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INTRODUCCIÓN
Los diluyentes tradicionales que son agregados al semen para la preservación de la viabilidad y fertilidad de los espermatozoides durante la crioconservación incluyen yema de huevo (Lima-Verde et al., 2017); lo anterior, debido a que la yema de huevo protege al espermatozoide de los daños inducidos por la crioconservación durante el enfriamiento, congelación y descongelación al interactuar directamente con la membrana plasmática (Andrabi et al., 2008; Akçay et al., 2012; Sieme et al., 2016). Sin embargo, en los últimos años, frecuentemente se ha opinado en contra del uso de la yema de huevo debido a la gran variabilidad de sus componentes, lo que hace que la evaluación de sus beneficios sea compleja (Kulaksız et al., 2010); además se ha tratado de evitar el uso de diluyentes de origen animal, ya que podrían ser una posible ruta de transmisión de enfermedades (Lima-Verde et al., 2017; Ansari et al., 2017).
En lo que se refiere a la yema de huevo, algunos componentes indeseables (hormonas esteroides y sus moléculas precursoras) se consideran perjudiciales para la integridad del espermatozoide (Akhter et al., 2012; Lima-Verde et al., 2017). El componente principal de la yema de huevo que protege a la membrana espermática es la lipoproteína de baja densidad (LDL). Se ha demostrado que los fosfolípidos o lecitina de la yema de huevo hace a los espermatozoides menos sensibles al enfriamiento (Zeron et al., 2002). De manera particular, en el macho cabrío, existen interacciones negativas entre los fosfolípidos de la yema de huevo y la glándula bulbouretral, esta glándula secreta con el plasma seminal una enzima coagulante de la yema de huevo, la cual cataliza la hidrólisis de la lecitina de la yema de huevo en ácidos grasos y lisolecitina, que son citotóxicos (Ngoma et al., 2016). Por lo anterior, se han utilizado sustitutos de la yema de huevo químicamente definidos sin ser de origen animal (El-Sisy et al., 2018; Gamal et al., 2016), elaborados a base de lecitina de soya y que pueden ser alternativas potenciales para la criopreservación del semen (Akhter et al., 2012).
Se cree que los liposomas actúan de manera similar a las lecitinas de la yema de huevo o la leche (Belala et al., 2016). En el búfalo de agua, no se encontraron diferencias en términos de integridad acrosomal cuando se utilizaron diluyentes a base de yema de huevo, lecitina o liposomas de soya (Kumar et al., 2015; Singh et al., 2013). En este contexto, merecen atención especial los diluyentes elaborados en base a yema de huevo en cuanto a sus componentes y su efecto en comparación con los diluyentes basados en liposomas. Debido a que el efecto de los componentes mencionados anteriormente es poco conocido sobre la calidad del semen crioconservado en el macho cabrío, nos planteamos el objetivo de comparar los efectos de diluyentes a base de lecitina de soya o yema de huevo sobre la calidad del semen, conservado por refrigeración y congelación.
MATERIAL Y MÉTODOS
General
Todos los métodos y manejo de las unidades experimentales utilizadas en este estudio fueron en estricto acuerdo con los lineamientos para el uso ético, cuidado y bienestar de animales en investigación a nivel internacional (FASS, 2010) y nivel nacional (NAM, 2002) con número de referencia de aprobación institucional UAAAN-UL con clave 38111- 425501002-2431.
Localización y animales
El experimento se realizó en el norte de México, en el Centro Caprino de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (26° de Latitud Norte y 104° de Longitud Oeste), durante la época reproductiva (enero). El área de estudio se encuentra a una altitud 1120 msnm, con una precipitación media anual de 230 mm y con temperatura promedio de 24 °C, máxima de 41 °C en mayo y junio, y mínima de -1 °C en diciembre y enero (CONAGUA, 2015). Se utilizaron machos cabríos adultos de la raza Alpino-francés (n = 4, de 1.5 a 2 años de edad), homogéneos en cuanto a peso vivo (PV; 75.0 ± 0.32 kg) y condición corporal (CC; 3.5 ± 0.10 unidades); con fertilidad probada previo al estudio experimental a través de evaluaciones frecuentes de calidad seminal. Durante el periodo experimental, los machos se alimentaron dos veces al día (800 h y 1800 h), a libre acceso con una dieta basada en heno de alfalfa (18% PC, 1.95 Mcal de EM) y 100 g de concentrado comercial (21% PC,1.7 Mcal EM) en base a sus requerimientos nutricionales (NRC, 2007). Los machos tuvieron libre acceso al agua limpia y sales minerales y un periodo de adaptación de 2 semanas previas a la investigación.
Colección y procesamiento del semen
El semen fue colectado por la mañana (800 a 1000 h) cada 3 d, durante tres semanas, se usó como estímulo para la extracción de semen una hembra en actividad estral. El semen fue recolectado con una vagina artificial estándar para ovinos y caprinos, mantenida a una temperatura de 38 °C, por lo que se precalentó a 42 °C previo a la recolección. Se colectaron un total de 24 eyaculados, después de cada extracción el semen fue sumergido inmediatamente en baño maría a 37 °C para su posterior análisis macroscópico y microscópico durante los siguientes 10 minutos.
Preparación de diluyentes y proceso de congelado
De un total de 24 eyaculados (6 eyaculados por macho) y cada eyaculado se dividió en tres alícuotas en partes iguales para ser procesado para la criopreservación, utilizando dos diluyentes comerciales: AndroMed® (Minitübe, Tiefenbach, Alemania; con 1% de lecitina de soya; LS); Optidyl® (CRYO-VET, Francia; con 20% (v/v) de Tris-yema de huevo; TY), y un tercer diluyente a base de citrato-yema de huevo fresco (CY) obtenido de acuerdo a la técnica utilizada por Salamon y Maxwell, (2000).
En el experimento fueron consideradas únicamente muestras con un volumen > 0.5 mL, una concentración de 2.5x109 mL, motilidad masal ≥ 3.0 y viabilidad ≥ 70%. Posteriormente las muestras ya diluidas fueron sometidas a 3 procesos para su evaluación: semen fresco (SF); semen refrigerado (SR, equilibrado a 4 °C por 2 horas); y semen congelado (SC). Después de refrigerar el semen se llenaron las pajillas de 0.25 mL y para el proceso de congelación se colocaron a 7 cm de nitrógeno líquido (NL, - 140°C) por 10 min; después se sumergieron directamente en el NL (-196°C) y se almacenaron hasta su análisis (Jerez et al., 2016). En cada uno de los estados de conservación (SF, SR y SC), el semen se analizó, inmediatamente y cada 15 minutos durante el proceso de conservación, para evaluar la motilidad masal e individual y la viabilidad. En el caso del SC, éste se analizó 24 horas después, para lo cual, la pajilla se descongeló, sumergiéndola en agua atemperada (37º C) durante 30 s.
Variables evaluadas
La motilidad masal (MM; %), se evaluó con el uso de una plataforma precalentada (37°C), colocando una gota de semen puro (20 μl) sobre una lámina portaobjetos en el microscopio óptico con objetivo de 10x, y de acuerdo con el movimiento observado se asignó un puntaje de escala arbitraria de 1 a 5, donde 1 = 25% y 5 = 100% de espermatozoides móviles (Mahsud et al., 2013). La motilidad individual (MI; %), se determinó en base a la proporción de espermatozoides progresivamente móviles, para ello, se colocó una gota (10µL) de semen sobre una lámina portaobjetos y fue cubierta con una laminilla cubreobjetos; posteriormente se observó al microscopio con objetivo de 40x. La viabilidad espermática (VE; %), se evaluó mediante el uso de la técnica de tinción con eosina-nigrosina (Kafi et al., 2004), se observaron al menos 200 espermatozoides por muestra mediante microscopio óptico, utilizando el objetivo de 100X, y se calculó el porcentaje de células vivas (sin teñir) y de células muertas (teñidas de color rosa). Todas las evaluaciones fueron realizadas siempre por el mismo evaluador calificado.
Análisis estadístico
Los datos fueron analizados mediante un ANOVA usando el procedimiento Modelo Lineal General (GLM). Las medias obtenidas de los parámetros seminales fueron comparadas usando una prueba de t. Se contempló el efecto del uso de los diferentes diluyentes, los estados del proceso de crioconservación y la interacción de estos. Todos los datos fueron analizados utilizando el paquete estadístico SAS V9.1 (SAS, 2005). Las diferencias fueron consideradas significativas a un valor de P≤0.05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados de los diferentes parámetros evaluados para determinar la calidad del semen diluido con LS, TY o CY, en semen fresco (SF), refrigerado durante 2 h (SR) y semen congelado (SC) se resumen en el cuadro 1.
Cuadro 1 Medias (±EEM) para la calidad del semen criopreservado de machos cabríos Alpinos- frances diluido con lecitina de soya o yema de huevo
| Parámetros | MM(escala, 1-5) | MI (%) | VE (%) |
|---|---|---|---|
| Semen Fresco | |||
| LS | 4.6±0.2a | 63.0±1.2a | 76.0±2.0a |
| TY | 4.8±0.3a | 62.5±1.4a | 75.0±0.0a |
| CY | 4.8±0.3a | 61.3±4.3a | 71.3±4.0a |
| Semen Refrigerado | |||
| LS | 3.1±1.0a | 44.0±12.0ab | 51.0±13.0bc |
| TY | 4.4±0.1a | 57.5±2.5a | 71.3±2.4a |
| CY | 4.0±0.2a | 55.0±3.5a | 69.0±3.1ab |
| Semen Congelado | |||
| LS | 1.0±0.4c | 11.0±6.4c | 11.0±7.1d |
| TY | 2.4±0.5b | 32.5±8.3b | 41.3±13.0c |
| CY | 0.5±0.3c | 6.3±3.8c | 2.5±2.5d |
Tratamientos: Andromed® (LS; 1% de lecitina de soya), Optidyl® (TY: Tris- 20% de yema de huevo) o citrato- yema de huevo (CY). Motilidad masal (MM; escala,1-5), Motilidad individual (MI; %), Viabilidad espermatica (VE; %). abcd Superíndices desiguales entre filas indican diferencia estadística significativa (P≤0.05).
En el SF, se obtuvieron valores similares entre los grupos (P>0.05) en cada una de las variables evaluadas [MM (4.7 ± 0.26 %), VE (74.1 ± 1.66 %) y MI (62.3 ±4.0 %)]. Los resultados sugieren que la composición de los diluyentes utilizados en este estudio afecta la calidad de los espermatozoides posterior al proceso de descongelamiento. Sin embargo, la calidad seminal post descongelación se vio más afectada cuando se utilizó el diluyente a base LS, en comparación con el TY. Estos resultados son similares a los reportados en equinos y cérvidos; en los cuales se muestra una mayor calidad seminal cuando se utilizan diluyentes a base de yema de huevo (Pillet et al., 2012; Stewart et al., 2018). Es probable que los resultados encontrados se deban a que el componente Tris- yema de huevo ayuda a disminuir la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) manteniendo así el potencial de integridad de la membrana al reducir el choque térmico causado por los cambios de temperatura en el proceso de crioconservación (Alcay et al., 2016; Seifi-Jamadi et al., 2017). Lo anterior puede estar relacionado con el componente efectivo de la yema de huevo que es la lipoproteína de baja densidad (20%), que contiene el TY y funciona como fracción crioprotectora que ayuda a mantener el semen de mejor calidad (Amirat et al., 2004; Forouzanfar et al., 2010; Alcay et al., 2016).
Al comparar los efectos de los diluyentes en las condiciones de SR, no existieron diferencias (P>0.05) en la MM y MI (3.83±0.4 % y 52.1±6.0 %, respectivamente); sin embargo, el porcentaje de VE fue más bajo con el diluyente a base de LS comparado con el TY y CY (51.0±13.0 vs 71.3±3.0 y 69.0±3.1 respectivamente; P<0.05).
Los resultados reportados en el presente experimento referentes al diluyente TY concuerdan con lo reportado por Celeghini et al. (2008), que indican una mayor integridad del acrosoma de espermatozoides de toro, y Konyak et al. (2018) quienes encontraron que después del equilibrio y la congelación del semen de machos cabríos, la motilidad espermática es significativamente mayor al utilizar el diluyente Tris con 20% de yema de huevo, respecto al conformado por 1% de lecitina de soya. Al respecto, se ha comprobado que la lecitina de soya no es capaz de evitar la peroxidación lipídica que ocurre durante el proceso de enfriamiento del espermatozoide (Salmani et al., 2013).
Previas investigaciones en ovinos han demostrado que el semen diluido con lecitina de soya presenta daño en la membrana espermática, y en consecuencia daño a nivel mitocondrial, lo que resulta en una menor movilidad y fertilidad de los espermatozoides (Del Valle et al., 2012 ; Lima-Verde et al., 2017). Konyak et al. (2018) atribuye la baja en la calidad espermática del semen expuesto a la LS a diferencias en la concentración de la lecitina de soya utilizada, en relación a esto, Forouzanfar et al. (2010) observaron en semen de carneros que los diluyentes que contenían concentraciones de 1% de lecitina presentaban mayor viabilidad espermática, comparado con los de 2% de lecitina, y además que el rango 1 a 1.5% de lecitina de soya en el diluyente mostraron mejores características del semen después de la preservación.
En el SC, los valores de MM, MI y VE fueron superiores en el semen diluido con TY (2.4±0.5, 32.5±8.3, 41.3±13.0, respectivamente; P≤0.05) en comparación con el semen diluido con LS y el CY que disminuyeron su MM, MI y VE drásticamente (1.0.0±0.4, 11.0±6.4, 11.0±7.1 y 0.5±0.3±, 6.3± 3.8 y 2.5± 2.5 respectivamente; P≤0.05). De igual forma los resultados en nuestro estudio en el CY post-descongelación fue inferiores en comparación con el TY. Es probable que estos resultados estén asociados a los componentes del diluyente, específicamente al porcentaje de yema de huevo, en el diluyente CY fue a una concentración del 15%, y en el TY al 20%. Estos resultados concuerdan con Fourouzanfar et al. (2010), quienes reportan que la motilidad y viabilidad espermática post-descongelación son superiores cuando se utiliza una concentración de yema de huevo al 20% que cuando se utiliza al 15%. Del mismo modo, otros trabajos confirman que el aumento en la concentración de la yema de huevo mejora la preservación de la calidad espermática (Amirat et al., 2004; Forouzanfar et al., 2010; Alcay et al., 2016). La razón de este mejoramiento puede ser debido a que los fosfolípidos que contiene la yema de huevo como la fosfatidilcolina, son importantes para el mantenimiento de la integridad de la membrana espermática durante el proceso de congelación y post-descongelación (Mousa et al., 2002; Amirat et al., 2004; Forouzanfar et al., 2010; Alcay et al., 2016). Por lo que es probable que un alto porcentaje de yema de huevo mejore la viabilidad espermática observada en el TY, y ésta contribuyera a mantener los niveles de ácidos grasos polinsatrurados necesarios para la membrana de los espermatozoides, siendo menos susceptibles a la peroxidación lipídica destructiva (Cerolini et al., 2001; Kaeoket et al., 2010).
Por otra parte, la mala calidad seminal post-descongelación del CY, pudo deberse a que la yema de huevo tiene alto riesgo de sufrir una contaminación microbiana, lo cual pudo disminuir la calidad seminal, post-descongelación (Aboagla et al., 2004; Kulakzis et al., 2010); y al ser la yema de huevo comercial (CY), pudo no tener una buena calidad sanitaria, lo que perjudicó la calidad seminal post-congelación. Otro factor que pudo afectar la calidad del semen del CY, es la dieta y el manejo de las aves productoras (Lima- Verde et al., 2017). En efecto, varios estudios han mostrado que las yemas de huevo de diferentes especies de aves muestran una variación en sus componentes, lo que resulta en diferentes efectos en el proceso de criopreservación sobre los espermatozoides (Trimeche et al., 1997; Bathgate et al., 2006; Singh et al., 2013). Además, la yema de huevo puede contener metabolitos dañinos y endotoxinas que afectan la viabilidad de los espermatozoides (Vidal et al., 2013), así como hormonas esteroides que reducen la motilidad espermática (El-Sisy et al., 2018). Previos estudios de laboratorio revelan que, mediante eliminación de algunos componentes en la yema de huevo por centrifugación; además de ciertas sustancias en la yema que inhiben la respiración y la motilidad espermática, sugiriendo el reemplazo la yema de huevo entera por la fracción crioprotectora (Amirat et al., 2004).
CONCLUSIONES
Los resultados del presente estudio no mostraron diferencias estadísticas significativas entre el uso de los diferentes diluyentes para la conservación del SF y SR; sin embargo, el Tris-yema de huevo obtuvo una mayor motilidad masal e individual y viabilidad post- descongelación en comparación con el diluyente a base de lecitina de soya durante el proceso de crioconservación del semen de machos cabríos Alpinos
