y Reproducción Animal de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez (UACJ). La inseminación artificial se realizó en una granja ubicada en Ciudad Juárez en las coordenadas 31°43'12.9" N y 106°27'39.0" O, al norte del Estado de Chihuahua. El procesamiento del semen y la inseminación artificial se realizaron durante la época reproductiva (julio a febrero).
El semen se colectó de tres sementales de la raza Katahdin, con una edad aproximada de tres años, con una condición corporal de 4 (escala de 1-5). Para evaluar la fertilidad del semen criopreservado, se inseminaron 201 hembras de encaste racial de pelo (Katahdin, Pelibuey, Blackbelly), con una edad entre 2 y 4 años de edad y una condición corporal entre 2 y 4 de la escala 1-5. Los animales fueron alimentados con alfalfa, concentrado comercial y agua ad libitum. Todos los procedimientos en el presente estudio se realizaron de acuerdo a las técnicas de cuidado animal y salud en México (NOM-051- ZOO-1995) y con la aprobación del Comité Institucional de Ética y Bioética de la UACJ (CIEB-2019-1-093).
Colección de semen y evaluación pre-criopreservación
Se trabajó individualmente cada uno de los sementales para la colección de semen, con la técnica de vagina artificial. Una vez recolectadas las muestras, fueron conservadas a baño maría a 37.5 °C (Presicion Water 282, Thermo Scientific, EUA) mientras se colectaban y evaluaban las tres muestras. La colección de semen se realizó dos veces por semana, durante seis semanas. Se evaluaron 12 eyaculados por borrego, con un total del 36 eyaculados evaluados.
La evaluación pre-criopreservación se realizó tomando 10 µL de cada muestra mediante una pipeta (Magnetic-Assist Pipette, Rainin, EUA), la cual se depositó en una cámara de recuento estándar de 20 µm (Cámara Leja, Leja Products, Holanda), para ser evaluada mediante un análisis de semen asistido por computadora (CASA; AndroVision, Minitube, Alemania) con un microscopio vertical (AxioScope.A1, Zeiss, Alemania). Se evaluó la motilidad progresiva (%) y la concentración espermática (células/mL). Se establecieron como niveles mínimos requeridos para congelar: volumen del eyaculado ≥ 0.5 mL, motilidad progresiva ≥ 80%, y una concentración de 3x109 espermatozoides/mL (Câmara et al., 2011).
Dilución y procesamiento del semen
Los eyaculados se procesaron individualmente, ya que se utilizaron para la inseminación artificial. Se realizó un protocolo de dilución con un diluyente comercial (Two Step; Continental Plastic Corp., EUA) con 6% de glicerol (v/v) y 10% de yema de huevo (v/v). La dilución se trabajó a una temperatura de 37 °C. El eyaculado obtenido se diluyó hasta obtener una concentración de 120x106 espermatozoides mótiles por mL. Una vez diluido, el semen se envasó en pajillas de 0.25 mL, con una concentración de 30x106 espermatozoides motiles por pajilla, y se almacenó a 5 °C por dos horas. Una vez que las pajillas fueron refrigeradas y equilibradas a 5 °C, se colocaron en una hielera a 5 cm del espejo de nitrógeno durante 10 minutos, luego se dejaron caer al nitrógeno y se dejaron reposar por 5 minutos. Después, las pajillas fueron colocadas en un termo criogénico para su conservación; permanecieron ahí hasta el momento de su análisis y posteriormente para su uso en la inseminación artificial por laparoscopia.
Tratamientos
Las muestras diluidas se fraccionaron en cuatro porciones similares y se realizaron cuatro tratamientos: tratamiento control, se realizó de forma convencional; tratamiento quercetina (Q), se adicionaron 200 µM de quercetina (Q4951, Sigma Aldrich, EUA); tratamiento vitamina E (VE), se adicionaron 100 µM de vitamina E (47786, Sigma Aldrich, EUA); y tratamiento Q + VE, se adicionó una combinación de quercetina (200 µM) y vitamina E (100 µM).
Descongelación de las muestras seminales
El descongelamiento del semen se llevó a cabo colocando cada pajilla en baño maría (Presicion Water 282, Thermo Scientific, EUA) a 37.5 °C durante 40 segundos. Para evaluar las características seminales y la integridad del acrosoma, se seleccionaron y descongelaron al azar un total de seis pajillas por cada tratamiento por borrego (24 pajillas).
Evaluación de características seminales post-descongelación
Para evaluar las características seminales se colocaron 10 μL de semen en la cámara de recuento estándar para evaluar motilidad (%), motilidad progresiva (%) y motilidad rápida (%), mediante el sistema CASA. En el Cuadro 1 se indica la configuración del sistema CASA utilizado para evaluar el semen de borrego.
Cuadro 1 Configuración del sistema CASA* utilizado para evaluar el semen de borrego
| Variable | Configuración |
|---|---|
| Resolución horizontal/vertical | 1024 pixeles x 1024 pixeles |
| Tamaño del pixel horizontal/vertical | 5.5 µm x 5.5 µm |
| Cuadros por segundo | Arriba de 101 cuadros por segundo |
| Área | 10-100 |
| Detección de la cola | 5 µm |
| Profundidad de la cámara | 20 µm |
| Relación del pixel | 0.54 µm |
| Volumen de referencia | |
| Ancho | 555.12 µm |
| Alto | 555.12 µm |
| Espermatozoides in-motiles | ALC < 20.00 µm s-1 y FBC < 10.00 µm s-1 |
| Motilidad | |
| Motilidad local | VCL < 20.00 µm s-1 y VLR < 10.00 µm s-1 |
| Motilidad progresiva | |
| Motilidad circular | Radio > 10.00 µm s-1 a < 80.00 µm s-1 y rotación > 0.70 µm s-1 |
| Motilidad lenta | VCL < 80.00 µm s-1 |
| Motilidad rápida | VCL < 80.00 µm s-1 |
* Androvision, Minitube, Alemania.
ALC, amplitud de desplazamiento lateral de la cabeza; FBC, frecuencia de batido de la cola; VCL, velocidad curvilínea; VLR, velocidad en línea recta.
Evaluación del daño en la membrana acrosomal
Se tomaron 10 μL de la muestra de semen y se depositaron en un microtubo de 1 mL (Eppendorf, Alemania) y se mezcló con 10 μL del reactivo azul tripano (T8154, Sigma Chemical Co., EUA), y se colocaron 10 μL de la mezcla en un portaobjetos para realizar un frotis. Posteriormente, el frotis se fijó con etanol por dos minutos, se enjuagó con agua destilada y se dejó secar. Una vez terminada la fijación, los portaobjetos se colocaron en un recipiente con tinción Giemsa (48900, Sigma Chemical Co., EUA) donde permanecieron 18-20 horas. Después, el portaobjetos se enjuagó para eliminar el exceso de colorante con agua destilada y se dejó secar. La evaluación de la tinción de las células espermáticas se realizó por microscopía óptica a 100X (PrimoStar, Carl Zeiss, Alemania). Para obtener una media representativa de cada pajilla, se realizaron tres frotis por pajilla haciendo un conteo de 100 espermatozoides por frotis. Los espermatozoides se clasificaron en tres tipos: espermatozoides vivos con acrosoma intacto (teñidos color purpura en la región acrosomal), espermatozoides vivos con acrosoma dañado (sin acumulación de color púrpura en la región acrosomal) y espermatozoides muertos (citoplasma teñido color azul).
Inseminación artificial por laparoscopia y diagnóstico de gestación
El estro de las ovejas se sincronizó utilizando esponjas intravaginales (Cronogest CR®, Intervet International, Holanda) impregnadas con 40 mg de acetato de fluorogestona por 12 días. Al retiro de la esponja, se aplicaron 200 UI de gonadotropina coriónica equina (Novormon® 5000, Virbac, Argentina) a cada oveja. La detección de estro se realizó introduciendo un semental sujeto con una cuerda (sin permitir la monta a la hembra) a un corral con las hembras previamente sincronizadas, 16 h previas a la inseminación (Alhamada et al., 2017). Las hembras en estro se inseminaron 55 h después del retiro de la esponja por medio de la técnica de laparoscopia. Antes de la inseminación, las pajillas se descongelaron en un termo para descongelar (Cito Products Incorporated, EUA) a 37.5 °C por 40 segundos. El semen se aplicó vía intrauterina con ayuda de un laparoscopio (250 W Halogen, Wolf, EUA) y un áspic (Aspic, IVM, Francia). La dosis de inseminación (0.25 mL) se repartió equitativamente en ambos cuernos uterinos. Se inseminaron 201 ovejas, repartidas por tratamiento de la siguiente manera: control, 50 ovejas; quercetina (Q), 52 ovejas; vitamina E (VE), 50 ovejas; y tratamiento Q + VE, 49 ovejas.
El diagnóstico de gestación se realizó mediante ultrasonido con un transductor lineal 6.5 MHz (Kaixin, Xuzhou Kaixin Electronic Instrument CO., China), vía rectal, 35 días después de la inseminación, independientemente del tratamiento realizado en el diluyente utilizado para la criopreservación del semen. La fertilidad (tasa de gestación) se determinó obteniendo el porcentaje de hembras que resultaron gestantes del total de hembras inseminadas por tratamiento.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SAS 9.0 (Inst. Cary, NC, Estados Unidos de América). Los datos porcentuales se transformaron en arcoseno antes del análisis estadístico. Se realizó un análisis de varianza usando el procedimiento Modelo Lineal General para las variables numéricas: motilidad, motilidad progresiva, motilidad rápida, e integridad del acrosoma. La comparación de las medias entre los tratamientos se realizó mediante la prueba de Duncan. Para la tasa de gestación se utilizó la prueba de ji cuadrado. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas al nivel de P < 0.05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados del efecto de los diferentes tratamientos sobre las características espermáticas de motilidad evaluadas se muestran en el Cuadro 2. En el estudio, ningún tratamiento presentó diferencia significativa estadísticamente (P > 0.05) en las variables de motilidad, motilidad progresiva y motilidad rápida. No obstante, numéricamente, el tratamiento que presentó mayor porcentaje de motilidad (71.57%) y motilidad progresiva (68.13%) fue el tratamiento de quercetina comparado con los otros tratamientos. Sin embargo, en la variable motilidad rápida, el tratamiento con mayor porcentaje (numéricamente) fue el tratamiento vitamina E con 31.48 %.
Cuadro 2 Efecto de la adición de quercetina y vitamina E sobre las características espermáticas de motilidad de semen criopreservado de ovino (Media ± desviación estándar)
| Tratamiento | Motilidad (%) | Motilidad progresiva (%) | Motilidad rápida (%) |
|---|---|---|---|
| Control | 67.20±20.82 a | 63.52±21.31 a | 26.65±16.68 a |
| Q | 71.57±6.40 a | 68.13±6.57 a | 27.31±8.22 a |
| Vit E | 69.36±11.41 a | 65.92±12.62 a | 31.48±13.15 a |
| Q + Vit E | 60.07±13.16 a | 53.95±14.50 a | 16.93±8.72 a |
a Distintas literales entre filas indican diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05); Q = 200 µM de quercetina; Vit E = 100 µM de vitamina E.; Q + Vit E = 200 µM de quercetina +100 µM de vitamina E.
Como se mencionó, la criopreservación induce estrés oxidativo como resultado la formación de ROS en exceso, lo cual afecta la estructura de los espermatozoides, y afecta en las características espermáticas, provoca daño en el ADN, lípidos y proteínas que le dan protección a la estructura de los espermatozoides, ya que altera los sistemas enzimáticos y las vías de señalización celular, lo cual puede provocar la muerte de las células. Los daños espermáticos causados por ROS ocurren al momento de la criopreservación y la descongelación, e incluso durante el almacenamiento en nitrógeno líquido. Es importante mencionar que los espermatozoides normalmente generan pequeñas cantidades de ROS que son importantes para diferentes procesos fisiológicos de los espermatozoides como capacitación, hiperactivación y fecundación del ovocito (Mata-Campuzano et al., 2015; Aitken, 2017); sin embargo, una vez que estos niveles fisiológicos sobrepasan los mecanismos de control oxidante, se ocasiona el estrés oxidativo (El-Khawagah et al., 2020). Por lo anterior, para reducir el daño provocado por los efectos negativos de las ROS, diversos autores han propuesto la suplementación de antioxidantes a los medios de congelación, como la vitamina E y quercetina. Por ejemplo, Sarlós et al. (2002), Silva et al. (2012)), y Abdi-Benemar et al. (2015) han evaluado la adición de vitamina E a los medios de criopreservación de semen de ovinos, y reportan efectos favorables en la integridad acrosomal, vitalidad y motilidad. Sin embargo, en el presente estudio, no se encontró un efecto favorable de la adición de vitamina E como antioxidante en las variables de motilidad evaluadas. Estos efectos contradictorios de la adición de vitamina E pueden deberse a diferentes componentes de los diluyentes, ya que Sarlós et al. (2002) mencionan que el efecto de la vitamina E varía en respuesta al azúcar y amortiguador utilizado en los diluyentes; esto también podría explicar porque en el tratamiento donde se combinó la vitamina E y la quercetina tampoco existió un efecto favorable en las variables evaluadas. En el presente estudio, el diluyente utilizado contiene fructuosa como fuente de energía y tris aminometano (TRIS) como amortiguador y Sarlós et al. (2002) indican que la adición de vitamina E es más efectiva cuando los diluyentes basados en sacarosa contienen glucosa y TRIS.
De la misma forma, se ha reportado que la adición de quercetina en los medios de criopreservación de semen de diferentes especies produce efectos favorables en la motilidad e integridad acrosomal (Gibb et al., 2013; Seifi-Jamadi et al., 2016; Seifi-Jamadi et al., 2017; Ahmed et al., 2019; El-Khawagah et al., 2020), aunque algunos autores han reportado que no existen efectos positivos de la adición de quercetina (Silva et al., 2012; Banday et al., 2017) o incluso reportan efectos negativos (Restrepo et al., 2016). En el presente estudio, aunque la adición de quercetina no mostró una diferencia estadística en las variables de motilidad evaluadas, mostró un mayor porcentaje (numéricamente) en comparación con los demás tratamientos en las variables motilidad y motilidad progresiva. La falta de un efecto estadísticamente diferente quizá pueda deberse a los excelentes resultados de motilidad obtenidos post-descongelación del semen en todos los tratamientos, ya que normalmente se reporta un rango de entre 30 a 50% para la motilidad post-descongelación (Motlagh et al., 2014; Abdi-Benemar et al., 2015; Masoudi et al., 2017), y en el presente estudio en todos los tratamientos los valores de motilidad fueron superiores a 60 %.
En este estudio, al adicionar una concentración de 200 µM de quercetina, se obtuvo mayor porcentaje en la motilidad y motilidad progresiva (numéricamente) debido a que es un potente antioxidante que actúa en los espermatozoides, inhibiendo los radicales libres, y posee una actividad captadora de ROS más intensa que la vitamina E (Stojanović et al., 2001), evita la capacitación espermática prematura antes de la inseminación artificial y la reacción acrosomal durante su almacenamiento, lo que mejora el tiempo de vida de los espermatozoides (Restrepo et al., 2016; Seifi-Jamadi et al., 2016). Acorde con lo anterior, El-Khawagah et al. (2020) reportan que la inclusión de quercetina reduce los niveles de H2O2 y de peroxidación lipídica, que son indicadores de su efecto antioxidante. Asimismo, el efecto positivo en las variables de motilidad puede estar relacionado con la interacción con la Ca2+-ATPasa, enzima clave para la regulación de la motilidad, ya que la quercetina tiene un efecto inhibidor en la bomba Ca2+-ATPasa en la membrana plasmática, y resulta en una elevación de los niveles de Ca2+, que tiene un papel fundamental en la producción de adenosin monofosfato cíclico (cAMP), factores que controlan la motilidad en los espermatozoides (El-Khawagah et al., 2020).
Similar a lo encontrado en el presente estudio, Ardeshirnia et al. (2017) demostraron que al utilizar quercetina en semen de ovino extraído del epidídimo, al momento de la descongelación los espermatozoides mostraron mejor viabilidad al utilizar las concentraciones de 5 y 10 μg/mL en el diluyente del semen, pero la motilidad y motilidad progresiva no se afectó en comparación con el tratamiento control (0 μg/mL). Por otra parte, Ahmed et al. (2019) utilizaron 150 y 200 µM de quercetina en semen criopreservado de búfalo, y en la evaluación post-descongelación, estos tratamientos fueron mejores para motilidad progresiva e integridad de la membrana plasmática en comparación con los demás tratamientos (control, 50 y 100 µM de quercetina).
En el Cuadro 3 se presentan los porcentajes de espermatozoides vivos con acrosoma intacto (VAI), espermatozoides vivos con acrosoma dañado (VAD) y espermatozoides muertos, obtenidos en los diferentes tratamientos. El tratamiento de quercetina mostró una diferencia significativa en comparación con los demás tratamientos en los espermatozoides VAI (P<0.05). Con respecto a los espermatozoides VAD se encontró una diferencia entre los tratamientos vitamina E (100 µM) y quercetina (200 µM), en comparación con los tratamientos control (convencional) y la combinación de vitamina E (100 µM) y quercetina (200 µM) (P<0.05). El tratamiento de quercetina (200 µM) mostró una diferencia significativa, teniendo menos espermatozoides muertos en comparación con los demás tratamientos (P<0.05), lo que indica una mayor viabilidad.
Cuadro 3 Efecto de la adición de quercetina y vitamina E sobre la vitalidad y daño del acrosoma de los espermatozoides en semen criopreservado de ovino (Media ± desviación estándar)
| Tratamiento | Vivos Acrosoma Intacto (%) | Vivos Acrosoma Dañado (%) | Muertos (%) |
|---|---|---|---|
| Control | 8.66±4.50 b | 48.33±4.50 b | 43.00±4.00 bc |
| Q | 22.33±2.51 ª | 58.66±1.52 ª | 19.00±2.64 a |
| Vit E | 10.66±2.08 b | 52.00±5.29 a | 38.33±6.08 b |
| Q + Vit E | 11.33±2.08 b | 41.33±3.21 b | 47.33±1.52 c |
a,b,c Distintas literales indican diferencia estadísticamente significativa (P <0.05); Q = 200 µM de quercetina; Vit E = 100 µM de vitamina E.; Q + Vit E = 200 µM de quercetina +100 µM de vitamina E.
Estos resultados pueden deberse a que, como se mencionó anteriormente, los antioxidantes tienen un efecto protector, ya que al momento de la criopreservación ocurren deficiencias en la motilidad y viabilidad de los espermatozoides, y esto se debe a el daño que causan los ROS (Karimfar et al., 2015). Aunque los ROS son productos normales del metabolismo celular, cuando existen niveles altos de estos, los ROS son dañinos para los espermatozoides, y se generan tanto en el momento de la criopreservación y en la descongelación, dañando la morfología del espermatozoide (Aitken, 2017), afectando los lípidos y proteínas que protegen a los espermatozoides, lo que puede provocar la muerte de las células (Ardeshirnia et al., 2017).
En este sentido, Ahmed et al. (2019), al utilizar 150 y 200 µM de quercetina en semen criopreservado de búfalo, encontraron que los espermatozoides mostraron menor daño en la integridad de la membrana y daño acrosomal en comparación a los demás tratamientos (control, 50 y 100 µM de quercetina). En el presente estudio, se utilizaron concentraciones similares, 200 µM de quercetina, en el medio de criopreservación para semen de ovino y con este tratamiento se obtuvo una diferencia significativa para la variable espermatozoides VAI, comparado con los demás tratamientos. Lo anterior indica un efecto protector de la quercetina en la membrana acrosomal.
La integridad de la membrana es importante para mantener la viabilidad de los espermatozoides y es precisamente aquí donde ocurren las principales lesiones al momento de la criopreservación-descongelación, ya que la reducción e incremento de la temperatura ocasiona daños ultraestructurales y funcionales. La integridad de la membrana es un requisito fundamental para la viabilidad del espermatozoide y el éxito de la fertilización (Martínez-Pastor et al., 2004; El-Khawagah et al., 2020). El daño parcial o total del acrosoma de los espermatozoides provoca una incapacidad para fertilizar, ya que las muestras seminales con alta proporción de acrosomas alterados o ausentes suelen tener una fertilidad baja. El uso de quercetina en el semen reduce la peroxidación lipídica de los espermatozoides durante la congelación (El-Khawagah et al., 2020) y evita su capacitación prematura antes de la inseminación artificial (Restrepo et al., 2016). Esto se debe a que la presencia y ubicación de las sustituciones de hidroxilo (-OH) y el anillo B de tipo catecol hacen de la quercetina un antioxidante eficaz, ya que posee una actividad captadora de ROS más intensa que la vitamina E (Stojanovic et al., 2001).
Gibb et al. (2013) reportan que la quercetina en una concentración de 150 µM en semen criopreservado de equino, mejoró la motilidad de los espermatozoides al momento de la descongelación, y también incrementó el porcentaje de espermatozoides con el acrosoma intacto, en comparación con los tratamientos con 200 U/mL de catalasa y 0.2 mg/mL de cisteína. Sin embargo, en el estudio realizado por Seifi-Jamadi et al. (2016), al añadir 100 µM de quercetina al medio de criopreservación para semen de equino, obtuvieron un mejor resultado en la motilidad, pero en la vitalidad e integridad de membrana no encontraron un efecto significativo.
Finalmente, en el Cuadro 4 se muestran los resultados de fertilidad (tasa de gestación) en las ovejas inseminadas por laparoscopia, con el semen criopreservado de ovinos adicionado con los diferentes antioxidantes. Contrario a lo esperado, debido a que el tratamiento con quercetina mejoró la protección al acrosoma, no se encontraron diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos (P>0.05). Sin embargo, el tratamiento que mostró mayor resultado porcentual (numéricamente) en comparación a los demás tratamientos en la tasa de gestación fue el tratamiento de quercetina 200 µM con 51.92% de fertilidad diagnosticado a los 35 días de gestación.
Cuadro 4 Efecto de la adición de quercetina y vitamina E en el semen criopreservado de ovino sobre la tasa de gestación en ovejas inseminadas mediante inseminación artificial por laparoscopia
| Tratamiento | Tasa de gestación (%) |
|---|---|
| Control | 23/50 (46.00%) a |
| Q | 27/52 (51.92%) a |
| Vit E | 17/50 (34.00%) a |
| Q + Vit E | 21/49 (42.82%) a |
a Distintas literales indican diferencia estadísticamente significativa (P <0.05); Q = 200 µM de quercetina; Vit E = 100 µM de vitamina E.; Q + Vit E = 200 µM de quercetina +100 µM de vitamina E.
Los daños en las células provocan desestabilización e incluso ruptura de las membranas, y pérdida de componentes intracelulares, por ejemplo, enzimas metabólicas y el ATP, con la consiguiente pérdida de la viabilidad espermática. La membrana juega un papel importante en la viabilidad del espermatozoide y del éxito en la fertilización del ovocito, por lo que es importante que se encuentre intacta al momento del descongelamiento (Martínez-Pastor et al., 2004). El daño de la cromatina por lo general comienza en la región peri-acrosomal, las regiones basales del espermatozoide y posteriormente se expande a otras regiones del núcleo durante la criopreservación (Sousa et al., 2016), afecta considerablemente el estado del acrosoma o incluso la vitalidad del espermatozoide, lo que conlleva a una incapacidad para fertilizar. La baja fertilidad reportada en inseminación artificial cuando se utiliza semen criopreservado podría deberse a los daños ocasionados en los espermatozoides durante el proceso de criopreservación-descongelación (Sousa et al., 2016). Por lo anterior, se ha propuesto la adición de antioxidantes en el semen para prevenir los daños producidos en los espermatozoides y mejorar la fertilidad del semen en la inseminación artificial.
La quercetina es un antioxidante que actúa en la membrana, mitocondrias y acrosoma de los espermatozoides protegiéndolos al momento del descenso de la temperatura durante la criopreservación (Seifi-Jamadi et al., 2016). En un estudio realizado por McNiven & Richardson (2006) determinaron que la inclusión de 50 a 300 µM de quercetina en la criopreservación de semen de equino redujo significativamente el porcentaje de espermatozoides que sufrieron capacitación y reacción acrosomal al momento de la descongelación.
Ardeshirnia et al. (2017) reportan incremento de la fertilidad in vitro del semen de ovino, colectado de epidídimo, y criopreservado con la adición de quercetina en concentraciones de 5 y 10 μg/mL, en comparación con los demás tratamientos (0, 15, 20 y 50 μg/mL). Con estas concentraciones de quercetina, aumentó el número de embriones en la etapa de cigoto, mórula y blastocito. En el estudio realizado por Ahmed et al. (2019), al adicionar quercetina en concentraciones de 150 y 200 µM, en el semen criopreservado de búfalo, la fertilidad in vivo fue mayor (61.82 y 65.22%, respectivamente) comparada con el tratamiento control (sin ningún aditivo; 46.90%). En el presente estudio, el incremento numérico en la tasa de fertilidad observado en el tratamiento adicionado con quercetina, quizá pueda relacionarse con el incremento en la vitalidad y la protección del acrosoma, ya que esta concentración de quercetina mostró una diferencia significativa en los espermatozoides VAI en comparación con los demás tratamientos, lo que indica que la fertilidad del semen criopreservado podría incrementarse mediante la adición de antioxidantes como la quercetina en el diluyente, ya que la calidad del semen post- descongelación es uno de los factores que más influyen en la probabilidad de gestación después de la inseminación (Ahmed et al., 2019). Sin embargo, es necesario realizar más estudios donde se evalúen diferentes concentraciones de quercetina y la evaluación de la fertilidad in vivo se realice con un mayor número de ovejas.
CONCLUSIONES
La adición de 200 µM de quercetina en el semen criopreservado de ovino incrementó el porcentaje de espermatozoides vivos con el acrosoma intacto y vivos con el acrosoma dañado, lo que implica una reducción en el porcentaje de espermatozoides muertos en comparación con los demás tratamientos, lo cual indica que cumplió con sus funciones antioxidantes al proteger a los espermatozoides de los daños provocados por la criopreservación; sin embargo, esto no trajo consigo un incremento en la tasa de gestación. Se recomienda seguir realizando estudios con diferentes concentraciones de quercetina e incrementar los estudios con antioxidantes en pruebas in vivo.
